徐昊

(武漢市第四醫(yī)院，武漢 430000)

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(postmenopausal osteoporosis，PMOP)是臨床常見的一種女性年齡相關(guān)的系統(tǒng)性骨骼退行性疾病，早期無明顯癥狀，隨病情發(fā)展可表現(xiàn)為骨痛、駝背、局部壓痛等癥狀，是引起老年女性骨折最常見的原因，發(fā)病率可達10%～20%[1-2]。既往研究認為，PMOP主要由于雌激素缺乏引起[3]；然而近年來研究顯示[4]，氧化應激是PMOP的重要發(fā)病機制，活性氧(reactive oxygen species，ROS)增加可以誘導成骨細胞(osteoblast，OB)的氧化應激損傷，影響骨重建，降低骨密度，增加骨折的風險。OB是骨形成的主要功能細胞，來源于骨、骨膜、骨髓及骨外組織，可以合成并分泌多種生物活性物質(zhì)，參與調(diào)節(jié)骨的形成和重建[5]。研究顯示，隨著絕經(jīng)期婦女年齡的增加，機體的抗氧化系統(tǒng)功能也會降低，導致細胞內(nèi)的ROS累積，可損傷成骨細胞功能，影響骨的形成[6]。雌激素是生物體重要的內(nèi)源性激素，可以調(diào)節(jié)成骨細胞和破骨細胞間的平衡，對于骨的形成和骨量維持具有重要作用[7]。近年來研究顯示，雌激素可以通過弱化活性氧作用，增加抗氧化酶的表達，調(diào)節(jié)破骨細胞和成骨細胞的活性，維持骨吸收和轉(zhuǎn)換的平衡，但其具體的作用和機制尚不清楚[8-9]。因此，本研究探討了雌激素對小鼠成骨細胞MC3T3-E1氧化應激損傷的保護作用，并進一步闡明了其對MC3T3-E1細胞分化能力的影響及機制，旨在為雌激素在PMOP治療中的應用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞

MC3T3-E1細胞由中國科學院上海生命科學研究院提供。

1.1.2 主要試劑與儀器

β-雌二醇(批號190409)購自上海廣銳生物科技有限公司；α-MEM培養(yǎng)基(批號190615)、10%胎牛血清(批號190407)、CCK-8檢測試劑盒(批號190712)購自上海經(jīng)科化學科技有限公司；Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒(批號190916)和ROS熒光探針購自北京綠源伯德生物科技有限公司；JC-1熒光探針購自 Molecular Probes公司；丙二醛(malondialdehyde，MDA)(批號190410)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)(批號 190326)購自南京建成生物科技有限公司；兔抗鼠Smad5、Runx2、Bax、Bcl-2、cleaved Caspase-3、β-actin 單克隆抗體和辣根過氧化酶(horseradish peroxidase，HRP)標記羊抗兔IgG均購于美國CST公司。

流式細胞儀(FACScan)購自美國FranklinLakes公司；多功能酶標檢測儀(iMark680)購自Bio-Rad公司；熒光顯微鏡(ix71)購自日本Olympus公司。

1.2 方法

1.2.1 MC3T3-E1細胞氧化應激損傷模型的建立

將MC3T3-E1細胞培養(yǎng)于質(zhì)量分數(shù)為10%熱滅活胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)液，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中貼壁培養(yǎng)，每周換2次培養(yǎng)液。將貼壁培養(yǎng)至對數(shù)生長期的細胞分為空白對照組、H2O2組(300 μmol/L)、H2O2+ 雌激素 0.1 μmol/L 組、H2O2+ 雌激素 1 μmol/L組、H2O2+ 雌激素10 μmol/L 組和H2O2+NAC 1 mmol/L組。除空白對照組加入α-MEM培養(yǎng)液外，其他各組細胞均加入含H2O2(終濃度為300 μmol/L)的培養(yǎng)液孵育3 h，誘導氧化應激損傷。處理后，采用無血清培養(yǎng)液洗2遍，除空白對照組和H2O2組加入α-MEM培養(yǎng)液外，其他各組細胞均加入含相應濃度藥物的培養(yǎng)液繼續(xù)孵育，培養(yǎng)24 h過夜，用于檢測細胞的生物學特征。

1.2.2 CCK-8實驗檢測細胞的增殖

取貼壁培養(yǎng)24 h至對數(shù)生長期的細胞，胰酶消化后制成單細胞懸液，以3×10-4mL密度接種至96孔板，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中貼壁培養(yǎng)24 h后，分組與相應藥物孵育，分別于24、48、72 h的細胞，棄培養(yǎng)液，每孔分別加入10 μL CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，采用酶標儀檢測570 nm波長的吸光度值。

1.2.3 試劑盒檢測細胞的MDA和SOD水平

取各組與相應濃度藥物孵育24 h的細胞，吸去培養(yǎng)基，PBS洗3次后采用IP細胞裂解工作液裂解細胞，離心(10 000 rpm，10 min)，取上清，硫代巴比妥酸法檢測MDA；黃嘌呤氧化酶法檢測SOD水平。

1.2.4 熒光探針法檢測細胞的ROS水平

用無血清的α-MEM培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA(終濃度為10 μmol/L)，裝載探針。取各組與相應濃度藥物孵育24 h的細胞，吸去培養(yǎng)基，加入DCFH-DA培養(yǎng)基重懸細胞，孵育20 min后，采用無血清細胞培養(yǎng)液洗去未進入細胞內(nèi)的DCFH-DA，熒光酶標儀檢測ROS水平。

1.2.5 流式細胞儀檢測細胞的凋亡

取各組與相應濃度藥物孵育24 h的細胞，離心(1000 rpm，5 min)，棄上清，依次加入 5 μL 的AnnexinV-FITC和propidium iodide進行染色，室溫避光孵育30 min，經(jīng)70目的細胞篩過濾后，采用流式細胞儀分析細胞凋亡率。

1.2.6 流式細胞儀檢測細胞線粒體膜電位

取各組與相應濃度藥物孵育24 h的細胞，2.5%胰酶消化，離心(1000 rpm，10 min)，加入1 mmol/L的 JC-1染色工作溶液 1 mL，37℃孵育30 min，JC-1緩沖液洗3次后，倒置熒光顯微鏡下分析熒光強度，流式細胞儀分析JC-1陽性率。

1.2.7 Western Blot檢測細胞分化和凋亡相關(guān)蛋白表達

取各組與相應濃度藥物孵育24 h的細胞，細胞裂解液提取總蛋白后經(jīng)BCA法進行蛋白定量，SDSPAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，室溫封閉2 h，加入一抗(Smad5、Runx2、Bcl-2、Bax 和 Cleaved Caspase-3，稀釋比例均為1∶1000)4℃孵育過夜，以β-actin作為內(nèi)參，洗膜加 HRP標記的二抗(稀釋比例為1∶5000)室溫孵育2 h，電化學發(fā)光顯影，分析對比條帶強弱。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 22.0軟件對所得數(shù)據(jù)進行分析，滿足正態(tài)分布計量資料均以平均值±標準差()表示，采用單因素方差分析比較組間差異性，若組間比較有差異，采用SNK-q比較兩組間差異性，以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 雌激素對MC3T3-E1細胞增殖的影響

表1結(jié)果顯示，與空白對照組比較，H2O2組細胞在不同時間點的增殖活性明顯下降(P＜0.05)；與H2O2組比較，H2O2+雌激素1 μmol/L組、H2O2+雌激素10 μmol/L組和H2O2+NAC 1 mmol/L組細胞在不同時間點的增殖活性明顯升高(P＜0.05)。

2.2 雌激素對MC3T3-E1細胞凋亡水平的影響

流式細胞儀檢測結(jié)果顯示(圖1)，與空白對照組比較，H2O2組細胞的凋亡率明顯升高[(11.74±2.18)vs(4.85 ± 0.53)，P＜ 0.05]；與 H2O2組比較，H2O2+雌激素 1 μmol/L組、H2O2+雌激素 10 μmol/L組和H2O2+NAC 1 mmol/L組細胞的凋亡率明顯下降[(8.86±0.95)、(6.71±0.72)、(6.53± 0.65)vs(11.74 ± 2.18)，P＜ 0.05]。

2.3 雌激素對MC3T3-E1細胞線粒體膜電位的影響

流式細胞儀檢測結(jié)果顯示(圖2)，與空白對照組比較，H2O2組細胞的JC-1陽性細胞率明顯增加[(9.70±1.53)vs(3.85±0.42)，P＜ 0.05]；與 H2O2組比較，H2O2+雌激素1 μmol/L組、H2O2+雌激素10μmol/L組和H2O2+NAC 1 mmol/L組JC-1陽性細胞率明顯下降[(7.82±0.93)、(5.61±0.65)、(5.54±0.62)vs(9.70±1.53)，P＜ 0.05]。

2.4 雌激素對MC3T3-E1細胞氧化應激水平的影響

表2結(jié)果顯示，與空白對照組比較，H2O2組MDA和ROS水平明顯升高(P＜0.05)，SOD活性明顯下降(P＜0.05)；與H2O2組比較，H2O2+雌激素1 μmol/L 組、H2O2+ 雌激素 10 μmol/L 組和 H2O2+NAC 1 mmol/L組 MDA和 ROS水平明顯下降(P＜0.05)，SOD活性明顯升高(P＜0.05)。

2.5 雌激素對 MC3T3-E1細胞 Smad5、Runx2、Bcl-2、Bax和cleaved Caspase-3表達的影響

圖3、表3結(jié)果顯示，與空白對照組比較，H2O2組細胞Smad5、Runx2和Bcl-2蛋白表達明顯下降(P＜0.05)，Bax和cleaved Caspase-3蛋白表達明顯升高(P＜0.05)；與 H2O2組比較，H2O2+雌激素1 μmol/L組、H2O2+ 雌激素 10 μmol/L 組和 H2O2+NAC 1 mmol/L組細胞 Smad5、Runx2和 Bcl-2蛋白表達明顯升高(P＜0.05)，Bax和cleaved Caspase-3蛋白表達明顯下降(P＜0.05)。

表1 雌激素對MC3T3-E1細胞增殖的影響(n＝6，)Table 1 Effect of estrogen on proliferation of MC3T3-E1 cells(n＝6，)

表1 雌激素對MC3T3-E1細胞增殖的影響(n＝6，)Table 1 Effect of estrogen on proliferation of MC3T3-E1 cells(n＝6，)

注：與空白對照組相比，?P＜0.05；與H2O2組相比，#P＜0.05。(下表同)Note.Compared with blank control group，?P＜0.05.Compared with H2O2group，#P＜0.05.(The same in the following tables)

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圖1 雌激素對MC3T3-E1細胞凋亡水平的影響Figure 1 Effect of estrogen on apoptosis of MC3T3-E1 cells

圖2 雌激素對MC3T3-E1細胞線粒體膜電位的影響Figure 2 Effect of estrogen on mitochondrial membrane potential of MC3T3-E1 cells

表2 雌激素對MC3T3-E1細胞氧化應激水平的影響(n＝6，)Table 2 Effects of estrogen on oxidative stress in MC3T3-E1 cells(n＝6，)

表2 雌激素對MC3T3-E1細胞氧化應激水平的影響(n＝6，)Table 2 Effects of estrogen on oxidative stress in MC3T3-E1 cells(n＝6，)

images/BZ_102_237_1718_2241_1768.png空白對照組Blank control group 3.45±0.34 27.80±2.13 9.75±0.78 H2O2組H2O2group 6.78±0.68? 20.36±2.07? 14.48±1.24?H2O2+ 雌激素 0.1 μmol/L組H2O2+estrogen 0.1 μmol/L group 6.51±0.66? 21.07±2.20? 13.42±1.25?H2O2+ 雌激素1 μmol/L組H2O2+estrogen 1 μmol/L group 5.32 ± 0.51?# 23.65 ± 2.24?# 12.56 ± 1.21?#H2O2+ 雌激素10 μmol/L組H2O2+estrogen 10 μmol/L group 4.76 ± 0.43?# 25.71 ± 2.15?# 10.61 ± 1.06?#H2O2+NAC 1 mmol/L組H2O2+NAC 1 mmol/L group 4.51± 0.45?# 25.89± 2.21?# 10.74± 1.02?#F 87.451 26.143 52.695 P＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

表3 MC3T3-E1細胞Smad5、Runx2、Bcl-2、Bax和cleaved Caspase-3表達(n＝6，)Table 3 Expression of Smad5，Runx2，bcl-2，Bax and cleaved caspase-3 in MC3T3-E1 cells(n＝6，)

表3 MC3T3-E1細胞Smad5、Runx2、Bcl-2、Bax和cleaved Caspase-3表達(n＝6，)Table 3 Expression of Smad5，Runx2，bcl-2，Bax and cleaved caspase-3 in MC3T3-E1 cells(n＝6，)

images/BZ_102_237_2489_2241_2539.png空白對照組Blank control group 0.25±0.02 0.30±0.03 0.27±0.03 0.25±0.03 0.24±0.02 H2O2組H2O2group 0.18±0.02? 0.21±0.02? 0.22±0.02? 0.48±0.04? 0.45±0.03?H2O2+ 雌激素0.1 μmol/L組H2O2+estrogen 0.1 μmol/L group 0.18±0.02? 0.22±0.02? 0.23±0.03? 0.47±0.04? 0.44±0.04?H2O2+ 雌激素 1 μmol/L組H2O2+estrogen 1 μmol/L group 0.20± 0.02?# 0.25 ± 0.02?# 0.27 ± 0.03# 0.41 ± 0.04?# 0.39 ± 0.03?#H2O2+ 雌激素10 μmol/L組H2O2+estrogen 10 μmol/L group 0.22 ± 0.03?# 0.27 ± 0.03?# 0.30 ± 0.03?# 0.34 ± 0.03?# 0.33 ± 0.03?#H2O2+NAC 1 mmol/L組H2O2+NAC 1 mmol/L group 0.22± 0.02?# 0.27± 0.02?# 0.30± 0.02?# 0.33± 0.03?# 0.33± 0.02?#F 77.961 63.285 17.632 95.240 89.437 P＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

圖 3 MC3T3-E1 細胞 Smad5、Runx2、Bcl-2、Bax和cleaved Caspase-3表達Figure 3 Expression of Smad5， Runx2， bcl-2， Bax，and cleaved caspase-3 in MC3T3-E1 cells

3 討論

氧化應激是指細胞內(nèi)氧自由基尤其是ROS的產(chǎn)生與抗氧化能力失衡的一種狀態(tài)，可以引起多組織細胞的氧化損傷[10]。已有多項研究顯示[11-12]，氧化應激是導致PMOP發(fā)生的主要原因之一，細胞內(nèi)過多的ROS可以誘導成骨細胞和骨細胞的凋亡，影響骨形成和吸收過程的平衡。雌激素是機體重要的內(nèi)分泌激素，具有廣泛的生物學作用，可以調(diào)節(jié)骨的形成和吸收，目前已逐步應用于PMOP患者的替代治療[13]。既往研究顯示[14]，雌激素可以增加細胞內(nèi)抗氧化酶的表達，清除細胞內(nèi)過多的ROS，調(diào)節(jié)破骨細胞骨吸收和成骨細胞骨形成的平衡，但作用機制尚不清楚。因此，本研究建立了體外成骨細胞氧化應激損傷模型，來分析雌激素成骨細胞氧化應激損傷的作用。H2O2是一種常見的活性氧自由基，可以穿透細胞膜，誘導細胞的氧化應激損傷，與PMOP的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[15]。因此，本研究采用H2O2誘導MC3T3-E1細胞的氧化應激損傷，來分析雌激素的作用。本研究中，H2O2誘導MC3T3-E1細胞的增殖活性明顯下降，細胞凋亡率明顯升高，經(jīng)濃度為1 μmol/L及以上的雌激素作用后，MC3T3-E1細胞的增殖活性明顯增加，凋亡率明顯下降。周雪娟等[16]的研究顯示，雌二醇可以上調(diào)成骨細胞內(nèi)抗氧化酶的表達，減輕骨質(zhì)疏松大鼠的氧化應激損傷，提示雌激素可以促進氧化應激損傷成骨細胞的增殖，抑制其凋亡，其具體的作用機制有待于進一步深入研究。

本研究中，MC3T3-E1細胞經(jīng)H2O2誘導后，細胞內(nèi)Smad5和Runx2蛋白表達明顯下降，經(jīng)濃度為1 μmol/L及以上的雌激素作用后，細胞內(nèi)Smad5和Runx2蛋白表達明顯升高。已有研究顯示[17-18]，Smad5/Runx2信號軸在成骨細胞的分化中具有重要的調(diào)節(jié)作用，細胞外信號分子磷酸化Smad5后，可以與Smad4結(jié)合形成復合物并進入細胞核，與Runx2相互作用，調(diào)節(jié)成骨細胞的分化。王慧等[19]的研究顯示，雌激素可以通過多種信號通路調(diào)節(jié)成骨細胞Runx2的表達，提示雌激素可能通過調(diào)節(jié)Smad5/Runx2信號軸的表達，提高成骨細胞的分化能力。本研究中，MC3T3-E1細胞經(jīng)H2O2誘導后，細胞內(nèi)MDA和ROS水平明顯升高，SOD活性明顯下降，經(jīng)濃度為1 μmol/L及以上的雌激素作用后，細胞內(nèi)MDA和ROS水平明顯下降，SOD活性明顯升高，提示雌激素可以提高細胞內(nèi)抗氧化酶的表達，降低ROS水平，改善細胞的氧化應激狀態(tài)。

本研究中，MC3T3-E1細胞經(jīng)H2O2誘導后，JC-1陽性細胞率明顯升高，經(jīng)濃度為1 μmol/L及以上的雌激素作用后，細胞JC-1陽性細胞率明顯下降。JC-1是實驗中常用的一種檢測線粒體膜電位的熒光探針，在線粒體膜電位降低時，JC-1為單體出現(xiàn)綠色熒光[20]，提示雌激素可以升高氧化應激損傷MC3T3-E1細胞的線粒體膜電位。線粒體是細胞內(nèi)能量代謝的中心，線粒體膜內(nèi)外的電位差變化可以影響細胞內(nèi)的能量代謝，影響細胞增殖、分化、凋亡等多種生物學過程[21]，提示雌激素可能通過恢復線粒體膜電位，促進H2O2誘導MC3T3-E1細胞的增殖，抑制其凋亡。本研究中，H2O2可以誘導MC3T3-E1細胞Bax和cleaved Caspase-3蛋白的表達上調(diào)，Bcl-2蛋白的表達下調(diào)，經(jīng)濃度為1 μmol/L及以上的雌激素作用后，Bax和cleaved Caspase-3蛋白的表達下調(diào)，Bcl-2蛋白的表達上調(diào)。Bcl-2和Bax為一組調(diào)控線粒體凋亡途徑的蛋白，cleaved Caspase-3為細胞內(nèi)凋亡的執(zhí)行蛋白，可以降解細胞內(nèi)多種重要蛋白，誘導細胞凋亡[22]，提示雌激素可以恢復線粒體膜電位，上調(diào)氧化應激損傷MC3T3-E1細胞Bcl-2/Bax的表達，抑制細胞凋亡。

綜上所述，雌激素可以調(diào)節(jié)Smad5/Runx2信號軸的表達，促進H2O2致氧化應激損傷MC3T3-E1細胞的增殖和分化，降低細胞的氧化應激水平，抑制其凋亡，有望應用于臨床治療。但本研究尚處于初步探索階段，其雌激素保護H2O2致氧化應激損傷MC3T3-E1細胞的具體機制尚需進一步驗證。