薛 屹，孫向明，胡 揚(yáng)，劉博男，宋 輝，凌 娜，李文蘭*

(1. 哈爾濱商業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院，哈爾濱 150076；2. 哈爾濱商業(yè)大學(xué) 藥物工程技術(shù)研究中心，哈爾濱 150076)

糖尿病視網(wǎng)膜病變(Diabetic retinopathy，DR)是常見的糖尿病并發(fā)癥之一，發(fā)病取決于糖尿病患者血壓、血脂、血糖水平的控制情況，患病時(shí)間的長短以及糖尿病的類型等，其病變發(fā)展迅速，是糖尿病患者視力受損甚至失明的主要原因[1-3].DR按視網(wǎng)膜微血管逐漸發(fā)生病變情況可廣泛分為非增殖期和增殖期.增殖期新生血管增生，破壞視網(wǎng)膜微血管系統(tǒng)，嚴(yán)重時(shí)伴有黃斑水腫，導(dǎo)致視網(wǎng)膜脫落甚至失明，嚴(yán)重影響患者的健康和生活質(zhì)量.目前DR的病因尚不明確且治療效果有限，因此，DR的機(jī)制及其潛在有效治療方法受到廣泛的研究[4].

駐景丸出自宋代官修方書《太平圣惠方·卷第三十三·治目昏暗方》[5].原方由菟絲子5兩(酒浸3日，曬干，別搗為末)，車前子1兩，熟干地黃3兩組成.其中，菟絲子與熟地黃皆歸于肝、腎經(jīng)，兩者均具有補(bǔ)益肝腎、益精養(yǎng)血的功效.車前子歸肝、腎、肺、小腸經(jīng)，有清熱明目，利尿通淋的功效[6].肝開竅于目，菟絲子、熟地黃補(bǔ)益肝腎精血以滋養(yǎng)雙目.肝腎陰虛，痰濁血瘀，濁邪害清，導(dǎo)致眼生翳障，視物昏花[7].車前子分清濁，利水濕，導(dǎo)濁水下往膀胱，可清肝熱而明目[8].三者配伍可治療糖尿病視網(wǎng)膜病變，但其作用機(jī)制復(fù)雜，涉及神經(jīng)炎癥，氧化應(yīng)激[4]，血管病變[9]等多個(gè)方面.網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一種綜合多學(xué)科理論闡明藥理機(jī)制的新方法，它通過對(duì)有效成分的篩選、靶標(biāo)的預(yù)測(cè)和分子之間的相互作用機(jī)制來進(jìn)行分析，為預(yù)測(cè)藥物治療疾病的潛在靶標(biāo)和通路提供了可靠的研究背景[10].本文擬采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究方法預(yù)測(cè)駐景丸治療DR的潛在靶標(biāo)及其可能的作用機(jī)制，為今后藥理研究或藥物研發(fā)提供新思路和參考.

1 材料與方法

1.1 駐景丸成分收集與篩選

以駐景丸全方中“菟絲子”、“車前子”、“熟地黃”為關(guān)鍵詞在傳統(tǒng)中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(tái)TCMSP中查找所含所有成分.根據(jù)TCMSP平臺(tái)推薦的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)(Oral bioavailability，OB)≥30%，類藥性(Drug-like index，DL)≥0.18 為限定條件進(jìn)行篩選，同時(shí)結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道，核查合并后得到駐景丸候選活性成分.

1.2 駐景丸活性成分的靶標(biāo)預(yù)測(cè)

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫和SymMap數(shù)據(jù)庫檢索駐景丸中所篩選的活性成分的相關(guān)靶標(biāo)，并通過 Uniprot 數(shù)據(jù)庫將所得到的蛋白靶標(biāo)轉(zhuǎn)換成基因靶標(biāo)，得到駐景丸活性成分的靶標(biāo).

1.3 糖尿病視網(wǎng)膜病變的靶標(biāo)預(yù)測(cè)

設(shè)置關(guān)鍵詞 “Diabetic retinopathy”，利用Disgene數(shù)據(jù)庫、OMIM數(shù)據(jù)庫以及GeneCards數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索、合并、去重后得到DR的潛在靶標(biāo).將駐景丸活性成分的靶標(biāo)和DR的潛在靶標(biāo)導(dǎo)入Venny2.1.0中，比對(duì)得到二者的交集靶標(biāo)，即為駐景丸治療DR的關(guān)鍵靶標(biāo).

1.4 駐景丸活性成分-關(guān)鍵靶標(biāo)-DR網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將駐景丸的活性成分和駐景丸治療DR的關(guān)鍵靶標(biāo)導(dǎo)入軟件Cytoscape，以構(gòu)建活性成分-關(guān)鍵靶標(biāo)-DR的網(wǎng)絡(luò)圖，其中構(gòu)建的網(wǎng)絡(luò)圖中“節(jié)點(diǎn)”(node)表示駐景丸中藥成分、中藥所含活性化合物、DR及作用靶標(biāo)，“邊”(edge)表示中藥與活性成分、中藥與疾病，疾病與靶標(biāo)、活性成分與靶標(biāo)間的關(guān)系.

1.5 構(gòu)建蛋白質(zhì)互作(PPI)網(wǎng)絡(luò)

將駐景丸治療DR的靶標(biāo)上傳至在線STRING 11.0數(shù)據(jù)庫，選擇物種為“Homo sapiens”,設(shè)置最低要求互動(dòng)分?jǐn)?shù)為0.700，隱藏游離點(diǎn)，獲取相應(yīng)的蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系，所得文件保存為TSV 格式.利用COUNTIF 函數(shù)計(jì)算相應(yīng)靶標(biāo)的Count值，所得文件保存為TXT格式.將TSV和TXT文件導(dǎo)入至 Cytoscape 3.6.1 軟件，根據(jù)Count值調(diào)節(jié)節(jié)點(diǎn)的大小、顏色，以更直觀地呈現(xiàn)出主要作用靶標(biāo)，以及各靶標(biāo)之間的相互作用關(guān)系.

1.6 GO生物學(xué)過程富集分析和KEGG通路富集分析

將駐景丸治療DR的關(guān)鍵靶標(biāo)導(dǎo)Metascap數(shù)據(jù)庫，選擇物種為 “H.sapiens”進(jìn)行custom analysis，設(shè)定閾值P<0.01，最小重疊度(Min Overlap)為3，最小富集程度(Min Enrichment)為1.5，進(jìn)行GO生物學(xué)過程(GO Biological Processes)富集分析和KEGG通路(KEGG Pathway)富集分析.將排名前20的GO生物學(xué)過程富集分析結(jié)果導(dǎo)入QuickGO數(shù)據(jù)庫進(jìn)行層級(jí)關(guān)系分析.分析平臺(tái)及數(shù)據(jù)庫見表1.

表1 數(shù)據(jù)庫及分析平臺(tái)

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 駐景丸活性成分篩選及活性成分靶標(biāo)預(yù)測(cè)

經(jīng)檢索共獲得菟絲子主要化學(xué)成分 147個(gè)、車前子176 個(gè)、熟地黃76個(gè).設(shè)置ADME參數(shù)篩選后獲得菟絲子主要活性成分11個(gè)、車前子9個(gè)、熟地黃成分2個(gè).經(jīng)文獻(xiàn)報(bào)道獲得相關(guān)成分11個(gè).匯總后保留成分唯一值共獲得活性成分31個(gè)，篩去無對(duì)應(yīng)靶標(biāo)成分6個(gè)，最終獲得駐景丸活性成分25個(gè)，見表2.

表2 駐景丸主要活性成分基本信息

2.2 DR靶標(biāo)的預(yù)測(cè)及駐景丸治療DR的關(guān)鍵靶標(biāo)的預(yù)測(cè)

通過Disgenet數(shù)據(jù)庫、 Genecards數(shù)據(jù)庫和OMIM數(shù)據(jù)庫共收集與DR相關(guān)靶標(biāo)2 889個(gè).將其與駐景丸活性成分對(duì)應(yīng)的228個(gè)靶標(biāo)作對(duì)比，獲得共同靶標(biāo)133個(gè)，即駐景丸治療DR的關(guān)鍵作用靶標(biāo)，見圖 1.

圖1 駐景丸治療糖尿病視網(wǎng)膜病變關(guān)鍵靶標(biāo)的篩選

2.3 駐景丸活性成分-關(guān)鍵靶標(biāo)-DR網(wǎng)絡(luò)的分析

利用Cytoscape軟件構(gòu)建駐景丸活性成分-關(guān)鍵靶標(biāo)-DR網(wǎng)絡(luò)圖，見圖2.此網(wǎng)絡(luò)共包括162個(gè)節(jié)點(diǎn)(1個(gè)疾病，3個(gè)中藥，25個(gè)化合物成分，133個(gè)關(guān)鍵靶標(biāo))、432條邊(28條中藥和化合物成分相互作用；268條化合物成分和潛在靶標(biāo)相互作用；133條疾病和潛在靶標(biāo)相互作用；3條疾病與中藥相互作用).其中長方形節(jié)點(diǎn)分別代表駐景丸中藥成分菟絲子、車前子、熟地黃；“V”字形節(jié)點(diǎn)代表DR；橢圓節(jié)點(diǎn)代表駐景丸活性成分；菱形節(jié)點(diǎn)代表駐景丸治療DR的關(guān)鍵靶標(biāo)；線條代表相互作用關(guān)系.而圖中駐景丸每個(gè)活性成分平均可作用于10.72(268/25)個(gè)靶標(biāo)，每個(gè)靶標(biāo)平均連接2.02(268/133)個(gè)化合物成分.其中，菟絲子和車前子都含有化合物槲皮素(quercetin)，對(duì)應(yīng)關(guān)鍵靶標(biāo)94個(gè)；車前子和熟地黃都含有谷甾醇(sitosterol)，對(duì)應(yīng)關(guān)鍵靶標(biāo)10個(gè).車前子中熊果酸(ursolic acid)對(duì)應(yīng)關(guān)鍵靶標(biāo)45個(gè)；菟絲子中山萘酚(kaempferol)對(duì)應(yīng)關(guān)鍵靶標(biāo) 29個(gè)；異鼠李素(isorhamnetin)對(duì)應(yīng)關(guān)鍵靶標(biāo)12個(gè).DL 值最高的為芝麻素(sesamin DL=0.83)對(duì)應(yīng)關(guān)鍵靶標(biāo)16個(gè).充分體現(xiàn)駐景丸治療DR具有多成分、多靶標(biāo)的特點(diǎn).

圖2 駐景丸活性成分-關(guān)鍵靶標(biāo)-DR的網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)

將獲得的133個(gè)駐景丸治療DR的關(guān)鍵靶標(biāo)上傳至STRING 11.0 數(shù)據(jù)庫，獲取相應(yīng)的蛋白相互作用信息.根據(jù)COUNTIF函數(shù)計(jì)算count值，將利用STRING數(shù)據(jù)庫所得的靶標(biāo)相互作用關(guān)系導(dǎo)入 Cytoscape軟件，制作關(guān)鍵靶標(biāo)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖，使其可視化，最終篩選獲得關(guān)鍵靶標(biāo)蛋白(圓形節(jié)點(diǎn))127個(gè)，節(jié)點(diǎn)的面積越大，代表其count值越大；邊1146條，代表靶標(biāo)之間的相互關(guān)聯(lián)，見圖 3.并篩選列舉駐景丸治療DR排名前30 的關(guān)鍵靶標(biāo)，見表3.根據(jù)count值分析，可認(rèn)為絲氨酸/蘇氨酸-蛋白激酶(Akt1)、白細(xì)胞介素6(IL6)、細(xì)胞腫瘤抗原P53(TP53)、血管內(nèi)皮生長因子A(VEGFA)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)、絲裂原活化蛋白激酶8(MAPK8)、腫瘤壞死因子(TNF)、絲裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)、轉(zhuǎn)錄因子AP-1(JUN)、表皮生長因子(EGF)這10個(gè)靶標(biāo)與駐景丸治療糖尿病視網(wǎng)膜病變相關(guān)性最大，推測(cè)這10個(gè)靶標(biāo)為治療DR的核心靶標(biāo).

表3 駐景丸治療DR的PPI網(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵靶標(biāo)(排名前 30)

圖3 駐景丸治療DR的蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)

2.5 駐景丸治療DR基因GO生物學(xué)過程分析及KEGG通路富集分析

將駐景丸治療DR的關(guān)鍵靶標(biāo)輸入Metascape數(shù)據(jù)庫進(jìn)行GO生物學(xué)過程富集分析和KEGG通路富集分析.GO富集分析(P<0.01)排行前20，見圖4，結(jié)果表明駐景丸可能通過對(duì)無機(jī)物的反應(yīng)、脂多糖的反應(yīng)、細(xì)胞因子介導(dǎo)的信號(hào)通路、對(duì)有毒物質(zhì)的反應(yīng)、凋亡信號(hào)通路、對(duì)細(xì)胞外刺激的反應(yīng)、細(xì)胞對(duì)有機(jī)氮化合物的反應(yīng)、對(duì)傷害的反應(yīng)、活性氧物質(zhì)代謝過程、細(xì)胞增殖或遷移等生物學(xué)過程發(fā)揮藥效.通過對(duì)排名前20的GO生物學(xué)過程進(jìn)行層級(jí)關(guān)系分析，見圖5，發(fā)現(xiàn)其主要與刺激反應(yīng)(response to stimulus)、信號(hào)通路(signaling)、生物免疫調(diào)節(jié)(biological regulation)、細(xì)胞過程(cellular process)、代謝過程(metabolic process)相關(guān).根據(jù)KEGG 通路富集分析(P<0.01) 排行前20，見圖6，結(jié)果表明：駐景丸可能通過調(diào)控糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號(hào)通路(見圖7)、 癌癥信號(hào)通路、腫瘤壞死因子信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路、EGFR酪氨酸激酶抑制劑抗性、阿米巴病、丙型肝炎、NF-κB信號(hào)通路、肌萎縮性側(cè)索硬化、胰島素抵抗等通路來治療DR.

圖4 駐景丸治療DR的關(guān)鍵靶標(biāo)GO分析(排名前20)

圖5 GO生物學(xué)過程層級(jí)關(guān)系圖

圖6 駐景丸治療DR的關(guān)鍵靶標(biāo)KEGG分析(排名前20)

圖7 糖尿病并發(fā)癥AGE-RAGE信號(hào)通路圖

3 討 論

駐景丸是治療眼科疾病的經(jīng)典古方，現(xiàn)代臨床常采用加減駐景丸治療青少年近視[11]、眼底黃斑疾病[12]、糖尿病視網(wǎng)膜病變[13]等疾病.方中菟絲子，熟地黃均可滋補(bǔ)肝腎，車前子清肝明目，三者配伍使目得肝血能視，腎精上注目明.本研究通過 TCMSP、SymMap、Disgenet、GeneCards和OMIM數(shù)據(jù)庫分析了駐景丸3味中藥(菟絲子、車前子、熟地黃)治療DR的主要活性成分，其中槲皮素具有心臟保護(hù)、抗炎、抗過敏、抗病毒、抗腫瘤、抗高血壓等作用[14]，Hatice Iskender[15]等人發(fā)現(xiàn)其在降低血糖水平方面也發(fā)揮一定作用.Castro AJ[16]等人研究發(fā)現(xiàn)熊果酸可增加胰島素分泌，具有較強(qiáng)的抗高血糖作用.異鼠李素是槲皮素的衍生物，在不同疾病中發(fā)揮抗氧化和抗炎作用，Jamali-Raeufy N[17]等人研究發(fā)現(xiàn)異鼠李素可降低鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病大鼠血糖水平，抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞活化和乙酰膽堿酯酶活性，減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)和炎癥反應(yīng)，對(duì)大腦中與糖尿病引起的變化有潛在的神經(jīng)保護(hù)作用.此外，芝麻素在抗高血壓、降低膽固醇、降血糖方面也顯示出一定的藥理活性[18].

葡萄糖、乳糖等還原糖可以與蛋白質(zhì)的氨基發(fā)生非酶促反應(yīng)，形成不穩(wěn)定的schiff堿，然后形成Amadori產(chǎn)物.這些早期糖基化產(chǎn)物會(huì)進(jìn)一步發(fā)生重排，脫水和縮合等復(fù)雜反應(yīng)，產(chǎn)生 “高級(jí)糖化終產(chǎn)物”(AGEs).在衰老或者某些病理?xiàng)l件下，例如糖尿病患者，各種組織中會(huì)形成和積累大量的AGEs[19-21].有研究表明RAGE是AGEs的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)受體，并且AGEs與RAGE會(huì)相互作用會(huì)激活NADPH氧化酶、蛋白激酶C和絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)等多種細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路，進(jìn)一步激活NF-κB活性，促進(jìn)IL-1、IL-6、TNF-α等促炎細(xì)胞因子的表達(dá)，引起血管炎癥并刺激腫瘤生長[22].在DR的早期階段，視網(wǎng)膜脫離的表征是微動(dòng)脈瘤、血管通透性增強(qiáng)、視網(wǎng)膜增厚和硬滲出物的形成等，這些因素會(huì)導(dǎo)致黃斑受到影響，從而使視力下降.隨著時(shí)間的推移，視網(wǎng)膜缺血使Bcl-2和Bax表達(dá)非常明顯，從而上調(diào)VEGF的表達(dá)[23].VEGF過量產(chǎn)生，會(huì)激活A(yù)GE-RAGE信號(hào)通路[24-25]，AGEs可影響誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)的表達(dá)，在糖尿病并發(fā)癥中顯示出明顯的神經(jīng)毒性和損傷作用[26-27]，進(jìn)一步破壞血管-視網(wǎng)膜屏障，進(jìn)而產(chǎn)生新血管，導(dǎo)致玻璃體出血、纖維化、牽拉性視網(wǎng)膜脫離甚至失明[28].

近年來，2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus，T2DM)發(fā)病率顯著上升，眾多并發(fā)癥都與T2DM有關(guān)，包括失明，腎衰竭和心臟功能障礙等.T2DM是以胰島素抵抗(IR)、高血糖和高血脂癥為特征的一種綜合性代謝障礙.胰島素受體(INSR)/磷酸肌醇3-激酶(PI3K)/ 蛋白激酶B(AKT)信號(hào)通路是一條經(jīng)典的與葡萄糖攝取相關(guān)的主要途徑[29].正常情況下，胰島素可抑制Akt的磷酸化，但過多卡能量的攝入會(huì)導(dǎo)致游離脂肪酸積累和脂肪細(xì)胞增大，巨噬細(xì)胞化學(xué)吸引劑分泌增加，導(dǎo)致巨噬細(xì)胞浸潤到增大的脂肪細(xì)胞中[30]，并激活有絲分裂原活化蛋白激酶(MAPK)和PI3K炎癥信號(hào)通路，進(jìn)一步激活NADPH，促進(jìn)caspase-3的激活，導(dǎo)致IL6和TNFα分泌增加[29].TNFα是一種促炎性細(xì)胞因子，它在包括肥胖癥和胰島素抵抗在內(nèi)的各種代謝綜合征的發(fā)作中起著至關(guān)重要的作用.TNFα分泌增加會(huì)導(dǎo)致慢性炎癥狀態(tài)，這可能會(huì)損傷胰島素信號(hào)通路，加重胰島素抵抗[31].同時(shí)在脂肪細(xì)胞促炎條件下，TNF-α的升高水平也會(huì)通過激活幾種Ser / Thr激酶(如：IKKβ，JNK，PKCθ，p38 MAPK等)來損害胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而導(dǎo)致血糖升高[32-33].

綜上所述，本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法研究駐景丸治療DR的機(jī)制，將所得到的133個(gè)關(guān)鍵靶標(biāo)通過GO生物學(xué)過程富集分析和KEGG富集分析，得到多條與DR密切相關(guān)的通路，如：AGE-RAGE信號(hào)通路、 癌癥信號(hào)通路、腫瘤壞死因子信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路、EGFR酪氨酸激酶抑制劑抗性、NF-κB信號(hào)通路、胰島素抵抗等.結(jié)合GO分析，這些通路主要與刺激反應(yīng)、信號(hào)通路、細(xì)胞過程、代謝過程、生物免疫調(diào)節(jié)等生物學(xué)過程相關(guān).本研究充分體現(xiàn)駐景丸治療DR具有多成分、多靶標(biāo)、多途徑協(xié)同發(fā)揮藥效的特點(diǎn)，為后續(xù)對(duì)駐景丸治療DR的研究提供參考依據(jù)和新思路.該預(yù)測(cè)結(jié)果與現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果高度符合，但由于現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫并不完整，駐景丸仍有 5個(gè)化學(xué)式未找到相應(yīng)靶標(biāo).無法確定駐景丸配伍后潛在活性成分含量、種類及藥代動(dòng)力學(xué)是否發(fā)生變化.所以網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)當(dāng)前僅為理論上的預(yù)測(cè)，藥物的相關(guān)機(jī)制還需要進(jìn)一步進(jìn)行科學(xué)驗(yàn)證.