趙楠楠，王艷，郭艷娟，高杰，袁金靈，陳燕

(華北理工大學附屬醫(yī)院，河北唐山 063000)

哺乳動物胚胎發(fā)育過程中第一個可見的分化事件是內細胞團(inner cell mass，ICM)和滋養(yǎng)外胚層(trophoectoderm，TE)的分離。ICM是一群多能細胞，附著在TE的內部，形成胎兒和胚胎外組織。相反，TE是圍繞囊胚腔發(fā)育成胎盤的單層極化細胞[1]。ICM和TE的分離由涉及多個基因相互作用的單獨的發(fā)育程序調節(jié)。

Oct4和Cdx2兩種轉錄因子對ICM和TE譜系的分離和功能發(fā)揮是必需的。Oct4(Pou5f1)是POU轉錄因子家族的一員，在囊胚腔形成后僅在ICM中表達，對維持細胞多能性和正常分化為表皮細胞的過程不可或缺[2]。Cdx2是正確的細胞命運決定和TE分化所需的TE特異性轉錄因子[3]。Cdx2、Sox2和Nanog是Oct4的已知靶點，三者通常形成網(wǎng)絡共同調控其他靶點基因。Oct4基因與Sox2、Nanog共同形成和維持胚胎干細胞的多能性和自我更新。缺乏Oct4或Cdx2表達的小鼠胚胎仍分別形成ICM或TE[3-5]。這些結果表明，Oct4和Cdx2在囊胚形成后ICM和TE的分化中都發(fā)揮了作用。然而，關于Cdx2調節(jié)Oct4在牛胚胎中的作用，還未有統(tǒng)一的說法。Schiffmacher等[6]指出Cdx2在牛胚胎中負調節(jié) Oct4。而其他研究表明，牛胚胎Cdx2的下調并不影響Oct4的表達[7-8]。目前對牛ICM和TE分化的分子機制研究有限。本研究希望通過Oct4和Cdx2敲低對牛ICM和TE分化相關基因表達的影響，解釋Oct4和Cdx2在牛胚胎早期發(fā)育中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞

牛卵母細胞由本院研究室采集并培養(yǎng)。

1.1.2 主要試劑與儀器

QuantiTect反轉錄試劑盒購自 Qiagen公司；VECTASHIELD with DAPI防熒光萃滅封片劑購自Vector Labs；Oct4、Cdx2、β-actin 抗體購自 Santa Cruz Biotechnology；新生牛血清、RNA提取試劑盒購自生工生物工程有限公司。

多管架自動平衡離心機L530；電熱恒溫水槽SSW-420-2S型；二氧化碳培養(yǎng)箱MCO-20AIC-SC；顯微操作儀 Nikon Eclipse Ti；熒光顯微鏡；博日qPCR儀。

1.2 方法

1.2.1 體外受精和胚胎培養(yǎng)

采集牛卵巢抽取卵母細胞，撿取卵丘-卵母細胞復合體(cumulus-oocyte complexes，COCs)。 COCs經(jīng)洗卵液和成熟液分別洗滌3～5次，微滴成熟液培養(yǎng)22 h，培養(yǎng)條件為39℃、5%CO2、飽和濕度，無菌礦物油覆蓋微滴。成熟后轉移至IVF-100培養(yǎng)液。解凍的精液在IVF-100培養(yǎng)基中2000 r/min離心5 min，共兩次。將精子加入COCs，終濃度為每毫升5×106個，在39℃、5%CO2的濕潤環(huán)境中孵育6 h。受精后，去除卵丘細胞和多余的精子。顯微注射siRNA，使用含 1%BSA的改良 TALP培養(yǎng)基(mTALP)，39℃、5%CO2、5%O2和 90%N2的濕潤環(huán)境下培養(yǎng)胚胎。第2天轉移至含3%新生牛血清的mTALP培養(yǎng)基中，相同條件培養(yǎng)至第7天。培養(yǎng)期間統(tǒng)計胚胎發(fā)育情況。

1.2.2 siRNA設計和顯微注射

根據(jù)Oct4和Cdx2的基因序列分析和設計原則，確定 Oct4 siRNA的 Sense Strand和 Antisense Strand分別為：5’-GGAAAGGUGUUCAGCCAAATT-3’， 5’-UUUGGCUGAACACCUUUCCTT-3’； Cdx2 siRNA的Sense Strand和Antisense Strand分別為：5 ’-ACGUGAGCAUGUAUCCCAGTT-3 ’， 5 ’-CUGGGAUACAUGCUCACGUTT-3’。 siRNA 序列由上海吉瑪制藥技術公司合成。受精后，根據(jù)說明將裸露的胚胎轉移至含1 mg/mL BSA的mTALP培養(yǎng)基微滴液中進行顯微注射。洗滌胚胎并按上述條件進行培養(yǎng)。

根據(jù)注射情況將實驗對象分為：空白對照(Ctrl)組；陰性對照siRNA(siCtrl)組；注射Oct4特異性 siRNA(siOct4)組和 Cdx2特異性 siRNA(siCdx2)組。

1.2.3 實時定量熒光PCR(qPCR)

收集桑椹胚和囊胚，蛋白酶去除囊胚透明帶。根據(jù)說明進行RNA提取、反轉錄及實時熒光定量PCR，所用引物為：Oct4 F：5’-GGTTCTCTTTGG AAAGGTGTTC-3’，R：5’-ACACTCGGACCACGTCTT TC-3’；Cdx2 F：5’-GCCACCATGTACGTGAGCTACC-3’， R： 5’-ACATGGTATCCGCCGTAGTCCGG-3’；Nanog F：5’-AATTCCCAGCAGCAAATCAC-3’， R：5’-CCCTTCCCTCAAATTGACAC-3’。 β-actin作為內參，SYBR Green檢測產(chǎn)物并計算相對表達量。

1.2.4 免疫熒光染色

4%多聚甲醛室溫固定桑椹胚20 min；含0.1%Triton X-100的PBS(TXPBS)清洗2次，每次10 min；清洗過的樣品用含0.2%Triton X-100的PBS通透30 min，再清洗2次；7%山羊血清封閉1.5 h用于Oct4染色，0.5%BSA+1% 脫脂奶粉封閉1.5 h用于Cdx2染色；TXPBS清洗5 min，一抗4℃孵育過夜；TXPBS清洗一抗4次，每次15 min；二抗室溫孵育1 h；TXPBS清洗4次，每次20 min；DAPI染色，VECTASHIELD封片。倒置熒光顯微鏡觀察實驗結果。

1.3 統(tǒng)計學分析

使用SPSS 20.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。所有數(shù)據(jù)均以平均值±標準差()表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用LSD檢驗。P＜0.05，差異具有顯著性。

2 結果

2.1 Oct4 siRNA干擾對Oct4 mRNA和蛋白表達的影響

qPCR結果顯示，siOct4組胚胎Oct4 mRNA表達水平顯著低于Ctrl組和siCtrl組(P＜0.05)。免疫熒光染色結果顯示，siOct4組胚胎Oct4信號強度顯著低于Ctrl組和siCtrl組。說明RNA干擾成功敲低牛胚胎Oct4基因(見圖1)。

2.2 Cdx2 siRNA干擾對Cdx2 mRNA和蛋白表達的影響

與 Ctrl組和 siCtrl組比較，siOct4組胚胎中Cdx2的mRNA和蛋白質表達水平均顯著降低(P＜0.05)。說明通過RNA干擾成功對牛胚胎的Cdx2基因進行了敲低(見圖2)。

圖1 Oct4 siRNA干擾對Oct4 mRNA和蛋白表達的影響Note.A.Relative expression of Oct4 mRNA.B.immunofluorescence results of Oct4.Compared with Ctrl group and siCtrl group，?P＜0.05.(The same in the following figures and tables)Figure 1 Effect of Oct4 siRNA interference on the expression of Oct4 mRNA and protein

圖2 Cdx2 siRNA干擾對Cdx2 mRNA和蛋白表達的影響Note.A.Relative expression of Cdx2 mRNA.B.immunofluorescence results of Cdx2.Figure 2 Effect of Cdx2 siRNA interference on the expression of Cdx2 mRNA and protein

2.3 siRNA干擾對牛胚胎早期發(fā)育的影響

與Ctrl組和siCtrl組比較，Oct4敲低的胚胎卵裂率及8-細胞期比例無差異(P＞0.05)，囊胚率顯著降低(P＜0.05)(表1)。Cdx2敲低的胚胎卵裂率、8-細胞率及囊胚率與Ctrl組和siRNA組均無差異(表2)。說明Oct4基因影響胚胎早期發(fā)育過程中的囊胚形成，Cdx2對胚胎發(fā)育到囊胚階段無影響。

2.4 Oct4 siRNA干擾對 Cdx2、Sox2和 Nanog mRNA水平的影響

與Ctrl組和siCtrl組相比，siOct4組的胚胎Cdx2、Sox2和Nanog mRNA在囊胚階段表達水平均顯著下降(圖3，P＜0.05)。 說明在牛胚胎早期發(fā)育中，Cdx2、Sox2和Nanog mRNA表達水平與Oct4基因有關。

2.5 Cdx2 siRNA干擾對 Oct4、Sox2和 Nanog mRNA水平的影響

與Ctrl組和siCtrl組相比，siCdx2組胚胎在囊胚階段 Oct4 mRNA表達水平顯著降低(圖 4，P＜0.05)，Sox2 mRNA和Nanog mRNA無差異(圖4B和圖4C，P＞0.05)。說明在牛胚胎早期發(fā)育中，Cdx2基因主要影響Oct4基因的表達，對Sox2和Nanog基因則無影響。

表1 敲低Oct4后牛胚胎早期的發(fā)育Table 1 Embryos early development after Oct4 knockdown

表2 敲低Cdx2后牛胚胎早期的發(fā)育Table 2 Embryos early development after Cdx2 knockdown

圖3 Oct4 siRNA干擾對Cdx2、Sox2和Nanog mRNA水平的影響Figure 3 Effect of Oct4 siRNA interference on levels of Cdx2，Sox2 and Nanog mRNA

圖4 Cdx2 siRNA干擾對Oct4、Sox2和Nanog mRNA水平的影響Figure 4 Effect of Cdx2 siRNA interference on levels of Cdx2，Sox2 and Nanog mRNA

3 討論

Oct4和Cdx2是小鼠胚胎中ICM和TE分化的中心調節(jié)因子[2-4]。Oct4僅在囊胚的滋養(yǎng)層中表達，Oct4主要高表達于內細胞團[4]。Oct4可調節(jié)ICM的分化，指導胚胎干細胞的命運決定[2，9]，且對于誘導分化細胞的多能性至關重要[10]。Cdx2能夠通過上調各種TE特異性基因和下調Oct4與Nanog基因促進TE譜系的分化[3]。Cdx2基因缺失的囊胚不能維持囊胚腔，無法形成完整的上皮，且異常調節(jié)ICM特異性轉錄因子Oct4及Nanog，細胞死亡率高。但Cdx2基因缺失的囊胚能夠形成ICM，且能在體外培養(yǎng)得到胚胎干細胞[11]。

本項研究中，我們利用RNA干擾技術探究了Oct4和Cdx2在牛胚胎早期發(fā)育中的作用。結果表明，二者對于牛ICM和TE的正常分化和健全的囊胚形成至關重要。與小鼠胚胎相比，Oct4下調對牛胚胎發(fā)育的影響更為嚴重。不同于小鼠胚胎，Oct4在牛TE中的表達不會消失，即使在完全擴張的囊胚階段也是如此[12]。Oct4可能在牛胚胎的囊胚階段發(fā)揮不同的作用，如將增殖的TE細胞保持在分化延遲狀態(tài)[13]。然而，Nganvongpanit等[14]表示注射Oct4 dsRNA與否對牛胚胎在囊胚階段的發(fā)育率沒有顯著影響。在本研究中，Oct4敲低對牛胚胎發(fā)育到桑椹胚階段無影響，但囊胚的形成顯著低于對照組的胚胎。關于注射Oct4 dsRNA與siRNA的胚胎發(fā)育能力不同的原因尚未明確，注射Oct4 dsRNA的胚胎需要相對更長的培養(yǎng)時間才能形成囊胚腔，ICM細胞的數(shù)量也明顯較低[14]。這表明在囊胚形成過程中，Oct4在不同物種間可能發(fā)揮了共同或獨特的作用。與Oct4不同的是，本研究發(fā)現(xiàn)siRNA敲低Cdx2后的胚胎，卵裂率、8-細胞期比例及囊胚率均與對照組胚胎無差別。一方面，Oct4基因可能影響了胚胎早期發(fā)育過程中的囊胚形成。另一方面，也有可能由于siRNA敲低效果減弱或消失，從而導致注射了特異性siRNA的胚胎形成囊胚。

雖然對胎盤早期發(fā)育無直接影響，敲低Oct4或Cdx2基因對早期發(fā)育相關基因的影響卻是顯著的。Oct4和Cdx2在小鼠胚胎干細胞中抑制彼此的表達[4]。敲低或敲除Cdx2導致Oct4在小鼠胚胎中異位表達和過度表達[3，5]。但本研究發(fā)現(xiàn)，單獨敲低牛胚胎中的 Oct4或 Cdx2基因，另一種基因在mRNA水平上的表達受到抑制。因此，在牛胚胎中可能不存在Cdx2與Oct4相互抑制的機制。Nanog基因是Oct4的另一個靶基因，編碼一種同源異型蛋白轉錄因子，對于維持ICM和胚胎干細胞的多能性必不可少。與Oct4不同，Nanog在形成外胚層和內胚層中起決定性作用。小鼠Nanog mRNA在致密桑椹胚階段才表達，在ICM中維持，而在TE中迅速下降。發(fā)育中的胚胎多能性的維持還需要轉錄因子Sox2的活性，Sox2在調控不同細胞系中具有多種功能。小鼠Sox2轉錄產(chǎn)物在桑椹胚階段開始表達，在ICM中維持，直至外胚層階段。多項研究證實了Sox2在限定ICM分化中的作用[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，Oct4敲低導致Sox2和Nanog mRNA水平顯著下降，Cdx2敲低對Sox2和Nanog mRNA水平無影響。這說明Oct4通過調節(jié)各種基因控制牛胚胎的分化，而Cdx2在牛胚胎的分化中可能是通過調控Oct4或其他基因發(fā)揮作用。