齊曉藝，封龍寬，王少雄，孫煒，王曉萌，檀建新

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科技學(xué)院，河北保定 071000）

脯氨酰內(nèi)肽酶（Prolyl Endopeptidase，PEP）是由WALTER等[1-2]首先發(fā)現(xiàn)的一種高度保守的絲氨酸蛋白酶，也被稱為脯氨酰寡肽酶或脯氨酸后裂解酶[3]，存在于許多植物、哺乳動(dòng)物、細(xì)菌和真菌中[4-5]。PEP是一種特異性水解酶，只能切割少于30個(gè)氨基酸的肽底物和水解肽片段[5]，有可能優(yōu)先切割脯氨酸殘基羧基側(cè)的肽，其次是亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸和丙氨酸。近年來(lái)，大量學(xué)者對(duì)PEP酶學(xué)特性、作用機(jī)制、異源表達(dá)和分子改造等特性以及應(yīng)用等方面進(jìn)行了相當(dāng)多的研究。本文以“prolyl endopeptidase”“作用機(jī)制”“異源表達(dá)”等為關(guān)鍵詞，根據(jù)知網(wǎng)、Web of Science和Science Direct等數(shù)據(jù)庫(kù)搜索結(jié)果，從作用途徑或物質(zhì)基礎(chǔ)的角度綜述了PEP功能活性研究進(jìn)展，為PEP在食品、醫(yī)藥領(lǐng)域中的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 酶的來(lái)源

脯氨酰內(nèi)肽酶（PEP，EC3.4.21.26）廣泛分布于植物、哺乳動(dòng)物、細(xì)菌和真菌中，不同來(lái)源的酶在相應(yīng)生物體中發(fā)揮著不同的作用[4-5]。迄今為止，在曲霉屬中只有2種產(chǎn)脯氨酰內(nèi)肽酶：黑曲霉和煙曲霉，且只有黑曲霉是食品級(jí)微生物[4]。不同于來(lái)自其他微生物或哺乳動(dòng)物的PEP，來(lái)自于黑曲霉的PEP具有切割大分子蛋白質(zhì)的能力，且不需要任何其他具有廣泛特異性蛋白酶活性的預(yù)水解步驟[6]。

2 酶學(xué)性質(zhì)

2.1 霉菌產(chǎn)生酶

目前，利用霉菌產(chǎn)生PEP的工藝已經(jīng)得到了廣泛的研究。ESPARZA等[7]研究黑曲霉ATCC 11414發(fā)酵PEP的工藝，構(gòu)建了固態(tài)發(fā)酵（SSF）生產(chǎn)PEP的系統(tǒng)。在SSF生產(chǎn)PEP過(guò)程中得出，PEP酶的最適溫度為50 ℃，固態(tài)發(fā)酵168 h后PEP活性最高，為（9.76±0.06）U/kg；在pH值為4時(shí)酶活力最高，在pH值為3和pH值為5時(shí)酶活力分別為最大酶活力的60%和70%。與其他曲霉菌株產(chǎn)生的酶一樣[8]，這種酶具有最適的酸性pH值，這是區(qū)別真菌PEP和細(xì)菌PEP的重要指標(biāo)。

2.2 動(dòng)物產(chǎn)生酶

研究表明，動(dòng)物產(chǎn)生PEP有利于進(jìn)一步探究其酶學(xué)性質(zhì)和作用機(jī)制。LI等[5]成功克隆了重組鮑魚脯氨酰內(nèi)肽酶基因（rHdh-PEP）全長(zhǎng)，通過(guò)肽質(zhì)量指紋圖譜、酶學(xué)性質(zhì)等分析方法表明，rHdh-PEP的最適pH值為6.0，最適溫度為20 ℃。其他研究表明，鯉魚PEP的最適溫度為35 ℃；PEP在40 ℃以下較穩(wěn)定，當(dāng)溫度超過(guò)45 ℃時(shí)，其活性急劇下降[9]。這說(shuō)明PEP對(duì)溫度極其敏感，溫度是影響其活性的關(guān)鍵因素。

3 PEP的作用機(jī)制

從蛋白的結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制來(lái)看，PEP是相對(duì)不尋常的絲氨酸蛋白酶，僅能在脯氨酸殘基的羧基端特異性地切割短肽[10]。PEP的X射線晶體結(jié)構(gòu)由FüL?P等人[11]于1998年首次從豬腦中獲得，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明PEP具有一種特殊的雙結(jié)構(gòu)域，包括一個(gè)較小的α/β-水解酶結(jié)構(gòu)域和一個(gè)不常見(jiàn)的β-螺旋結(jié)構(gòu)域。脯氨酰內(nèi)肽酶家族在底物特異性上有很大差異[12]，但都具有這個(gè)相同的雙結(jié)構(gòu)域。該家族的肽酶采用了復(fù)雜的機(jī)制來(lái)調(diào)節(jié)和篩選可進(jìn)入埋藏的活性部位的底物，允許較小的肽段進(jìn)入活性部位空腔，同時(shí)排除較長(zhǎng)或結(jié)構(gòu)化的肽，防止非靶向消化[13]。

LU等[12]對(duì)囊鞘氨醇單胞菌（Sphingomonas capsulata，SC）和黃色粘球菌（Myxococcus xanthus，MX）兩種來(lái)源的PEP進(jìn)行結(jié)構(gòu)和機(jī)理分析，揭示了PEP家族中一種獨(dú)特的酶與底物結(jié)合模式：進(jìn)入的肽底物會(huì)誘導(dǎo)酶的構(gòu)象變化并導(dǎo)致結(jié)構(gòu)域界面打開(kāi)，開(kāi)放的PEP結(jié)構(gòu)通過(guò)底物和酶的催化結(jié)構(gòu)域之間的相互作用暫時(shí)穩(wěn)定，同時(shí)發(fā)現(xiàn)殘基Arg-618和Asp-145有助于酶獨(dú)特的底物特異性和活性。

4 PEP的分子改造與異源表達(dá)

目前，工程酶常用的策略之一是定向進(jìn)化，這是相當(dāng)盲目和低效的。 PEP對(duì)脯氨酸殘基羧基端切割底物肽具有很高的特異性[14]，為克服這一功能發(fā)揮的局限性，而采用了另一種策略，即分子改造和異源表達(dá)[15]。HUG等[16]通過(guò)靶向基因失活實(shí)驗(yàn)和相關(guān)酶的體外生化表征，在鏈霉菌中通過(guò)靶向基因失活和外源表達(dá)確認(rèn)了脯氨酰內(nèi)肽酶生物合成基因在Cittilins（粘細(xì)菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物）形成中的作用。畢赤酵母作為一種甲基營(yíng)養(yǎng)酵母，已經(jīng)在學(xué)術(shù)界和工業(yè)界發(fā)展成為一種非常成功的外源蛋白表達(dá)系統(tǒng)[17]，YU等[18]研究發(fā)現(xiàn)，重組菌株轉(zhuǎn)錄組的3個(gè)新的輔助基因（FES1、CPR6和STI1）的共同過(guò)表達(dá)成功地提高了包括脯氨酰內(nèi)肽酶在內(nèi)的兩種酶在畢赤酵母中的產(chǎn)量，其產(chǎn)量比對(duì)照組增加了1.41倍。LASSE等[19]研究了在大腸桿菌中制備的嬰兒利什曼原蟲脯氨酰內(nèi)肽酶（rPEPLi），實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明rPEPLi作為一種嬰兒利什曼原蟲的毒力因子，為設(shè)計(jì)新的抗嬰兒利什曼原蟲藥物提供了潛在的靶點(diǎn)。

5 PEP的應(yīng)用

已有研究證明PEP對(duì)蛋白水解物具有脫苦作用[20]，可防止啤酒混濁的形成，同時(shí)能降解富含脯氨酸的蛋白質(zhì)從而消除面筋[21]，以及緩解肝病癥狀等功能[22]，目前已廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)和食品領(lǐng)域。

5.1 醫(yī)學(xué)中對(duì)疾病的抑制作用

PEP廣泛分布在身體各個(gè)部位，大量的證據(jù)表明PEP參與炎癥和氧化應(yīng)激過(guò)程，對(duì)疾病治療具有深遠(yuǎn)意義[23-24]。WEI等[25]認(rèn)為PEP等酶通過(guò)切斷谷氨酰胺和富含脯氨酸的區(qū)域，抗原性麩質(zhì)肽的特征區(qū)域，在體內(nèi)和體外裂解抗消化的面筋肽，且在胃的酸性環(huán)境和十二指腸內(nèi)接近中性的環(huán)境中可以穩(wěn)定、活躍地存在，以此解決輕微癥狀或嚴(yán)重的吸收不良造成的乳糜瀉癥狀。ZHANG等[26]發(fā)現(xiàn)PEP破壞可以減輕蛋氨酸膽堿缺乏（MCD）誘導(dǎo)的肝臟炎癥，同時(shí)減少了炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)和炎性介質(zhì)的分泌，更重要的是，靶向PEP可以改善MCD小鼠的氧化應(yīng)激狀態(tài)，其可能是NAFLD/NASH新的潛在治療選擇。還有研究證明PEP可以抑制乳腺癌腫瘤[27]、腦膜炎[28]等疾病，在醫(yī)學(xué)中應(yīng)用較為廣泛。

5.2 食品中對(duì)飲品的澄清作用

食品級(jí)的PEP具有最佳的酸堿度水平，對(duì)飲品具有澄清作用[29]。對(duì)于富含蛋白原料的發(fā)酵酒，容易形成由多酚和脯氨酸等組成的聚集體渾濁，因此在前處理階段和啤酒釀造的穩(wěn)定階段使用一些能分解蛋白質(zhì)的酶，如脯氨酰內(nèi)肽酶，可以有效去除沉淀的聚集體以達(dá)到澄清效果[30]。張杰等[31]把不同酶活的PEP梯度添加到小麥啤酒生產(chǎn)過(guò)程的不同階段，研究其對(duì)小麥啤酒非生物穩(wěn)定性及泡沫穩(wěn)定性的影響，發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵前添加42 U/mL的PEP可顯著降低小麥啤酒的非生物渾濁，且不影響發(fā)酵整體性能及泡沫穩(wěn)定性，為生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的小麥啤酒提供了新的思路。

6 結(jié)語(yǔ)

本文主要探討了PEP的酶學(xué)性質(zhì)、作用機(jī)制、異源表達(dá)、分子改造及其應(yīng)用。分離自黑曲霉的PEP，來(lái)源可靠、安全性高，分子改造及異源表達(dá)等酶工程技術(shù)的發(fā)展為酶的可控生產(chǎn)開(kāi)辟了新的途徑，也為PEP在疾病治療及功能性食品開(kāi)發(fā)等方面提供了技術(shù)支撐。