丘琴，盧顯興，陳明偉，甄丹丹，黃秋艷，蔣蘭蘭，劉玉雯，甄漢深

(廣西中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院， 廣西 南寧 530200)

0 引言

扁擔(dān)藤為葡萄科崖爬藤屬植物扁擔(dān)藤Tetrastigmaplanicaule(Hook.f.)Gagnep.，分布于廣西各地，主要以藤莖、根入藥，為廣西壯醫(yī)常用藥材。壯醫(yī)認(rèn)為扁擔(dān)藤具有祛風(fēng)毒，除濕毒，通龍路、火路之功效，可用于治療發(fā)旺(痹病)，兵吟(筋病)，林得叮相(跌打損傷)，麻邦(半身不遂)等病癥，現(xiàn)代藥理研究表明，扁擔(dān)藤具有抗氧化、抑菌、抗腫瘤等作用[1-5]。目前對(duì)扁擔(dān)藤質(zhì)量控制的研究，主要是對(duì)其性狀和顯微鑒別進(jìn)行研究[6-7]。酚酸類(lèi)成分是扁擔(dān)藤的主要化學(xué)成分之一[8-10]，現(xiàn)代藥理研究表明，酚酸類(lèi)成分具有抗過(guò)敏、抗氧化、抗肝癌作用，其中的原兒茶酸具有保肝、抗氧化、抑菌、抗炎等作用[11-13]，香草酸具有抗菌、消炎、抗氧化，抑制酪氨酸酶活性，調(diào)節(jié)神經(jīng)，抗血小板聚集等藥理作用[14-15]。本課題以原兒茶酸和香草酸為指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)優(yōu)選扁擔(dān)藤莖的提取工藝，采用高效液相色譜法(HPLC)同時(shí)測(cè)定扁擔(dān)藤莖中原兒茶酸和香草酸的含量，為建立扁擔(dān)藤的質(zhì)量控制方法和進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 儀器

高效液相色譜儀(1100，美國(guó)安捷倫科技有限公司)；色譜工作站(1100series，美國(guó)安捷倫科技公司)；C18色譜柱(熱電Thermo Hypersil ODS, 5 μm， 4.6 mm×250 mm)；電子分析天平(SQP,賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司)；超純水器(美國(guó)理博公司)；高速微量離心機(jī)(LG16-W，上海安亭科學(xué)儀器)；電熱恒溫水浴鍋(DK-98-ⅡA，天津市泰斯特儀器有限公司)。

1.2 試藥

10批扁擔(dān)藤藥材分別產(chǎn)自廣西省內(nèi)不同產(chǎn)地(表1)，經(jīng)廣西一心藥業(yè)公司馬利飛副主任中藥師鑒定為葡萄科崖爬藤屬植物扁擔(dān)藤Tetrastigmaplanicaule(Hook.f.) Gagnep.的莖。陰干，打成粗粉，備用。原兒茶酸(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110809-201205，用于含量測(cè)定)；香草酸(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110776-200402，用于含量測(cè)定)。

表1 扁擔(dān)藤藥材來(lái)源信息表Tab.1 Source information of Tetrastigma planicaule

1.3 試劑

甲醇和乙腈(色譜純，美國(guó)Fisher科學(xué)世界公司)；甲醇(分析純，北京化工廠(chǎng))；乙醇(分析純，北京化工廠(chǎng))；磷酸(85.0 %，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司 )；冰醋酸(99.5 %，上海試一化學(xué)試劑有限公司)；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 提取工藝優(yōu)選

2.1.1 單因素考察

2.1.1.1 提取溶劑的選擇

由于原兒茶酸和香草酸均可溶于醇、水，參照《中華人民共和國(guó)藥典(2015年版)》，分別考察了乙醇、甲醇、水、乙醇∶0.5 %冰醋酸(75∶25)、甲醇∶0.5 %冰醋酸(75∶25)等提取溶劑，具體方法如下：

① 取1號(hào)藥材粉末約3 g，精密稱(chēng)定，加入10倍量的乙醇溶液，加熱回流提取1 h，放冷過(guò)濾，濾液濃縮，定容至2 mL，得樣品1溶液，備用。取樣品1溶液，13 000 r/min離心10 min，取上清液進(jìn)樣，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 扁擔(dān)藤莖樣品1溶液HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of stem of Tetrastigma planicaule sample 1 solution

② 取1號(hào)藥材粉末約3 g，精密稱(chēng)定，加入10倍量的甲醇溶液，加熱回流提取1 h，放冷過(guò)濾，濾液濃縮，定容至2 mL，得樣品2溶液，備用。取樣品2溶液，13 000 r/min離心10 min，取上清液進(jìn)樣，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 扁擔(dān)藤莖樣品2溶液HPLC色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of stem of Tetrastigma planicaule sample 2 solution

③ 取1號(hào)藥材粉末約3 g，精密稱(chēng)定，加入10倍量的水溶液，加熱回流提取1 h，放冷過(guò)濾，濾液濃縮，定容至2 mL，得樣品3溶液，備用。取樣品3溶液，13 000 r/min離心10 min，取上清液進(jìn)樣，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 扁擔(dān)藤莖樣品3溶液HPLC色譜圖Fig.3 HPLC chromatogram of stem of Tetrastigma planicaule sample 3 solution

④ 取1號(hào)藥材粉末約3 g，精密稱(chēng)定，加入10倍量的乙醇∶0.5 %冰醋酸(75∶25)溶液，回流提取1 h，放冷過(guò)濾，濾液濃縮，定容至2 mL，得樣品4溶液，備用。取樣品4溶液，13 000 r/min離心10 min，取上清液進(jìn)樣，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 扁擔(dān)藤莖樣品4溶液HPLC色譜圖Fig.4 HPLC chromatogram of stem of Tetrastigma planicaule sample 4 solution

⑤ 取1號(hào)藥材粉末約3 g，精密稱(chēng)定，加入10倍量的甲醇∶0.5 %冰醋酸(75∶25)溶液，回流提取1 h，放冷過(guò)濾，濾液濃縮，定容至2 mL，得樣品5溶液，備用。取樣品5溶液，13 000 r/min離心，取上清液進(jìn)樣，結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 扁擔(dān)藤莖樣品5溶液HPLC色譜圖Fig.5 HPLC chromatogram of stem of Tetrastigma planicaule sample 5 solution

⑥ 取1號(hào)藥材粉末約3 g，精密稱(chēng)定，加入10倍量的甲醇∶0.5 %冰醋酸(75∶25)溶液，回流提取1 h，放冷過(guò)濾，濾液蒸干至無(wú)醇味再用乙酸乙酯萃取5次，每次10 mL，合并蒸干，用甲醇定容至2 mL，得樣品6溶液，備用。取樣品6溶液，13 000 r/min離心，取上清液進(jìn)樣，結(jié)果見(jiàn)圖6。

圖6 扁擔(dān)藤莖樣品6溶液HPLC色譜圖Fig.6 HPLC chromatogram of stem of Tetrastigma planicaule sample 6 solution

根據(jù)以上6種提取溶劑的考察結(jié)果，采用甲醇∶0.5 %冰醋酸(75∶25)溶液，回流提取1 h，放冷過(guò)濾，濾液蒸干至無(wú)醇味再用乙酸乙酯萃取5次，分離效果較好，含量較高，故選擇采用甲醇∶0.5 %冰醋酸(75∶25)溶液作為提取溶劑，乙酸乙酯作為萃取溶劑。

2.1.1.2 提取方法的選擇

取1號(hào)莖粉末3份，每份3 g，精密稱(chēng)定，加入10倍量的甲醇∶0.5 %冰醋酸(75∶25)溶液，分別采用冷浸法、回流提取法、超聲波提取法提取1 h，放冷過(guò)濾，濾液蒸干至無(wú)醇味再用乙酸乙酯萃取5次，每次10 mL，合并蒸干，用甲醇定容至2 mL，13 000 r/min離心，取上清液進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表2。結(jié)果表明：采用回流提取方法含量最高，故選用此方法。

表2 提取方法考察結(jié)果Tab.2 Investigation results of extraction method

2.1.1.3 提取次數(shù)的考察

取1號(hào)扁擔(dān)藤莖粉末約3 g，精密稱(chēng)定，加10倍量的甲醇∶0.5 %冰醋酸(75∶25)溶液，回流提取1 h，放冷過(guò)濾，濾液蒸至無(wú)醇味再用乙酸乙酯萃取，將乙酸乙酯部分蒸干，用甲醇定容至2 mL，13 000 r/min離心，取上清液作為提取第1次的供試品溶液。將上述藥渣再進(jìn)行1次上述同樣方法的提取，得到提取第2次的供試品溶液。從提取第2次的色譜圖中可看到，香草酸的色譜峰已經(jīng)接近與基線(xiàn)平，可知第二次已提取完全，結(jié)果見(jiàn)圖7和圖8。

圖7 扁擔(dān)藤莖HPLC色譜圖(回流提取第一次)Fig.7 HPLC chromatogram of stem of Tetrastigma planicaule (The first reflux extraction)

圖8 扁擔(dān)藤莖HPLC色譜圖(回流提取第二次)Fig.8 HPLC chromatogram of stem of Tetrastigma planicaule (The second reflux extraction)

2.1.2 正交試驗(yàn)優(yōu)選最佳提取工藝

在單因素考察的基礎(chǔ)上，以原兒茶酸和香草酸的含量作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，選擇不同提取溶劑比例A、料液比B、提取時(shí)間C為考察因素，采用 L9(34)表進(jìn)行正交試驗(yàn)，優(yōu)選出最佳的提取工藝。因素水平見(jiàn)表3，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表4，方差分析結(jié)果見(jiàn)表5。

表3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平表Tab.3 Factors and levels of orthogonal experiment

表4 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果L9(34)Tab.4 Design and results of orthogonal experiment L9(34)

表5 方差分析結(jié)果Tab.5 Results of variance analysis

從正交試驗(yàn)結(jié)果可知，影響原兒茶酸和香草酸含量的因素大小順序?yàn)椋篊>B>A，即提取時(shí)間>料液比>溶劑比例，由此可見(jiàn)提取時(shí)間對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響最大，且具有顯著性，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果綜合考慮，確定最佳提取工藝為A3B2C3：取適量的扁擔(dān)藤莖粉末，精密加入10倍量的甲醇∶0.5 %冰醋酸溶液(70∶30)溶液，回流提取2 h。

2.2 原兒茶酸和香草酸的含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件

色譜柱：熱電 Thermo Hypersil ODS C18(5 μm, 4.6 mm×250 mm)；流動(dòng)相：乙腈-0.1 %磷酸(6∶94)；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：370 nm；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：10.0 μL。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備

稱(chēng)取原兒茶酸對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定為6.68 mg，置于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度線(xiàn)，搖勻即得，備用；再稱(chēng)取香草酸對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定為1.82 mg，置于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度線(xiàn)，搖勻即得，備用。

2.2.3 供試品溶液的制備

按正交試驗(yàn)優(yōu)選的提取工藝制備。取扁擔(dān)藤藥材莖粉末約5 g，精密稱(chēng)定，精密加入10倍量的甲醇∶0.5 %冰醋酸(70∶30)溶液，回流提取2 h，蒸干至無(wú)醇味后再用乙酸乙酯萃取5次，每次10 mL，將乙酸乙酯部分合并蒸干，用2 mL甲醇溶解，即制成供試品溶液。

2.2.4 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)

分別精密吸取原兒茶酸對(duì)照品溶液、香草酸對(duì)照品溶液及供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定。結(jié)果表明原兒茶酸保留時(shí)間為9.54 min，香草酸保留時(shí)間為23.80 min，原兒茶酸、香草酸與供試品其他組分分離度良好(R>1.5)，理論塔板數(shù)按原兒茶酸和香草酸不低于5 000，色譜圖見(jiàn)圖9、圖10和圖11。

圖9 扁擔(dān)藤莖HPLC色譜圖Fig.9 HPLC Chromatogram of stem of Tetrastigma planicaule

圖10 原兒茶酸對(duì)照品HPLC色譜圖Fig.10 HPLC chromatogram of protocatechuic acid

圖11 香草酸對(duì)照品HPLC色譜圖Fig.11 HPLC chromatogram of vanillic acid

2.2.5 線(xiàn)性關(guān)系考察

精密吸取2.2.2節(jié)制備的原兒茶酸和香草酸對(duì)照品溶液各0.1、0.4、0.8、1.0、1.2、1.6 mL，分別置于5 mL的容量瓶中，加入甲醇定容至刻度，搖勻，再取6個(gè)不同濃度的對(duì)照品溶液各10 μL進(jìn)樣，按照2.2.1節(jié)的色譜條件測(cè)定峰面積。以對(duì)照品溶液進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)，分別得出原兒茶酸回歸方程為：Y=37.398 8X-11.896 0，r=0.999 7；原兒茶酸在進(jìn)樣量為13.76×10-2～213.76×10-2μg，呈良好的線(xiàn)性關(guān)系。香草酸回歸方程為：Y=35.929 6X-18.611 9,r=0.999 3；表明香草酸在進(jìn)樣量為3.64×10-2～58.24×10-2μg，呈良好的線(xiàn)性關(guān)系。具體見(jiàn)圖12和圖13。

圖12 原兒茶酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Fig.12 Standard curve of protocatechuic acid

圖13 香草酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Fig.13 Standard curve of vanillic acid

2.2.6 精密度試驗(yàn)

取1號(hào)扁擔(dān)藤莖藥材粗粉約5 g，精密稱(chēng)定，按照2.2.3節(jié)方法制備供試品溶液，精密吸取供試品溶液10 μL，按2.2.1節(jié)的色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定樣品中原兒茶酸和香草酸的峰面積。結(jié)果原兒茶酸和香草酸的峰面積RSD分別為1.58 %和2.70 %(n=6)，表明精密度較好，結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 扁擔(dān)藤莖精密度試驗(yàn)結(jié)果Tab.6 Result of precision tests in Tetrastigma planicaule (n=6)

2.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取1號(hào)扁擔(dān)藤莖藥材粗粉約5 g，精密稱(chēng)定，按2.2.3節(jié)制備供試品溶液，分別在0、2、4、6、8、16、24 h時(shí)精密吸取供試品溶液10 μL，注入高效液相色譜儀中，按2.2.1節(jié)的色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，考察其穩(wěn)定性。結(jié)果原兒茶酸和香草酸的峰面積RSD值分別為0.41 %和1.95 %，表明供試品溶液在24 h內(nèi)能保持穩(wěn)定，結(jié)果見(jiàn)表7。

表7 扁擔(dān)藤莖穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果Tab.7 Stability test of Tetrastigma planicaule (n=6)

2.2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

取1號(hào)扁擔(dān)藤莖粗粉約5 g，精密稱(chēng)定，共稱(chēng)取6份，按照2.2.3節(jié)制備供試品溶液，精密吸取供試品溶液10 μL，按2.2.1節(jié)的色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，得到原兒茶酸和香草酸的峰面積，并分別計(jì)算含量，結(jié)果原兒茶酸和香草酸的峰面積RSD分別為0.52 %和1.96 % (n=6)。表明重復(fù)性良好，結(jié)果見(jiàn)表8。

表8 扁擔(dān)藤藥材重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果Tab.8 Repeatability results of Tetrastigma planicaule (n=6)

2.2.9 加樣回收試驗(yàn)

取已知含量的1號(hào)扁擔(dān)藤莖藥材粗粉約2.5 g，精密稱(chēng)定，共6份，分別精密加入原兒茶酸20 μg、香草酸4 μg(加入量為樣品含量的80 %)，原兒茶酸25 μg、香草酸5 μg(加入量為樣品含量的100 %)、原兒茶酸30 μg、香草酸6 μg(加入量為樣品含量的120 %)，各平行3份，并按2.2.3節(jié)供試品溶液的制備方法進(jìn)行制備，按照2.2.1節(jié)色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，進(jìn)樣量為10 μL，分別測(cè)定原兒茶酸和香草酸的含量，計(jì)算加樣回收率。原兒茶酸和香草酸的平均加樣回收率為100.34 %和98.08 %，其相應(yīng)的RSD值分別為1.48 %和2.28 %，結(jié)果見(jiàn)表9。

表9 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果Tab.9 Results of recovery test (n=9)

2.2.10 樣品測(cè)定

分別取10個(gè)不同產(chǎn)地扁擔(dān)藤莖粉末各約5 g，精密稱(chēng)定，按照2.2.3節(jié)方法進(jìn)行提取和制備，13 000 r/min離心10 min，取上清液，分別吸取10 μL注入高效液相色譜儀，按照2.2.1節(jié)色譜條件下測(cè)定，計(jì)算樣品中原兒茶酸和香草酸的含量。結(jié)果見(jiàn)表10。

表10 不同產(chǎn)地扁擔(dān)藤莖含量測(cè)定結(jié)果Tab.10 Content of stem of Tetrastigma planicaule from different producing areas (n=3)

3 討論與小結(jié)

在對(duì)扁擔(dān)藤中原兒茶酸和香草酸提取工藝的考察過(guò)程中，首先對(duì)提取方法、提取溶劑和提取次數(shù)進(jìn)行了單因素考察，在此基礎(chǔ)上，再選擇提取時(shí)間、料液比、溶劑比例為考察因素，以原兒茶酸和香草酸的含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行正交試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果表明，三個(gè)因素對(duì)原兒茶酸和香草酸含量的影響大小為：提取時(shí)間>料液比>溶劑比例，確定了原兒茶酸和香草酸較優(yōu)的提取工藝。

酚酸類(lèi)成分是扁擔(dān)藤藥材的主要成分之一[8-10]，現(xiàn)代藥理研究表明，原兒茶酸和香草酸具有較好的藥理活性[11-15]，因此，在未明確扁擔(dān)藤的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)前，原兒茶酸和香草酸可作為扁擔(dān)藤質(zhì)量控制的指標(biāo)成分。本實(shí)驗(yàn)采用了高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定扁擔(dān)藤莖的原兒茶酸和香草酸的含量，進(jìn)行了方法學(xué)考察，符合《中華人民共和國(guó)藥典(2015年版)》要求，方法簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、快速，通過(guò)對(duì)10個(gè)不同產(chǎn)地的扁擔(dān)藤進(jìn)行含量測(cè)定，研究結(jié)果表明：不同產(chǎn)地的扁擔(dān)藤莖的含量差異較大，可能是不同產(chǎn)地環(huán)境中陽(yáng)光、溫度、濕度和采收的時(shí)間不同，影響了扁擔(dān)藤莖中原兒茶酸和香草酸的含量。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可為建立扁擔(dān)藤的質(zhì)量控制方法和進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用扁擔(dān)藤提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。