劉輝，童星

(1.佛山市海天調(diào)味食品股份有限公司，廣東 佛山 528000；2.廣東海天創(chuàng)新技術(shù)有限公司，廣東 佛山 528000)

食品在貯運過程中易發(fā)生油脂氧化導(dǎo)致食物色澤改變，產(chǎn)生腐臭味，破壞食品體系的穩(wěn)定性。有研究表明，在食品中添加抗氧化肽可抑制脂質(zhì)過氧化，防止食物酸敗，從而保持食品的營養(yǎng)價值及新鮮度[1]。

周芳等[2]研究豆豉發(fā)酵過程中的抗氧化值變化主要是由大豆蛋白變化引起的。王俊[3]將豆粕酶解后的抗氧化肽應(yīng)用于肉丸中，能有效抑制肉丸中脂肪和蛋白質(zhì)氧化。夏蓉等[4]研究花生醋中抗氧化成分主要來源于花生蛋白的水解，可有效保護(hù)花生醬的色澤。

大豆作為一種十分重要的經(jīng)濟(jì)作物，同時也是一種富含多種營養(yǎng)的天然補(bǔ)品，其生物學(xué)功能越來越受到重視[5]。大豆中的營養(yǎng)成分既包括多種人體必需氨基酸、礦物質(zhì)元素、蛋白質(zhì)、油脂、固醇和維生素E等初級代謝產(chǎn)物，還包括大豆異黃酮、皂甙、植物等次級代謝產(chǎn)物，豐富的營養(yǎng)物質(zhì)為大豆的開發(fā)提供了更多的應(yīng)用前景[6]。

大豆功能性成分主要分為兩大類：一類是以大豆異黃酮為代表的化學(xué)物質(zhì)；另一類是以水解大豆蛋白為代表的肽類。大豆異黃酮具有激素類性質(zhì)，其應(yīng)用受到極大限制[7]。因此，水解大豆蛋白的生物學(xué)功能受到更為廣泛的關(guān)注，本文主要綜述水解大豆蛋白中抗氧化肽的方法、抗氧化肽的結(jié)構(gòu)以及抗氧化主要機(jī)理。

1 大豆蛋白中抗氧化肽的獲取方法

1.1 酶解法

蛋白質(zhì)功能性改良方法中，酶水解是應(yīng)用最為廣泛的方法之一，其主要用于疏水蛋白乳化，增強(qiáng)蛋白質(zhì)營養(yǎng)價值[8-9]。Saito等[10]酶解大豆β-球蛋白和球蛋白后獲得兩種三肽抗氧化肽。Coscueta等[11]用Corolase PP酶水解脫脂大豆蛋白，獲得分子量<3 kDa的大豆肽具有很強(qiáng)的抗氧化活性。Castro等[12]采用多種微生物蛋白酶水解大豆分離蛋白，結(jié)果表明水解大豆分離蛋白肽抗氧化活性比水解前提高了7倍。Oliveira等[13]采用蛋白酶組合方法水解大豆分離蛋白能有效提高其抗氧化活性、乳化活性及起泡能力。酶的水解作用還要依靠不同物理和化學(xué)條件配合才能起到更好的作用。

1.2 化學(xué)法/物理法

化學(xué)法水解大豆蛋白多采用強(qiáng)酸或強(qiáng)堿法水解，由于反應(yīng)條件苛刻，易腐蝕設(shè)備等不利因素，化學(xué)方法已經(jīng)很少應(yīng)用于水解大豆獲得大豆肽。物理法水解大豆蛋白主要是利用物理條件配合蛋白酶水解，如pH、溫度、壓力等。Guan等[14]采用高靜壓技術(shù)配合蛋白酶水解大豆蛋白，其技術(shù)主要是利用高靜壓引發(fā)大豆蛋白構(gòu)象和結(jié)構(gòu)改變，同時降低在水解過程中的微生物污染，結(jié)果表明，在200 MPa水解4 h能有效提高大豆水解肽的抗氧化活力。Oliveria等對酶水解條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明，在45 ℃水解條件下，大豆蛋白的抗氧化能力最強(qiáng)，其中溫度對酶水解后抗氧化活性的影響大于pH對于酶水解后抗氧化活性的影響。

1.3 生物法

生物法發(fā)酵大豆蛋白產(chǎn)抗氧化肽的方法主要有兩種：第一種是通過微生物生長過程中產(chǎn)生的蛋白酶水解大豆，其和1.1中論述酶法相同，在此不贅述。第二種是以大豆蛋白為底物利用水解大豆蛋白后的小肽或氨基酸合成新的抗氧化肽。Amadou等[15]利用植物乳酸桿菌Lp6發(fā)酵脫脂大豆，獲得5種抗氧化活性較強(qiáng)的多肽。Chi等[16]研究芽孢桿菌、乳酸菌、酵母菌發(fā)酵脫脂大豆后產(chǎn)生生物抗氧化活性，其中芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)物的抗氧化活性最強(qiáng)，酵母菌和乳酸菌在發(fā)酵前后都沒有明顯改變抗氧化活性。Yang等[17]利用解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵脫脂大豆，分析大豆異黃酮、多酚以及分子量<3 kDa的肽，發(fā)現(xiàn)肽類能有效提高抗氧化活性。這也表明多肽的抗氧化活性，是受多種因素共同影響的結(jié)果，其中包括分子質(zhì)量、氨基酸組成和氨基酸序列[18]。

2 影響多肽抗氧化活性的因素

2.1 氨基酸組成

氨基酸組成對多肽抗氧化活性起到關(guān)鍵性作用，某些氨基酸是抗氧化肽的活性位點。此類氨基酸主要包括以下3種。

2.1.1 環(huán)類氨基酸

含苯環(huán)的氨基酸(如色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸)能夠為自由基提供質(zhì)子，減緩自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；此外，此類氨基酸能夠通過共振作用維持自身穩(wěn)定[19]。

2.1.2 酸性氨基酸

酸性氨基酸(如天冬氨酸和谷氨酸)帶負(fù)電，可以和金屬離子相互作用(如螯合作用)，形成復(fù)合物，抑制氧化。

2.1.3 堿性氨基酸

堿性氨基酸組氨酸由于咪唑基的降解，使得其具有自由基清除能力；賴氨酸是電子受體，能夠接受不飽和脂肪酸氧化過程中產(chǎn)生的自由基的電子[20]。

2.2 分子質(zhì)量

抗氧化肽的分子質(zhì)量是決定抗氧化活性的關(guān)鍵因素之一。大多數(shù)抗氧化活性的多肽含有2～20個氨基酸，其抗氧化活性遠(yuǎn)比它們的親本蛋白質(zhì)分子(20～50個氨基酸)具有更強(qiáng)的抗氧化活性。Moure等研究的豆渣蛋白水解產(chǎn)物的4個不同分子質(zhì)量組分(5～10 kDa、10～30 kDa、30～50 kDa和>50 kDa)中，低分子質(zhì)量組分(5～10 kDa)具有較高的抗氧化活性，然而分子質(zhì)量>10 kDa的組分表現(xiàn)出最弱的抗氧化活性[21]。類似地，Chen等[22]水解大豆7S蛋白，獲得6種多肽，其中前3種抗氧化活性最強(qiáng)，其分子量都<1 kDa，但是Val-Ile-Pro-Ala-Gly-Try-Pro序列無抗氧化活性，Chen等[23]利用化學(xué)合成方法分析相同分子量不同氨基酸序列對抗氧化活性的影響，結(jié)果表明氨基酸序列對抗氧化活性有關(guān)鍵作用。同時也說明抗氧化活性不僅與分子量有關(guān)，還有氨基酸序列有關(guān)。

2.3 氨基酸序列

除了存在特異性氨基酸之外，氨基酸在肽序列中的位置也是至關(guān)重要的。肽的氨基酸序列取決于蛋白質(zhì)來源、蛋白酶特異性、蛋白質(zhì)水解程度和水解條件。N端和C端氨基酸對其抗氧化活性有很大影響，N端的疏水氨基酸能夠增加肽的抗氧化活性主要為纈氨酸、亮氨酸、甘氨酸[24]。C端氨基酸常為色氨酸、谷氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸、纈氨酸和酪氨酸[25]。組氨酸在N端主要通過螯合金屬離子方式展現(xiàn)抗氧化能力，而在C端是以清除自由基方式展現(xiàn)抗氧化能力[26]。在三肽的C端含有色氨酸和酪氨酸，具有很強(qiáng)的自由基清除能力，如果三肽中含有半胱氨酸同樣具有很強(qiáng)的自由基清除能力。在大分子蛋白中半胱氨酸是以SH形式存在，其抗氧化活性明顯高于不含有—SH的[27]。

3 主要作用機(jī)理

3.1 抗氧化肽的作用機(jī)理

抗氧化肽能起到抗氧化作用是因為低分子質(zhì)量的抗氧化肽比其龐大的親本蛋白質(zhì)更容易接近自由基，并能抑制自由基介導(dǎo)的過氧化?？寡趸那宄趸?ROS)和自由基的機(jī)理主要有：(1)通過抗氧化肽的肽鍵和羥基提供氫原子或電子，清除缺少氫離子或電子的自由基，如ROS和自由基，以消除其對生物分子的破壞作用；(2)通過抑制某些促氧化酶和螯合參與催化自由基生成的過渡金屬離子來抑制ROS和自由基形成[28]?？寡趸耐ㄟ^抑制自由基轉(zhuǎn)化為過氧化氫，通過內(nèi)源性抗氧化劑(包括超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、谷胱甘肽)能夠?qū)⑵浞纸鉃闊o害的代謝產(chǎn)物，如水和氧[29]，例如，Szeto Schiller-31(SS-31)肽可滲透細(xì)胞，靶向線粒體，保護(hù)線粒體免受細(xì)胞氧化[30]。SS肽的功能歸因于它們獨特的結(jié)構(gòu)域，并含有芳香族和堿性氨基酸[31]。一些抗氧化肽的獨特結(jié)構(gòu)域使得它們比其他親脂性抗氧化劑(如維生素E)更能有效清除細(xì)胞中的自由基[32]。

目前，抗氧化肽的作用機(jī)理與結(jié)構(gòu)關(guān)系依據(jù)處于研究階段，Jia等[33]認(rèn)為具有兩親性的α-螺旋是抗氧化的主要結(jié)構(gòu)。Duan等[34]認(rèn)為β-折疊是抗氧化肽體現(xiàn)抗氧化性的主要結(jié)構(gòu)。Zou和Nwachukwu等[35]認(rèn)為抗氧化肽的二級結(jié)構(gòu)，如：α-螺旋、β-折疊對于抗氧化性的影響相當(dāng)微弱，一般抗氧化肽含有4～6個氨基酸，其表現(xiàn)二級結(jié)構(gòu)并不明顯，因此其抗氧化機(jī)制在很大程度上取決于其氨基酸的組成。

3.2 氨基酸抗氧化作用機(jī)理

多肽由不同種類的氨基酸組成，多肽發(fā)揮抗氧化活性氨基酸起到主要作用，氨基酸抗氧化活性的特征主要依靠其化學(xué)基團(tuán)作用，疏水基團(tuán)能有效地抑制過氧化氫基，而酸性基團(tuán)及其類似物能有效抑制過氧化亞硝基[36]。各種氨基酸抗氧化作用機(jī)理見表1。

表1 氨基酸抗氧化作用機(jī)理Table 1 The antioxidant mechanism of amino acids

氨基酸抗氧化性與其性質(zhì)、電荷、堿基、芳香基團(tuán)和疏水性有關(guān)鍵性密切的關(guān)系，其自身的構(gòu)象也會影響其抗氧化的性質(zhì)[42]。Chen等研究發(fā)現(xiàn)D-His替換L-His導(dǎo)致其抗氧化活性發(fā)生顯著性變化。他們認(rèn)為咪唑基團(tuán)的位置是抗氧化活性的關(guān)鍵。氨基酸的抗氧化活性之間也存在協(xié)同和拮抗作用，并不是將抗氧化活性強(qiáng)的氨基酸組合后，其抗氧化活性很強(qiáng)，因此對于氨基酸抗氧化的性質(zhì)值得持續(xù)關(guān)注[43]。

4 結(jié)論與展望

目前，很多天然原料都是抗氧化成分的來源，例如：金絲小棗、雞樅菌、洋蔥、玉米等[44-47]，天然原料的應(yīng)用不僅清潔標(biāo)簽，使產(chǎn)品更具有自身特色，而且提升相應(yīng)產(chǎn)品的功能性。抗氧化肽也可作為獨立產(chǎn)品用作保健食品，劉恩岐等[48]應(yīng)用黑豆抗氧化肽明顯緩解運動由自由基引發(fā)的體力疲勞。豆類為原料提供蛋白，相對于其他蛋白質(zhì)，具有價格低、氨基酸種類豐富、蛋白質(zhì)組成明確等優(yōu)點。因此，水解大豆蛋白產(chǎn)生抗氧化肽在大范圍工業(yè)化應(yīng)用中具有巨大的應(yīng)用潛力。酶法和生物法是最有效的獲得抗氧化肽的方法，而酶法因其易質(zhì)控、目標(biāo)肽單一、時間短、作用快等特點，越來越受到工業(yè)化生產(chǎn)的重視，在未來很有可能替代生物發(fā)酵法成為大豆抗氧化肽的工業(yè)化生產(chǎn)方法的最佳方法。目前抗氧化肽還存在一些問題有待解決：抗氧化肽中疏水性氨基酸具有苦澀味，會影響其在食品中的應(yīng)用；抗氧化肽加入食品后與食品中其他成分反應(yīng)，影響其保質(zhì)期；大部分抗氧化肽研究依然屬于實驗室階段。隨著生物信息學(xué)以及基因編碼技術(shù)的發(fā)展，研究人員會運用更多技術(shù)改良抗氧化肽，并通過表達(dá)來實現(xiàn)抗氧化肽在食品中的應(yīng)用。