欒歷歷,劉恩媛,顧 新,孫建新

北京林業(yè)大學林學院, 北京 100083

土壤酶活性能反應土壤生物化學過程中微生物對C、N、P等養(yǎng)分元素的吸收利用。目前在生態(tài)學研究中,C獲取酶通常用β- 1,4-葡萄糖苷酶(β- 1,4-glucosidase,BG)表示,N獲取酶通常用 β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(β-N-acetylglucosaminidase,NAG)和亮氨酸氨基肽酶(leucine aminopeptidase,LAP)表示,P獲取酶通常用酸性(或堿性)磷酸酶(acid or alkaline phosphatase,AP)表示,并用酶活性的比值關系BG∶(NAG + LAP)∶AP 來評價微生物對C、N、P 養(yǎng)分需求狀況,即用生態(tài)酶化學計量來揭示微生物生長和代謝過程的土壤養(yǎng)分資源的有效性[1]。全球尺度上,C、N、P獲取酶活性比約為1∶1∶1的關系,反映了C、N、P循環(huán)的耦合關系[2],在小區(qū)域尺度上,土壤微生物的生長受到養(yǎng)分限制時,C、N、P獲取酶活性比偏離1∶1∶1的關系[3- 5]。盡管目前關于土壤胞外酶活性對土壤養(yǎng)分變異的響應已經(jīng)取得很大進展,但由于土壤養(yǎng)分狀況、土壤質地、氣候條件等眾多因素的影響,不同區(qū)域土壤胞外酶活性對土壤養(yǎng)分變異的適應機制仍然存在爭議[6- 8]。在微生物研究中,通常將微生物對底物所能承受的限度定義為元素比率閾值(threshold elemental ratio,TER)。元素比率閾值是建立在代謝理論和化學計量理論的基礎上,整合了土壤微生物生物量、生態(tài)酶化學計量以及微生物元素利用效率對底物C∶N∶P的適應策略,如果底物C∶X(X為N或P)超過這個閾值,則微生物受養(yǎng)分X限制[9]。

土壤酶活性受凋落物質量和數(shù)量的影響,有研究顯示隨著凋落物處理中針葉的比例降低,土壤過氧化氨酶、多酪氧化酶、脲酶的活性升高,提高幅度大于15%[10];也有研究發(fā)現(xiàn)脲酶、脫氨酶的活性在混合凋落物處理下要顯著高于單一凋落物處理,凋落物的多樣性増加不一定會提高微生物活性,凋落物的化學組成很重要[11];也有研究表明剔除凋落物處理下β- 1,4-葡萄糖苷酶、β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶活性均顯著低于葉調落物加倍處理及混合凋落物加倍處理[12]。全球氣候變化引起的氮沉降通過改變森林生態(tài)系統(tǒng)土壤理化性質而改變微生物的功能狀況,進而影響土壤酶活性[12]。有研究表明氮添加會降低土壤中纖維素酶活性,增加脲酶和蔗糖酶活性[13];也有研究發(fā)現(xiàn)氮添加對β- 1,4-葡萄糖苷酶活性的影響隨著氮添加濃度增加由促進轉為抑制[14]。但目前凋落物輸入和氮添加同時改變是否會通過影響土壤酶活性而影響土壤生態(tài)酶化學計量還不清楚。

因此,本研究基于課題組早先的松櫟混交林實驗樣地,通過不同凋落物處理和氮濃度添加,測定了土壤理化性質、微生物生物量和胞外酶活性,以期探究以下問題：(1)不同凋落物處理和氮添加土壤生態(tài)酶化學計量是否差異顯著以及是否偏離1∶1∶1的關系？(2)不同凋落物處理和氮添加土壤微生物對C、N、P的利用效率和元素比率閾值是否差異顯著？(3)不同凋落物處理和氮添加下土壤生態(tài)酶化學計量主要受生物因子還是非生物因子的影響？以期為土壤微生物對全球變化的響應機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

研究樣地設在山西太岳山生態(tài)定位站靈空山自然保護區(qū)(36°38.736′N,12°06.967′E),平均海拔為1618m,該保護區(qū)屬典型的暖溫帶半干旱大陸性季風氣候,年平均氣溫8.6℃,年均降水量為662mm,年均日照時數(shù)為2650h,土壤類型主要是褐土和棕壤。該保護區(qū)內(nèi)主要優(yōu)勢樹種為：油松(Pinustabuliformis)、遼東櫟(Quercuswutaishanica)、華北落葉松(Larixprincipisrupprechtii)、山楊(Populusdavidiana)和白樺(Betulaplatyphylla),主要山地灌叢為：黃刺玫(Rosaxanthina)、沙棘(Hippophaerhamnoides)、胡枝子(Lespedezabicolor)等。本研究選取的是該地區(qū)典型的油松-遼東櫟混交林[13]。

1.2 實驗設計

實驗樣地于2010年9月布設在靈空山林場油松-遼東櫟針闊混交林,樣地中油松、遼東櫟的數(shù)量比為1∶2,油松的平均胸徑為19.6cm,平均樹高分別為7.3cm,遼東櫟的平均胸徑為18.6cm,平均樹高為9.5cm。在該松櫟混交林內(nèi)建立凋落物和氮添加雙因子交互處理實驗樣地,實驗采用隨機區(qū)組設計,布設了60個2 m×2 m的小樣方,小樣方之間間距0.5m,分為15列,每列4個,每3列劃分為1個區(qū)組,區(qū)組之間相隔1 m,區(qū)組重復數(shù)為5。每個區(qū)組內(nèi),分別設置4種凋落物和3個梯度的氮添加的交互處理。凋落物處理：在每一列中隨機將一個樣方中的所有凋落物移至另一樣方中,形成剔除凋落物(N)和混合凋落物加倍(LB);剩余兩個小樣方進行凋落物葉和枝果組分互換,形成葉凋落物加倍處理(L)和枝果凋落物加倍處理(B)。太岳山地區(qū)氮沉降量約為21.2 kgN hm-2a-1,參照當?shù)乇尘爸岛捅泵繦arvard forest 等的研究方法模擬氮沉降的強度和頻度,氮添加處理設為3個梯度：0 gN m-2a-1(N0),5 gN m-2a-1(N5),10 gN m-2a-1(N10),氮添加施加的氮肥為尿素,每列的施氮率相等,每個區(qū)組內(nèi)各列施氮率完全隨機(圖1)。從2010年到2018年,每年進行凋落物處理和氮添加,每次取樣后按照樣地設計對新輸入的凋落物進行整理(平均3個月一次)和施加氮肥,施氮方法：將氮肥和少量土壤混合后均勻撒于小樣方中[14]。

圖1 實驗設計示意圖Fig.1 Diagram of experimental design實驗樣地于2010年9月布設,60個小樣方(2 m×2 m);B：枝果凋落物加倍Fine woody litter double;L：葉凋落物加倍Leaf litter double;LB：混合凋落物加倍Mixed litter double;N∶剔除凋落物litter removal;N0：0 gN m-2 a-1;N5：5 gN m-2 a-1;N10：10gN m-2 a-1

1.3 土壤樣品采集和測定

分別于2018年6月、8月、10月,在每個小樣方內(nèi)用3cm 內(nèi)徑的土鉆“S”型選取5個點,采集表層土壤0—5cm,并剔除土樣中的石礫、根系等雜物,迅速放入低溫冷藏箱,過2mm篩后,其中一部分于-20 ℃冰箱內(nèi)保存用于測定土壤微生物和酶活性指標,另一部分自然風干,用于分析土壤理化性質。

土壤含水量(SWC)采用鮮土在105 ℃下烘干至恒重(48 h 以上)計算得出;pH用pH計進行測定(土∶水=1∶2.5);土壤有機碳(SOC)的測定采用重鉻酸鉀氧化法;土壤全氮(TN)的測定采用凱式定氮法;土壤全磷(TP)的測定采用鉬銻抗比色法;土壤可溶性碳(DOC)、可溶性總氮(TSN)采用K2SO4浸提法測定;土壤有效磷(SAP)的測定采用NaHCO3浸提—銻抗比色法;土壤微生物生物量碳氮磷(MBC、MBN、MBP)的測定采用氯仿熏蒸—浸提法。以上指標測定參照《土壤農(nóng)化分析方法》[15]。

土壤胞外酶β- 1,4-葡萄糖苷酶(BG)、β- 1,4-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(NAG)、亮氨酸氨基肽酶(LAP)、磷酸酶(AP)均采用底物誘導法測定[16- 17]。BG和NAG的測定：稱取1g過篩2mm的鮮土,放入50mL酶試管內(nèi),加0.25 mL甲苯,4mL 0.05mol/L緩沖液和1mL底物,在黑暗且密閉培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)1h。培養(yǎng)結束后立即放置在冰浴條件下,加1mL 0.5mol/L CaCl2和4mL 0.1mol/L Tris(三羥基氨基甲烷)緩沖溶液(pH調至12),充分混合后用定量濾紙過濾,將濾液用紫外分光光度計在405nm波長進行比色測定,每個土壤樣品均作對照。LAP和AP的測定：與BG和NAG的測定不同之處,培養(yǎng)結束后用0.5mol/L NaOH溶液代替上述的0.1mol/L Tris緩沖溶液。BG測定的底物為0.05mol/L的β- 1,4葡萄糖溶液,NAG測定的底物為0.01mol/L的β- 1,4-N-乙酰葡萄糖溶液,LAP測定的底物為0.01mol/L的L-亮氨酸- 4-硝基苯胺溶液,AP測定的底物為0.05mol/L的對硝基酚溶液,四種酶活性的單位均用nmol·g-1·h-1表示。

1.4 土壤樣品數(shù)據(jù)計算與分析

(1)土壤生態(tài)酶化學計量的計算公式[4]

EEAC∶N=BG/(NAG+ LAP)

(1)

EEAC∶P=BG/AP

(2)

EEAN∶P=(NAG+ LAP)/AP

(3)

式中EEA為土壤胞外酶活性,BG為β- 1,4-葡萄糖苷酶,NAG為β-N-乙酰葡糖氨糖苷酶,LAP為亮氨酸氨基肽酶,AP為酸性磷酸酶。

(2)土壤微生物養(yǎng)分利用效率的計算公式[18]

CUEC∶X=CUEmax(SC∶X/(SC∶X+KX))

(4)

其中SC∶X=(1 /EEAC∶X)(BC∶X/LC∶X)

XUEX∶C=XUEmax(SX∶C/(SX∶C+ Kc))

(5)

其中SX∶C=(1-EEAX∶C)(BX∶C/LC)

式中X為N或P,KX、KC為半飽和常數(shù),KX=0.5,KC=0.5;CUEmax是C能提供微生物生長能量的上限,CUEmax=0.6;XUEmax是N、P能提供微生物生長能量的上限,XUEmax=1.0;BC∶X為微生物生物量C∶N或微生物生物量C∶P;LC∶X為土壤C∶N或者土壤C∶P。SC:X為土壤微生物生物量C∶N或C∶P、胞外酶活性比C∶N或C∶P和土壤C∶N或土壤C∶P的比值，SX∶C為土壤微生物生物量N∶C或P∶C、胞外酶活性比N∶C或P∶C和土壤N∶C或土壤P∶C的比值。

(3)元素比例閾值的計算公式[18]

TERC∶X= (AXBC∶X)/ CUEC∶ X

(6)

其中AX=CUEC∶X/ SC∶X

式中X為N或P,AX為N、P的同化效率。

1.5 數(shù)據(jù)處理方法

采用 SPSS 17.0對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析,用重復測量方差分析(Repeated measures analysis of variance,RMANOVA)上述各個指標在不同取樣時間與凋落物及氮添加之間有無交互作用;用單變量多因素方差分析(Univariate)上述各個指標對凋落物和氮添加及其交互作用的響應;同時,用單因素方差分析(One-way ANOVA)分析上述各個指標在4種凋落物處理和3種氮濃度添加中的差異,采用最小顯著差異(LSD)進行多重比較(P<0.05);用冗余分析(RDA)土壤胞外酶活性和生態(tài)酶化學計量與土壤生物與和非生物因子之間的解釋率;用 SigmaPlot 12.0軟件進行作圖。

2 結果與分析

2.1 不同凋落物處理和氮添加土壤理化性質、微生物生物量及土壤酶活性

通過重復測量方差分析表明不同取樣時間(2018年6月、8月和10月)與凋落物及氮添加之間無交互作用,通過單變量多因素方差分析表明上述測定指標凋落物處理和氮添加之間無交互作用。SWC、SOC、TN、DOC、TSN、SAP、MBC、MBN在不同凋落物處理下差異顯著,不同氮濃度添加下無顯著差異。在不同凋落物處理下,均表現(xiàn)為在葉凋落物加倍和混合凋落物加倍的處理高于枝果凋落物加倍和剔除凋落物處理;TSN在不同氮濃度添加顯著差異,表現(xiàn)為N0、N5處理高于N10處理;pH、TP、MBP在凋落物處理和氮添加下均無顯著差異(表1)。BG、NAG、LAP、AP在不同凋落物處理下差異顯著,不同氮濃度添加下無顯著差異。在不同凋落物處理下,BG、NAG、AP表現(xiàn)為L、LB>B、N,LAP表現(xiàn)為L、LB

表1 不同凋落物和氮添加處理下土壤理化性質和微生物生物量(平均值±標準誤差)

圖2 不同凋落物和氮添加處理下土壤胞外酶活性(平均值±標準誤差)Fig.2 Soil microbial biomass and extracellular enzyme among treatments of litter and nitrogen (Mean±SE)圖中不同小寫字母表示相同施氮量不同凋落物處理間的差異顯著;不同大寫字母表示相同凋落物處理不同氮濃度添加的差異顯著(P<0.05)

2.2 不同凋落物處理和氮添加土壤微生物與生態(tài)酶化學計量特征

不同凋落物處理和氮添加下,土壤微生物生物量碳氮比(MBC∶MBN)、微生物生物量碳磷比(MBC∶MBP)、微生物生物量氮磷比(MBN∶MBP)均無顯著差異(圖3)。

土壤生態(tài)酶化學計量比用lnBG∶ln(NAG+ LAP)∶lnAP 表示,在不同凋落物處理下,lnBG∶ln(NAG+ LAP)、lnBG∶lnAP和ln(NAG+ LAP)∶lnAP均差異顯著,表現(xiàn)為葉凋落物加倍和混合凋落物加倍的處理高于枝果凋落物加倍和剔除凋落物處理;不同氮濃度添加下,土壤生態(tài)酶化學計量均無顯著差異(圖4)。B處理∶lnBG∶ln(NAG+ LAP)∶lnAP為0.96∶0.96∶1;L處理∶lnBG∶ln(NAG+ LAP)∶lnAP為1.02∶0.99∶1;LB處理∶lnBG∶ln(NAG+ LAP)∶lnAP為0.99∶0.99∶1;N處理∶lnBG∶ln(NAG+ LAP)∶lnAP為0.96∶0.95∶1;N0處理∶lnBG∶ln(NAG+ LAP)∶lnAP為0.97∶0.96∶1;N5處理∶lnBG∶ln(NAG+ LAP)∶lnAP為0.99∶0.98∶1;N10處理∶lnBG∶ln(NAG+ LAP)∶lnAP為0.99∶0.98∶1。整體上,溫帶松櫟混交林樣地lnBG∶ln(NAG+ LAP)∶lnAP為0.98∶0.97∶1,其中, lnBG∶ln(NAG+ LAP)為1.01, lnBG∶lnAP為0.98,ln(NAG+ LAP)∶lnAP為0.97。

圖3 不同凋落物和氮添加處理下土壤微生物化學計量(平均值±標準誤差)Fig.3 Stoichiometric of soil microbial biomass among treatments of litter and nitrogen(mean ± SE)圖中不同小寫字母表示相同施氮量不同凋落物處理間的差異顯著;不同大寫字母表示相同凋落物處理不同氮濃度添加的差異顯著(P<0.05);MBC∶MBN∶微生物生物量碳氮比soil microbial biomass C∶N;MBC∶MBP：微生物生物量碳磷比soil microbial biomass C∶P;MBN∶MBP：微生物生物量氮磷比soil microbial biomass N∶P

圖4 不同凋落物和氮添加處理下土壤生態(tài)酶化學計量(平均值±標準誤差)Fig.4 Soil ecoenzymatic stoichiometry among treatments of litter and nitrogen(Mean ± SE)不同小寫字母表示相同施氮量不同凋落物處理間的差異顯著;不同大寫字母表示相同凋落物處理不同氮濃度添加的差異顯著(P<0.05); lnBG∶ln(NAG+ LAP)表示碳氮獲取酶活性比; lnBG∶lnAP表示碳磷獲取酶活性比; ln(NAG+ LAP)∶lnAP表示氮磷獲取酶活性比

2.3 不同凋落物處理和氮添加土壤微生物養(yǎng)分利用效率與元素比率閾值

土壤微生物碳利用效率(CUEC∶N和CUEC∶P)在不同凋落物處理下差異顯著,表現(xiàn)為枝果凋落物加倍和剔除凋落物的樣地高于葉凋落物加倍和混合凋落物加倍的樣地,不同氮濃度添加下無顯著差異;土壤微生物氮利用效率(NUEN∶C)和微生物磷利用效率(PUEP∶C);不同凋落物處理和氮濃度添加下均無顯著差異(表2)。土壤微生物碳氮比率閾值(TERC∶N)在不同凋落物和氮添加處理下均無顯著差異;土壤微生物碳磷比率閾值(TERC∶P)在不同凋落物處理下表現(xiàn)為L、LB > B、N,不同氮濃度添加下差異不顯著(圖5)。土壤CUEC∶N和CUEC∶P分別與TERC∶N和TERC∶P顯著正相關(圖6);土壤NUEN∶C與TERC∶N顯著負相關(圖6);土壤PUEP∶C與TERC∶P顯著負相關(圖6)。

表2 不同凋落物和氮添加處理下土壤微生物養(yǎng)分利用效率(平均值±標準誤差)

圖5 不同凋落物和氮添加處理下元素比率閾值(平均值±標準誤差)Fig.5 Threshold elemental ratio (TERC∶N and TERC∶P) of soil microbial community among treatments of litter and nitrogen (Mean ± SE)不同小寫字母表示相同施氮量不同凋落物處理間的差異顯著;不同大寫字母表示相同凋落物處理不同氮濃度添加的差異顯著(P<0.05);CUE ：微生物碳利用效率Microbial carbon use efficiency;NUE：微生物氮利用效率Microbial nitrogen use efficiency;PUE：微生物磷利用效率Microbial phosphorus use efficiency

圖6 土壤微生物養(yǎng)分利用效率與元素比例閾值Fig.6 Soil microbial nutrient utilization efficiency and threshold element ratios (TER)CUE：微生物碳利用效率microbial carbon use efficiency;NUE：微生物氮利用效率microbial nitrogen use efficiency;PUE：微生物磷利用效率microbial phosphorus use efficiency;

2.4 影響土壤胞外酶活性與生態(tài)酶化學計量的主要因子

相關性分析表明,BG和NAG與pH顯著負相關,與SWC、SOC、TN、DOC、STN、SAP、MBC、MBN顯著正相關;LAP與pH顯著正相關,與SWC、SOC、TN、DOC、STN、MBC、MBN顯著負相關;AP與TP、SAP顯著負相關(P<0.05,圖7)。EEAC∶N與SWC顯著正相關,與土壤C∶N無顯著相關性;EEAC∶P與pH顯著負相關,與土壤C∶P顯著正相關;EEAN∶P與pH呈顯著負相關,與土壤N∶P顯著負相關(P<0.05,圖7)。RDA分析表明,土壤理化性質和微生物生物量共解釋胞外酶活性26.4%的變異,其中土壤pH、TN、SOC是土壤酶活性的顯著影響因子,分別解釋了土壤胞外酶活性14.3%,7.3%,2.2%的變異,土壤pH是土壤酶活性的最大解釋因子(表3)。土壤生物和非生物因子共解釋土壤生態(tài)酶化學計量30.7%的變異,其中土壤pH、C∶P、N∶P是土壤生態(tài)酶化學計量的顯著影響因子,分別解釋了土壤生態(tài)酶化學計量13.1%,5.8%,4.8%的變異,土壤pH是土壤生態(tài)酶化學計量的最大解釋因子(表4)。

圖7 土壤胞外酶活性和生態(tài)酶化學計量的冗余分析Fig.7 Redundancy analysis (RDA) of soil extracellular enzyme activity and ecoenzymatic stoichiometrySWC∶土壤含水率Soil water content;SOC∶土壤有機碳Soil organic carbon;TN∶土壤全氮Total nitrogen;TP：土壤全磷Total phosphorus;DOC∶可溶性碳 Soluble carbon;TSN∶土壤可溶性總氮Total soluble nitrogen;SAP：有效磷Available phosphorus;MBC∶微生物生物量碳Microbial biomass carbon;MBN∶微生物生物量氮Microbial biomass nitrogen;MBP：微生物生物量磷Microbial biomass phosphorus;BG：β- 1,4-葡萄糖苷酶β- 1,4-glucosidase; NAG：β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶β-N-acetylglucosaminidase; LAP：亮氨酸氨基肽酶leucine aminopeptidase; AP：酸性磷酸酶acid phosphatase;EEA：碳氮酶活性比extracellular enzyme

3 討論

3.1 不同凋落物處理和氮添加對土壤理化性質、微生物生物量及土壤酶活性的影響

通常情況下,林地的葉凋落物量大于枝果凋落物量[19],而葉凋落物C∶N、酸不溶殘留物∶氮(AUR∶N)的值顯著低于枝果凋落物,葉凋落物相對枝果凋落物分解較快,土壤中的微生物可利用養(yǎng)分相對較多[12]。本研究中,凋落物處理與氮添加無交互影響。在不同凋落物處理下,土壤SWC、SOC、TN、MBC、MBN差異顯著,均表現(xiàn)為在葉凋落物加倍(L)和混合凋落物加倍(LB)的處理高于枝果凋落物加倍(B)和剔除凋落物處理(N),不同氮濃度添加下無顯著差異,與之前本樣地研究結果一致[12,14];DOC、TSN、SAP表現(xiàn)為L、LB>B、N,有研究指出,添加凋落物可以提高土壤DOC、TSN[20]和SAP的含量[21];本研究中土壤可溶性總氮(TSN)表現(xiàn)為N5處理顯著高于N10,土壤可溶性總氮包括可溶性有機氮和無機氮,本研究和早先課題組研究均發(fā)現(xiàn)本樣地土壤微生物生物量氮隨施氮濃度增加呈先增加后降低的趨勢,早先課題組研究發(fā)現(xiàn)硝態(tài)氮隨施氮濃度的增加先增加后降低,這預示著長期的過量氮添加可能會降低微生物生物量及其活性?？赡墚?shù)砑拥揭欢ǔ潭葧r,土壤微生物受到了其他因素的制約。土壤TP和MBP在凋落物處理及氮添加下均無顯著差異,有研究表明土壤磷主要來自巖石風化,取決于土壤質地[22],土壤MBP的調控機制相對復雜,微生物對P的攝取獨立于C和N的攝取[23]。

有研究指出凋落物輸入和N 添加會影響土壤胞外酶活性[12,24- 26]。本研究中,不同氮濃度添加下,土壤胞外酶活性均無顯著差異。不同凋落物處理下,BG、NAG、AP 表現(xiàn)為有葉凋落物輸入的處理高于枝果凋落物輸入和剔除凋落物處理,而LAP表現(xiàn)為有葉凋落物輸入的處理低于枝果凋落物輸入和剔除凋落物處理(圖2),可能是LAP與BG、NAG、AP負相關關系,LAP與BG、NAG、AP出現(xiàn)解耦現(xiàn)象,造成這種現(xiàn)象的原因可能是LAP和BG、NAG、AP酶活性檢測的基質與標準物不同[2,8]。

3.2 不同凋落物處理和氮添加對土壤微生物與生態(tài)酶化學計量的影響

不同凋落物處理和氮添加下,微生物化學計量均無顯著差異(圖3)。有研究指出,微生物生物量C∶N∶P的可塑性是由微生物群落結構的變化導致的[27- 28],但微生物的數(shù)量、群落組成以及代謝活動的復雜性,使微生物生物量C∶N∶P對底物C∶N∶P的響應仍不明確[29],研究普遍認為由于微生物本身的內(nèi)穩(wěn)態(tài)使微生物生物量C∶N∶P變異性很小[30]。早先本課題組研究發(fā)現(xiàn)細菌：真菌受不同凋落物處理和氮添加影響并不顯著[14]。本研究中,MBC∶MBN、MBN∶MBP和MBC∶MBP的平均值分別為5.7、3.2和17.4,均低于全球土壤平均值[31],本實驗樣地MBC∶MBN比值偏低,可能是葉凋落物加倍和混合凋落物加倍使土壤中有機碳含量相對增加,有利于細菌的生長,顯著提高了細菌總量以及革蘭氏陰性細菌的相對含量[14],MBN∶MBP的偏低可能是微生物生長需要投資更多富含磷的核糖體RNA[32]。

表3 影響土壤胞外酶活性的主要因子

表4 影響土壤生態(tài)酶化學計量的主要因子

土壤生態(tài)酶化學計量可以反映土壤養(yǎng)分資源的有效性和微生物對養(yǎng)分需求的變化[2]。在不同凋落物處理下,lnBG∶ln(NAG+ LAP)、lnBG∶lnAP和 ln(NAG+ LAP)∶lnAP均差異顯著,表現(xiàn)為在葉凋落物輸入的處理高于枝果凋落物加倍和剔除凋落物處理,王冰冰等[33]研究發(fā)現(xiàn)岷江灌叢樣地 lnBG：ln(NAG+ LAP)顯著高于空地[8],說明凋落物的質和量會改變森林土壤的養(yǎng)分狀況,微生物會通過調節(jié)土壤生態(tài)酶化學計量來調控對自身生長的養(yǎng)分利用。本研究中,不同氮濃度添加下,土壤生態(tài)酶化學計量均無顯著差異(圖4),Chen等研究發(fā)現(xiàn)氮添加改變了土壤胞外酶的活性,但并未改變土壤生態(tài)酶化學計量?？赡苌滞寥赖h(huán)受很多因素的影響,氮添加對森林土壤微生物的作用機制并非一個瞬間或簡單的過程。因此,土壤微生物對長期氮添加的調控機制未來仍需繼續(xù)探討。本研究中,B處理：lnBG∶ln(NAG+ LAP)∶lnAP為0.96∶0.96∶1;L處理：lnBG∶ln(NAG+ LAP)∶lnAP為1.02∶0.99∶1;LB處理：lnBG∶ln(NAG+ LAP)∶lnAP為0.99∶0.99∶1;N處理：lnBG∶ln(NAG+ LAP)∶lnAP為0.96∶0.95∶1;N0處理：lnBG∶ln(NAG+ LAP)∶lnAP為0.97∶0.96∶1;N5處理：lnBG∶ln(NAG+ LAP)∶lnAP為0.99∶0.98∶1;N10處理：lnBG∶ln(NAG+ LAP)∶lnAP為0.99∶0.98∶1。說明不同凋落物和氮添加處理下,土壤生態(tài)酶化學計量并未明顯偏離1∶1∶1的關系,說明說明微生物應對外界變化具有較強的“內(nèi)穩(wěn)態(tài)”調節(jié)能力,土壤微生物在自身代謝過程中, 通過調控胞外酶來適應生態(tài)系統(tǒng)中C、N、P的變化[29]。整體上,溫帶松櫟混交林樣地lnBG ∶ln(NAG+ LAP)∶lnAP為0.98∶0.97∶1,其中,lnBG∶ln(NAG+ LAP)為1.01,lnBG∶lnAP為0.98,ln(NAG+ LAP)∶lnAP為0.97。說明本研究區(qū)內(nèi),土壤微生物對P獲取酶的投資相對高于C和N獲取酶的投資,土壤中微生物的生長可能受到相對的P限制,大多數(shù)的研究認為亞熱帶地區(qū)磷是生態(tài)系統(tǒng)生產(chǎn)力的限制因子[6- 7,34- 35]。本研究中,不同凋落物處理,微生物化學計量無顯著差異,而土壤生態(tài)酶化學計量差異顯著,說明在土壤養(yǎng)分條件發(fā)生改變下,土壤生態(tài)酶化學計量比微生物化學計量響應更加敏感,可以更好的反映土壤養(yǎng)分資源的有效性和微生物對養(yǎng)分需求的變化。

3.3 土壤微生物養(yǎng)分利用效率與元素比率閾值

土壤微生物養(yǎng)分利用效率指將底物轉化為自身生物量的效率,與陸地生態(tài)系統(tǒng)養(yǎng)分循環(huán)直接相關[18,27]。不同凋落物處理下,土壤微生物碳利用效率(CUEC∶N和CUEC∶P)差異顯著,表現(xiàn)為枝果凋落物輸入和剔除凋落物的樣地高于有葉凋落物輸入的樣地,有研究指出,CUE與EEAC∶P呈負相關關系[18],本研究中,EEAC∶P∶L、LB > B、N,CUEC∶P∶L、LB < B、N,說明有葉凋落物輸入的樣地相對無葉凋落物輸入的樣地微生物可利用的碳源充足,微生物通過調節(jié)酶活性對養(yǎng)分變異做出反饋來調控土壤生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性。土壤微生物氮利用效率(NUEN∶C)和微生物磷利用效率(PUEP∶C)差異均不顯著,目前關于NUE和PUE的研究較少,有研究指出土壤微生物對于P的吸收是獨立于C、N的,C和N的攝取主要通過氨基酸和氨基糖,P的攝取主要通過細胞膜相關的載體蛋白進行[36]。不同氮濃度添加下,CUEC∶N、CUEC∶P、NUEN∶C和PUEP∶C差異均不顯著,可能由于本實驗的氮濃度添加相對較低或森林土壤氮循環(huán)的復雜性,土壤理化性質、微生物生物量、胞外酶活性以及生態(tài)酶化學計量均無顯著差異,從而對土壤微生物養(yǎng)分利用效率無顯著影響。

在微生物研究中,通常將微生物對底物所能承受的限度定義為元素比率閾值(TER)。元素比率閾值是建立在代謝理論和化學計量理論的基礎上,整合了土壤微生物生物量、生態(tài)酶化學計量以及微生物元素利用效率對底物C∶N∶P的適應策略,如果底物C∶X(X為N或P)超過這個閾值,則微生物受養(yǎng)分X限制[28- 29],低的TERC∶N和TERC∶P表明土壤微生物更易受N和P的限制[37-38]。本研究中,TERC∶N在不同凋落物和氮添加處理下均無顯著差異,說明不同處理下土壤微生物對N的承受限度沒有差異;TERC∶P在不同凋落物處理下表現(xiàn)為有葉凋落物輸入的樣地高于無葉凋落物輸入的樣地(圖5),說明葉凋落物輸入相對提高了土壤微生物對P的承受限度,可相對緩解P的限制,土壤有效磷(SAP)表現(xiàn)為有葉凋落物輸入的樣地高于無葉凋落物輸入的樣地(表1)。

土壤微生物養(yǎng)分利用效率與元素比率閾值的關系可為底物變化微生物的調控機制提供理論依據(jù)[39]。本研究中,土壤CUEC∶N和CUEC∶P分別與TERC∶N和TERC∶P顯著正相關(圖6),說明土壤微生物在自身調節(jié)過程中,通過胞外酶與土壤中C、N、P的利用效率之間的耦合關系對土壤環(huán)境進行正負效應驅動來調節(jié)氣候變化對生態(tài)系統(tǒng)造成的影響[18]。目前,關于土壤微生物氮和磷養(yǎng)分利用效率與元素比率閾值相關性的研究較少。本研究中,NUEN∶C與TERC∶N顯著負相關(圖6),PUEP∶C與TERC∶P顯著負相關(圖6),可能是由于土壤微生物C利用效率與土壤微生物N和P利用效率成負相關關系[18]。

3.4 影響土壤胞外酶活性與生態(tài)酶化學計量的主要因子

土壤胞外酶活性與生態(tài)酶化學計量受資源有效性的調控[5],本研究相關性分析表明,BG和NAG與pH顯著負相關,與SWC、SOC、TN、DOC、STN、SAP、MBC、MBN顯著正相關。而LAP與pH顯著正相關,與SWC、SOC、TN、DOC、STN、MBC、MBN顯著負相關(圖7)。LAP與BG和NAG呈不同的分布特征,可能是檢測方法造成了LAP與BG、NAG解耦合,BG、NAG酶活性檢測的基質是基于MUB的,而LAP檢測的基質則是基于AMC[2,8]。AP與TP、SAP顯著負相關,受資源分配理論的影響,土壤磷酸酶活性通常與土壤有效P含量成反比,當土壤中微生物的生長受到P限制時,土壤微生物將增加對磷酸酶的投資[35]。EEAC∶N與SWC顯著正相關,與土壤C∶N無顯著相關性;EEAC∶P與pH顯著負相關,與土壤C∶P 顯著正相關;EEAN∶P與pH呈顯著負相關,與土壤N∶P 顯著負相關(圖7)。研究發(fā)現(xiàn),不同的生態(tài)系統(tǒng)生態(tài)酶化學計量與土壤化學計量的相關性不同。例如：EEAC∶N與土壤C∶N無顯著相關[34- 35]或顯著負相關[41],EEAC∶P與土壤C∶P顯著正相關[8,41]或負相關[6- 7,35],EEAN∶P與土壤N∶P 顯著正相關[40]或負相關[8,35,41]。說明生態(tài)酶化學計量與土壤化學計量的關系相對復雜,不同的生態(tài)系統(tǒng)生態(tài)酶化學計量對土壤養(yǎng)分的響應機理并不相同。

RDA分析表明,土壤理化性質和微生物生物量共解釋胞外酶活性26.4%的變異,其中土壤pH、TN、SOC是土壤酶活性的顯著影響因子,分別解釋了土壤胞外酶活性14.3%、7.3%、2.2%的變異,土壤pH是影響胞外酶活性的最大解釋因子(表3)。土壤生物和非生物因子共同解釋土壤生態(tài)酶化學計量30.7%的變異,其中土壤pH、C∶P、N∶P是土壤生態(tài)酶化學計量的顯著影響因子,分別解釋了土壤生態(tài)酶化學計量13.1%,5.8%,4.8%的變異,土壤pH是生態(tài)酶化學計量的最大解釋因子(表4)。本研究中,土壤pH是胞外酶活性和生態(tài)酶化學計量最主要的影響因子,原因是土壤pH通過調控土壤微生物生物量和群落組成以及酶與土壤顆粒的結合狀態(tài),從而影響土壤胞外酶活性和生態(tài)酶化學計量[42]。目前不同生態(tài)系統(tǒng)中,影響土壤酶化學計量的主要因子并不一致,例如：Xu等[7]在不同森林生態(tài)系統(tǒng)中研究發(fā)現(xiàn)土壤pH是生態(tài)酶化學計量的主要影響因子;王冰冰等[8]在岷江干旱地區(qū)研究發(fā)現(xiàn)土壤含水率(SWC)是生態(tài)酶化學計量的主要影響因子;喬航等[6]在茶油人工林研究發(fā)現(xiàn)土壤有機碳(SOC)是生態(tài)酶化學計量的主要影響因子。研究發(fā)現(xiàn)土壤的非生物因子比生物因子更能影響土壤胞外酶活性和生態(tài)酶化學計量。研究不足之處,生態(tài)酶化學計量的RDA分析模型中各因子總解釋率并不高,造成這種結果的原因,可能是某些未檢測因子(土壤溫度、團聚體、有機酸等)及其空間自相關間接影響了土壤生態(tài)酶化學計量的變異[6,8]。

4 結論

研究發(fā)現(xiàn)土壤生態(tài)酶化學計量在不同凋落物處理下差異顯著,表現(xiàn)為葉凋落物輸入的樣地高于枝果凋落物輸入和剔除凋落物樣地,在氮添加下土壤生態(tài)酶化學計量無顯著差異,說明凋落物的質和量對森林土壤微生物的影響較氮添加顯著,可能氮添加對森林土壤微生物的作用機制并非一個瞬間或簡單的過程。不同凋落物和氮添加處理下,土壤生態(tài)酶化學計量均未明顯偏離1∶1∶1的關系,說明微生物應對外界變化具有較強的自身調節(jié)作用。土壤微生物碳利用效率(CUE)表現(xiàn)為葉凋落物輸入的樣地低于枝果凋落物輸入和剔除凋落物樣地,TERC∶P表現(xiàn)為葉凋落物加倍和混合凋落物加倍處理高于枝果凋落物加倍和剔除凋落物處理,說明微生物會通過調節(jié)胞外酶和養(yǎng)分利用效率對養(yǎng)分變異做出響應,葉凋落物的輸入相對緩解了P的限制。本研究發(fā)現(xiàn)凋落物處理和氮添加下土壤的非生物因子比生物因子更能影響土壤胞外酶活性和生態(tài)酶化學計量?；谕寥郎鷳B(tài)過程的復雜性,微生物對森林地表凋落物變化以及長期氮添加的調控機制未來仍需繼續(xù)探討。