陳愛昌 王艷霞 漆永紅 羅寧 李惠霞

摘要：為明確蒙古黃芪苗期立枯病害及其病原菌種類，采用組織分離法進(jìn)行病原菌分離，并根據(jù)其培養(yǎng)性狀、形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)rDNA-ITS特征進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明，該病害的病原菌為立枯絲核菌（Rhizotonia solani）。室內(nèi)致病性測(cè)試結(jié)果表明，立枯絲核菌可引起蒙古黃芪苗期立枯病。本研究首次報(bào)道了蒙古黃芪苗期立枯病及其病原菌，可為生產(chǎn)上該病害的防治提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：苗期；蒙古黃芪；立枯??；病原鑒定；致病性測(cè)定

中圖分類號(hào)：S436.429文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A論文編號(hào)：cjas2020-0082

Identification of Rhizoctonia solani and Its Pathogen in Astragalus membranaceus var. mongholicus Seedling Stage

Chen Aichang1， Wang Yanxia2， Qi Yonghong3， Luo Ning4， Li Huixia4

（1Dingxi Station of Plant Protection and Quarantine， Dingxi 743000， Gansu， China；

2Dingxi Station of Rural Energy， Dingxi 743000， Gansu， China； 3Institute of Plant Protection， Gansu Academy of Agricultural Sciences， Lanzhou 730070， Gansu， China； 4College of Plant Protection， Gansu Agricultural University， Lanzhou 730070， Gansu， China）

Abstract： In order to clarify the pathogen and pathogenicity of Rhizoctonia solani in Astragalus membranaceus var. mongholicus seedling stage， the pathogen was isolated by tissue isolation method and identified according to its culture traits， morphology and molecular biological characteristics. The results showed that the disease pathogens were identified as Rhizotonia solani. This study first reported Rhizoctonia solani and its pathogen in Astragalus membranaceus var. mongholicus seedling stage， which could provide a theoretical basis for the control of the disease in production.

Keywords： Seedling Stage； Astragalus menbranaceus var. mongholicus； Rhizoctonia solani； Pathogen Identification； Pathogenic Testing

0引言

黃芪（Astragalus menbranaceus）是豆科黃芪屬多年生草本植物，有蒙古黃芪（Astragalus menbranaceus var. mongholicus）和膜莢黃芪（Astragalus menbranaceus）[1]，以干燥的根入藥，具有補(bǔ)氣固表、利尿托毒、排膿、斂瘡生肌等功效[2]。蒙古黃芪原產(chǎn)于山西、內(nèi)蒙、河北、陜西和甘肅等地。甘肅省隴西縣是國(guó)內(nèi)主要的道地黃芪產(chǎn)區(qū)之一，具有品質(zhì)優(yōu)和產(chǎn)量高等特點(diǎn)，被中國(guó)特產(chǎn)組委會(huì)命名為“中國(guó)黃芪之鄉(xiāng)”。隨著甘肅省黃芪人工栽培面積的逐年擴(kuò)大、黃芪連作生長(zhǎng)環(huán)境的改變和土壤病原菌數(shù)量的不斷積累，黃芪病害已成為制約其產(chǎn)量增加和品質(zhì)提升的重要因素之一。

關(guān)于黃芪的一些病害國(guó)內(nèi)學(xué)者有研究。陳宏宇等[3]對(duì)黃芪根腐病的發(fā)病因素進(jìn)行調(diào)查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，溫濕度、土壤質(zhì)地、茬口對(duì)黃芪根腐病的發(fā)生都有一定的影響，連作是黃芪根腐病發(fā)生的主要因素之一，輪作對(duì)根腐病的防治作用明顯。據(jù)報(bào)道[4-9]黃芪根腐病的主要病原菌為尖孢鐮孢菌（Fusarium oxysporium）、茄病鐮孢菌（Fusariumsonali）、銳頂鐮刀菌（Fusarium acuminatum）、芬芳鐮刀菌（Fusarium redolens）、鏈格孢菌（Alternaria sp.）和Ilyonectria torresensis等。駱得功等[10]、陳泰祥等[11]和陳秀蓉等[12]對(duì)甘肅省隴西縣幾個(gè)重病區(qū)的黃芪霜霉病病原菌鑒定為黃芪霜霉菌（Peronospora astragalina）。任舉[13]報(bào)道，黃芪葉部的銹病由單孢銹菌屬（Uromyces）真菌引起。李綏峰[14]、孫樹文等[15]、徐福祥[16]、邢占民[17]、周天旺等[18]和陳泰祥等[19]對(duì)黃芪白粉病的發(fā)生特點(diǎn)、發(fā)生規(guī)律、病原種類及防治進(jìn)行了研究。馬瑩瑩等[20]系統(tǒng)總結(jié)了黃芪主要病害的發(fā)生情況、致病菌種類的多樣性、抗病品種選育、栽培管理模式、土壤營(yíng)養(yǎng)、化學(xué)防治和生物防治等，為黃芪病害的綜合防治提供了參考。關(guān)于立枯絲核菌引起的黃芪根病有報(bào)道，但由其引起的苗期黃芪立枯病未見報(bào)道。因此，筆者對(duì)定西市苗期發(fā)生的黃芪立枯病的發(fā)病癥狀進(jìn)行研究，以確定其病原種類和致病性，為苗期黃芪立枯病的田間防治提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1病樣采集及田間病害分級(jí)

在定西市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院黃芪種植基地，采集苗期黃芪立枯病發(fā)病植株，記錄采集信息后裝入自封袋。采用5點(diǎn)取樣法進(jìn)行田間調(diào)查，每點(diǎn)30株。病害分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)為：0級(jí)—根部無病斑，1級(jí)—根部病斑面積占總根部面積的1/4以下，3級(jí)—根部病斑面積占總根部面積的1/4～1/2，5級(jí)—根部病斑面積占總根部面積的1/2～3/4，7級(jí)—根部病斑面積占總根部面積的3/4以上。

1.2病原菌分離

采用常規(guī)組織分離法[21]，無菌條件下剪取病健交界處組織塊5 mm×5 mm置于75%酒精中浸泡5 s，然后轉(zhuǎn)移至1.5%次氯酸鈉溶液中消毒1 min，無菌水漂洗3次晾干，置于PDA培養(yǎng)基平板內(nèi)于25℃培養(yǎng)5～7天。將分離純化的菌株轉(zhuǎn)接至PDA斜面，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3病原菌形態(tài)學(xué)鑒定

將病原菌接種在PDA培養(yǎng)基上，25℃下培養(yǎng)7天后，觀察并拍照記錄菌落形態(tài)、顏色、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)及孢子大小。根據(jù)魏景超[22]的分類方法和標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行病原菌種類鑒定。

1.4病原菌分子生物學(xué)鑒定

1.4.1真菌基因組DNA提取刮取PDA培養(yǎng)基上的病原菌菌絲，按照真菌基因組DNA快速抽提試劑盒E.Z. N.A HP Fungal DNA Kit（OMEGA）的步驟提取DNA，保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2分子鑒定的引物試驗(yàn)采用真菌核糖體基因ITS區(qū)域引物D1和D2，引物序列分別為ITS1（TCCGTAGGTGAACCTGCGG）和ITS4-R（TCCTCCG CTTATTGATATGC）。

1.4.3 PCR擴(kuò)增、凝膠電泳、測(cè)序及序列分析PCR擴(kuò)增體系（20μL）：2×Taq PCR SuperMix 10μL，10μmol/L正反向引物各1μL，DNA模板1μL，用ddH2O補(bǔ)足至20μL。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性2 min；94℃變性20 s，50℃退火10 s，72℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸2 min，4℃保存?zhèn)溆谩CR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，送生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。

1.4.4 rDNA序列比較分析與系統(tǒng)發(fā)育樹使用BioEdit校對(duì)測(cè)序結(jié)果并拼接序列。測(cè)序后的序列經(jīng)校正后，在核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)GenBank（http：//blast.ncbi.nlm.nih. gov/）中進(jìn)行同源序列搜索，比較測(cè)試菌株與數(shù)據(jù)庫(kù)中相應(yīng)序列的相似程度，獲得同源性較高的立枯絲核菌ITS序列，應(yīng)用DNAMAN進(jìn)行序列比對(duì)分析，并用Mega 6.0 Neighbor-joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.5病原菌致病性測(cè)定

采用柯赫氏法則進(jìn)行致病性測(cè)定，將滅菌土裝入高和直徑都為15 cm的花盆中，挑選大小一致且無病斑的黃芪苗3株移栽，共移栽6盆。待黃芪莖稈長(zhǎng)至6 cm時(shí)撥開花盆上部8 cm土壤，將分離純化的病原物打成10 mm菌餅，分別做針刺和無刺傷接菌，以未接菌PDA培養(yǎng)基為對(duì)照，每株接1個(gè)菌餅，回填土壤澆水。50天后調(diào)查發(fā)病情況，同時(shí)將發(fā)病部位再次分離培養(yǎng)，通過形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定確定分離得到的病原菌與初接病原菌是否為同一病原菌。

2結(jié)果與分析

2.1發(fā)病癥狀

田間調(diào)查發(fā)現(xiàn)，苗期黃芪立枯病在6月上旬發(fā)病，8月進(jìn)入發(fā)病盛期。地上部發(fā)病植株長(zhǎng)勢(shì)衰弱，葉色灰綠，失水狀，少數(shù)葉片枯萎，提前脫落（圖1a）。根莖部產(chǎn)生不規(guī)則形黑褐色網(wǎng)狀病斑，圍繞整個(gè)根莖，病斑不凹陷（圖1b）。

2.2形態(tài)學(xué)鑒定特征

在PDA培養(yǎng)基上（圖2a～b），菌落初為白色，逐漸變?yōu)榈稚辽詈稚?，菌落中間較密，邊緣稀疏。3～4天形成“菌核”，菌核初為白色，后變紫褐色至深褐色。初生菌絲無色，粗細(xì)較均勻，直徑4.98～8.79μm，分枝呈直角或近直角，分枝處大多有縊縮（圖2c），附近生有一隔膜。

2.3核糖體rDNA-ITS序列分析

測(cè)序結(jié)果與GenBenk數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行Nucleotide Blast比對(duì)，與立枯絲核菌的ITS片段同源性達(dá)100%。用Mega 7.0軟件，采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，黃芪立枯病與Rhizoctonia solani親緣關(guān)系最近（圖3）。結(jié)合形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)特征，將引起黃芪立枯病的病原菌鑒定為立枯絲核菌（R. solani）。

2.4致病性測(cè)定

室內(nèi)致病性測(cè)試結(jié)果（圖4）表明，接菌植株表現(xiàn)出與自然病株相同的癥狀，未接菌植株表現(xiàn)正常，從接種發(fā)病黃芪植株上全部分離到病原菌，形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定為立枯絲核菌。

3討論

植物病害病原種類的確定是防治的前提和基礎(chǔ)，明確病原種類對(duì)制定合理的防治策略和提高防治效果有重要的指導(dǎo)作用。本試驗(yàn)首次報(bào)道了苗期黃芪立枯病的發(fā)病癥狀，同時(shí)明確了該病害的病原菌為立枯絲核菌。

苗床立枯病是黃芪生產(chǎn)上的一種毀滅性病害，引起育苗階段黃芪早死，同時(shí)帶病植株移栽到大田將造成產(chǎn)量損失大，降低黃芪等級(jí)和影響品質(zhì)。該病由立枯絲核菌引起，菌核在土壤中的存活時(shí)期長(zhǎng)，防治很困難。該病原菌寄生范圍廣，包括水稻、大麥、棉花、茼麻、黃麻、洋麻、甜菜、大豆、煙草、洋蔥、黃瓜、萵苣、絲瓜、十字花科蔬菜、番茄、馬鈴薯、茄子、豌豆、蠶豆、豇豆等，同時(shí)可引起苗前死亡、立枯、基腐和根腐等病害，由此可以發(fā)現(xiàn)該病原菌為害的普遍性和發(fā)病的嚴(yán)重性，本試驗(yàn)首次報(bào)道了立枯絲核菌可以引起苗期黃芪的立枯病。中藥材種植所需的種苗一部分自給自足，大部分通過購(gòu)買種苗，苗床帶病種苗是立枯病遠(yuǎn)距離傳播的主要途徑，一旦病菌在土壤中定殖將造成嚴(yán)重的為害，這進(jìn)一步說明在生產(chǎn)上確保苗期健康種苗的重要性。

立枯病可以通過多種綜合措施進(jìn)行防治[23-25]。陳秀蓉等[12]提出通過剔除病苗、與禾本科植物實(shí)行2年以上輪作，收獲后徹底清除田間病殘?bào)w，這些物理防治可以減少初侵染源。此外，化學(xué)防治是有效的防治措施之一，據(jù)報(bào)道一些藥劑30%苯噻氰乳油1000倍液、95%噁霉靈水劑3000倍液蘸根10 min，晾干后移栽，或用40%拌種雙可濕性粉劑67.5 kg/hm2拌30 kg細(xì)土混勻，撒施于地面，耙入土中可以防治立枯病。關(guān)于由立枯絲核菌引起的苗床黃芪立枯病的化學(xué)防治技術(shù)和方法未見報(bào)道，有待于進(jìn)一步研究。同時(shí)，為更好地防治該病害，掌握苗期立枯病發(fā)生的流行規(guī)律和侵染循環(huán)也是很有必要的。

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