顏 衛(wèi) , 傅宏慶 , 李嘯雪 , 盧賢忠 , 徐學(xué)良 , 巢鈺陽(yáng)

(江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院 寵物科技學(xué)院，江蘇 泰州 225300)

食源性疾病是食品安全的主要問(wèn)題，世界衛(wèi)生組織(WHO)將食源性疾病定義為“通過(guò)攝食進(jìn)入人體導(dǎo)致人體患感染性或中毒性的疾病”。WHO估算每年有多達(dá) 6 億人因食用受到污染的食品而生病，所有食源性疾病中58.2%由細(xì)菌引起[1]。食源性病原菌中有許多是人獸共患病原菌。WHO及世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)指出，引起人致病的重要食源性人獸共患細(xì)菌主要包括沙門菌、大腸桿菌 O157∶H7、單核細(xì)胞增生性李斯特菌、空腸彎曲菌等。本試驗(yàn)從食品、人群、動(dòng)物3個(gè)維度對(duì)沙門菌、彎曲菌、單核細(xì)胞增生性李斯特菌3種食源性人獸共患細(xì)菌的流行現(xiàn)狀進(jìn)行監(jiān)測(cè)，及時(shí)的風(fēng)險(xiǎn)預(yù)警具有重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義。

1 材料與方法

1.1 培養(yǎng)基與試劑 緩沖蛋白胨水(BPW)、亞硒酸鹽胱氨酸增菌液(SC)、四硫磺酸鈉煌綠增菌液(TTB)、三糖鐵瓊脂(TSI)、腦心浸液肉湯(BHI)、科瑪嘉顯色培養(yǎng)基、水解酪蛋白培養(yǎng)基(MH)、WS瓊脂、布氏肉湯、Carry-Blair運(yùn)送培養(yǎng)基，均購(gòu)自北京陸橋生物技術(shù)有限責(zé)任公司；CCDA、李斯特選擇培養(yǎng)基OXFORD，購(gòu)自O(shè)XOID公司；李斯特增菌培養(yǎng)基，購(gòu)自BD公司；微氧產(chǎn)氣袋，購(gòu)自MGC公司；綿羊全血，購(gòu)自蘭州民海生物工程有限公司；Buffer、dNTPs、Taq酶、低分子量DNA Marker，均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。

1.2 樣品來(lái)源 2018年3月—2019年2月在江蘇泰州地區(qū)采集人源樣本296份(257份為醫(yī)院腹瀉患者糞便樣本、39份為腦脊液樣本)、動(dòng)物源樣本544份(285份雞群肛拭樣本、259份羊群肛拭樣本)、食品源樣本503份，共1 343份樣品進(jìn)行沙門菌、彎曲菌、單核細(xì)胞增生性李斯特菌的檢測(cè)。棉拭樣品用Cary-Blair運(yùn)送培養(yǎng)基運(yùn)送，其余樣品置于4 ℃冰盒6 h內(nèi)送達(dá)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。

1.3 病原菌的分離

1.3.1 沙門菌的分離 腹瀉患者的糞便樣本按國(guó)標(biāo)方法進(jìn)行常規(guī)檢驗(yàn)，主要步驟為：約10 g糞樣于10 mL SC增菌液中37 ℃增菌18～24 h，WS平板分離培養(yǎng)24 h，疑似菌落接種TSI斜面培養(yǎng)18～24 h，可疑菌苔進(jìn)行玻板凝集試驗(yàn)，陽(yáng)性者做生化鑒定。雞群泄殖腔樣本接種5 mL TTB增菌液42 ℃培養(yǎng)24 h，科瑪嘉顯色培養(yǎng)基37 ℃分離培養(yǎng)24 h，挑取紫色單菌落純培養(yǎng)后做生化鑒定。食源樣本參照GB 4789.4—2010《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 沙門菌檢驗(yàn)》進(jìn)行分離。

1.3.2 彎曲菌的分離 Carry-Blair培養(yǎng)基中的棉拭樣本、食源樣本1 g剪碎，加入9 mL布氏肉湯(含抗生素和生長(zhǎng)促進(jìn)劑)，厭氧培養(yǎng)罐42 ℃搖床培養(yǎng)24 h，CCDA平板42 ℃培養(yǎng)24～48 h，挑選濕潤(rùn)、灰白色、有金屬光澤的菌落3～5個(gè)，溶于50 μL超純水，隔水煮沸20 min后取出置于冰上，8 000 r/min離心5 min，取上清液進(jìn)行PCR檢測(cè)。

1.3.3 單核細(xì)胞增生性李斯特菌的分離 Carry-Blair培養(yǎng)基中的棉拭樣本、食源樣本1 g剪碎，加入9 mL LEB中培養(yǎng)24 h，OXFORD選擇培養(yǎng)培養(yǎng)24 h， 挑選細(xì)小、濕潤(rùn)、黑色的疑似菌落BHI過(guò)夜純培養(yǎng)，溶菌酶-蛋白酶K法提取菌液的基因組DNA進(jìn)行PCR檢測(cè)。

1.4 病原菌的鑒定

1.4.1 沙門菌的鑒定 純培養(yǎng)物首先進(jìn)行生化鑒定，包括糖發(fā)酵試驗(yàn)、枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)、硫化氫試驗(yàn)、尿素試驗(yàn)，生化鑒定陽(yáng)性的菌株采用熱裂解法制備菌株DNA模板后擴(kuò)增保守基因invA， 目的擴(kuò)增片段為284 bp。擴(kuò)增體系25 μL，其中ddH2O 17.5 μL、10×PCR Buffer 2.5 μL、Taq酶2 μL、 10 μmol/L引物1 μL、DNA模板1 μL。擴(kuò)增程序：93 ℃ 5 min；93 ℃ 30 s、65 ℃ 30 s、72 ℃ 45 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。

1.4.2 彎曲菌的鑒定 參照何蕊等[2]的方法，選取彎曲菌屬16S rRNA基因、空腸彎曲菌mapA基因、結(jié)腸彎曲菌CeuE基因設(shè)計(jì)引物。PCR體系中各成分的量為：10×Buffer 2.5 μL，dNTPs 3 pmol，16S rRNA的引物分別為20 pmol，mapA引物，CeuE引物各為37.5 pmol，模板溶液2 μL，Taq酶0.2 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃ 10 min；95 ℃ 30 s，59 ℃ 90 s，72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min?？漳c彎曲菌在857 bp 和589 bp處分別出現(xiàn)屬特異性條帶和種特異性條帶，結(jié)腸彎曲菌在857 bp和462 bp處分別出現(xiàn)屬特異性條帶和種特異性條帶。

1.4.3 單核細(xì)胞增生性李斯特菌的鑒定 參照周曉輝等[3]的方法，擴(kuò)增Lm毒力基因溶血素基因hly，目的擴(kuò)增片段850 bp。PCR體系中各成分的量：10×Buffer 2.5 μL，MgCl21.5 μL，dNTPs 5 pmol，hly引物各10 pmol，模板DNA 3 μL，Taq酶0.2 μL，去離子水14.8 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃ 2 min；95 ℃ 10 s， 60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。

2 結(jié)果

2.1 人源樣本病原菌的監(jiān)測(cè) 296份人源樣本中39份為醫(yī)院腦脊液樣本，257份為醫(yī)院腹瀉患者的糞便樣本。腦脊液樣本未分離到單核細(xì)胞增生性李斯特菌，腹瀉患者樣本分離到沙門菌和彎曲菌共16株，陽(yáng)性率為6.23%，其中沙門菌4株，陽(yáng)性率為1.56%，空腸彎曲菌10株，陽(yáng)性率為3.89%，結(jié)腸彎曲菌2株，陽(yáng)性率為0.78%。124份5歲以下嬰幼兒樣品中分離到病原菌9株，陽(yáng)性率為7.26%，其中沙門菌1株，陽(yáng)性率為0.81%，空腸彎曲菌7株，陽(yáng)性率為5.65%，結(jié)腸彎曲菌1株，陽(yáng)性率為0.81%。133份6歲及以上腹瀉患者樣本中分離到病原菌7株，陽(yáng)性率為5.26%，其中沙門菌3株，空腸彎曲菌3株，陽(yáng)性率均為2.26%，結(jié)腸彎曲菌1株，陽(yáng)性率為0.75%(見(jiàn)表1)。不同時(shí)期的樣品監(jiān)測(cè)結(jié)果顯示，3～5月分離到沙門菌和彎曲菌各1株，陽(yáng)性率為3.23%；6～8月分離到彎曲菌4株，包括3株空腸彎曲菌和1株結(jié)腸彎曲菌，陽(yáng)性率為8.70%；9～11月分離到7株病原菌，包括1株沙門菌、1株結(jié)腸彎曲菌和5株空腸彎曲菌，陽(yáng)性率為9.59%；12月到次年2月分離到3株病原菌，包括2株沙門菌和1株空腸彎曲菌，陽(yáng)性率為3.95%(見(jiàn)表2)。

表1 不同年齡腹瀉患者樣本病原菌監(jiān)測(cè)結(jié)果Table 1 The results of pathogenic bacteria in diarrhea patients of different ages

表2 不同時(shí)期人源樣本病原菌監(jiān)測(cè)結(jié)果Table 2 The results of pathogenic bacteria in human samples in different periods

2.2 動(dòng)物源樣本病原菌的監(jiān)測(cè) 544份動(dòng)物源樣本中有259份為羊群肛拭樣本，分離到3株單核細(xì)胞增生性李斯特菌，陽(yáng)性率為1.16%，285份雞群肛拭樣本分離到病原菌52株，陽(yáng)性率為18.25%。雞群樣本中病雞樣本59份，分離到病原菌20株，包括5株沙門菌、14株空腸彎曲菌和1株結(jié)腸彎曲菌，陽(yáng)性率為33.90%；健康種雞樣本33份未分離到病原菌；健康雛雞樣本67份分離到病原菌9株，包括2株沙門菌和7株空腸彎曲菌，陽(yáng)性率為13.43%；健康成年雞樣本126份分離到病原菌23株，包括5株沙門菌、17株空腸彎曲菌和1株結(jié)腸彎曲菌，陽(yáng)性率為18.25%(見(jiàn)表3)。

表3 雞群樣本病原菌監(jiān)測(cè)結(jié)果Table 3 The results of pathogenic bacteria in chicken samples

2.3 食源樣本病原菌的監(jiān)測(cè) 503份食源樣本共分離到病原菌46株，包括15株沙門菌、8株空腸彎曲菌、3株結(jié)腸彎曲菌和20株單核細(xì)胞增生性李斯特菌，陽(yáng)性率為9.15%。其中市場(chǎng)雞肉樣本75份，分離到病原菌15株，包括6株沙門菌、7株空腸彎曲菌、1株結(jié)腸彎曲菌和1株單核細(xì)胞增生性李斯特菌，陽(yáng)性率為20%；市場(chǎng)雞肉樣本67份，分離到病原菌6株，包括4株沙門菌、1株空腸彎曲菌和1株單核細(xì)胞增生性李斯特菌，陽(yáng)性率為8.96%；市場(chǎng)豬肉樣本87份，分離到病原菌14株，包括4株沙門菌、1株結(jié)腸彎曲菌和9株單核細(xì)胞增生性李斯特菌，陽(yáng)性率為16.09%；超市豬肉樣本64份，分離到病原菌6株，包括1株沙門菌和5株單核細(xì)胞增生性李斯特菌，陽(yáng)性率為9.38%；市場(chǎng)蔬菜樣本63份，分離到1株結(jié)腸彎曲菌，陽(yáng)性率為1.59%；市場(chǎng)淡水魚(yú)蝦樣本76份，分離到2株單核細(xì)胞增生性李斯特菌，陽(yáng)性率為2.63%；熟肉樣本71份，分離到2株單核細(xì)胞增生性李斯特菌，陽(yáng)性率為2.82%(見(jiàn)表4)。

表4 食源樣本病原菌監(jiān)測(cè)結(jié)果Table 4 The results of pathogenic bacteria in food samples

3 討論

2018 年泰州市食源性致病菌的監(jiān)測(cè)結(jié)果表明:沙門菌、彎曲菌和單核細(xì)胞增生性李斯特菌在自然界中廣泛存在，人群、動(dòng)物群和食品中均存在一定程度的感染或污染。沙門菌寄生于宿主腸道內(nèi)，可引起家禽出現(xiàn)傷寒、副傷寒、雞白痢等疾病，還可通過(guò)污染的肉類、禽蛋類、蔬菜等食物引起人沙門菌感染，沙門菌進(jìn)入腸道后大量繁殖，引起腸黏膜發(fā)炎，大量活菌釋放的內(nèi)毒素可引起機(jī)體中毒。全球每年有超過(guò) 1億人感染沙門菌，其中超過(guò) 15 萬(wàn)人會(huì)死亡[4]。作為人類感染性腹瀉最為常見(jiàn)的腸道致病菌之一，至今已有2 500多種血清型被發(fā)現(xiàn)[5]。本試驗(yàn)在腹瀉人群樣本中分離到4株沙門菌，陽(yáng)性率為1.56%。不同類型的雞群樣本中分離到12株沙門菌，陽(yáng)性率為4.21%，病雞樣本的分離率最高為8.47%，其次健康成年雞的分離率為3.97%，健康雛雞的分離率為2.99%，健康種雞由于長(zhǎng)期凈化的結(jié)果或者樣品采集量不夠大未分離到沙門菌。本次食品樣本中共檢出15株沙門菌，污染率為2.98%，沙門菌是引起當(dāng)今全球食物中毒病例最多的致病菌[6]，食品污染不可忽視。本次監(jiān)測(cè)到的沙門菌污染主要集中在肉制品，市場(chǎng)雞肉污染率最高達(dá)8.00%，其次超市雞肉為5.97%、市場(chǎng)豬肉為4.60%、超市豬肉為1.56%。從健康成年雞為3.97%的分離率到市場(chǎng)雞肉8.00%的污染率，提示了進(jìn)一步加強(qiáng)運(yùn)輸管理和市場(chǎng)衛(wèi)生檢疫的必要性。

彎曲菌廣泛分布于自然界，是許多畜禽的寄生菌，可引起動(dòng)物腹瀉、牛羊流產(chǎn)、雛雞壞死性肝炎，此外，可通過(guò)動(dòng)物、食物、水等傳播并引起人的感染，導(dǎo)致人出現(xiàn)發(fā)熱、急性腸炎、格林巴利綜合征等疾病。彎曲菌是重要的腹瀉病原菌之一，尤其引起嬰幼兒腹瀉[7]。本試驗(yàn)調(diào)查結(jié)果顯示，5歲以下嬰幼兒患者樣本中空腸彎曲菌的陽(yáng)性率達(dá)到5.65%，而6歲以上腹瀉患者的陽(yáng)性率為2.26%，有顯著差異，這就進(jìn)一步提示了5歲以下兒童是彎曲菌(尤其是空腸彎曲菌)的主要感染者或者是帶菌者。不同時(shí)期人源樣本致病菌的監(jiān)測(cè)結(jié)果提示，夏季、秋季的感染率高于其他時(shí)期。人類彎曲菌主要來(lái)源于家禽，尤其是雞群。雞群285份樣本監(jiān)測(cè)結(jié)果顯示，病雞的陽(yáng)性率最高，空腸彎曲菌陽(yáng)性率達(dá)到23.73%、結(jié)腸彎曲菌陽(yáng)性率為1.69%，健康雛雞空腸彎曲菌的陽(yáng)性率為10.45%，成年雞空腸彎曲菌的陽(yáng)性率為13.49%。雞群中彎曲菌的來(lái)源及影響菌體定殖的因素主要包括其他動(dòng)物(家畜、蒼蠅、寵物等)、飼養(yǎng)人員、環(huán)境、設(shè)備、飲用水等，做好雞場(chǎng)的環(huán)境管控、做好夏季的滅蠅工作、遵守生物安全程序、定期消毒運(yùn)輸包裝箱等對(duì)于降低養(yǎng)殖環(huán)節(jié)彎曲菌的感染很有必要。503份食源樣本空腸彎曲菌、結(jié)腸彎曲菌的陽(yáng)性率分別為1.59%、0.60%，市場(chǎng)雞肉樣本中空腸彎曲菌的污染率最高，達(dá)到9.33%，顯著高于其他樣本，顯示雞肉是食源性彎曲菌風(fēng)險(xiǎn)來(lái)源的主要食品品種和項(xiàng)目，加強(qiáng)禽類及禽肉產(chǎn)品的食品安全管理是控制彎曲菌感染的重要環(huán)節(jié)。超市冷凍雞肉彎曲菌的污染率為1.49%，顯著低于市場(chǎng)雞肉的污染率，主要是因?yàn)閺澢鷮?duì)低溫較為敏感，低于30 ℃便不再生長(zhǎng)，因此冷凍處理是降低禽肉表面彎曲菌污染水平的一種實(shí)用且有效的方法，可通過(guò)低溫儲(chǔ)存、運(yùn)輸降低肉品表面彎曲菌數(shù)量。

單核細(xì)胞增生性李斯特菌是一種兼性胞內(nèi)寄生菌，動(dòng)物的感染主要與食用污染的飼料有關(guān)，癥狀以中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染為主，病初精神沉郁、食欲不振、發(fā)熱，幾天后會(huì)出現(xiàn)腦膜炎癥狀。病原菌可經(jīng)過(guò)污染農(nóng)場(chǎng)、食品加工、銷售傳染給人，引起免疫力低下人群如新生兒、老年人、孕婦等出現(xiàn)腦膜炎、敗血癥、流產(chǎn)及多器官功能障礙等，雖然發(fā)病率較低，但致死率可達(dá)20%～30%。在國(guó)內(nèi)，單增李斯特菌暴發(fā)次數(shù)不多，多為零星散發(fā)，然而這一病原菌經(jīng)常在各省市的市售食品中得到分離[8]。本試驗(yàn)從動(dòng)物源259份羊群樣本分離到3株單核細(xì)胞增生性李斯特菌，陽(yáng)性率為1.16%。259份羊群樣本中有68份采自小養(yǎng)殖戶，而3份陽(yáng)性樣本均來(lái)自小養(yǎng)殖戶，采樣過(guò)程中發(fā)現(xiàn)小養(yǎng)殖戶環(huán)境管理粗放，糞污處理不及時(shí)，場(chǎng)地沒(méi)有定期消毒，存在羊與家禽混合飼養(yǎng)的情況；其余的191份羊群樣品采自江蘇某生態(tài)農(nóng)業(yè)有限公司，該公司養(yǎng)殖場(chǎng)區(qū)污道、凈道、排污、排水分離清晰，糞污處理設(shè)施、消毒設(shè)施齊全，飼料質(zhì)量過(guò)關(guān)，未分離到單核細(xì)胞增生性李斯特菌。由此可見(jiàn)，養(yǎng)殖場(chǎng)環(huán)境的精細(xì)化管理、定期消毒是保證動(dòng)物群健康的有效措施。食源503份樣本中共分離到20株單核細(xì)胞增生性李斯特菌，污染率為3.98%。市場(chǎng)豬肉的污染率最高達(dá)10.34%，其次超市豬肉為7.81%、熟肉制品為2.82%、市場(chǎng)淡水魚(yú)蝦為2.63%、超市雞肉為1.49%、市場(chǎng)雞肉為1.33%。單核細(xì)胞增生性李斯特菌可通過(guò)食品引起人的感染，尤其是免疫力低下人群往往表現(xiàn)為中樞感染。與其他食源性人獸共患病原菌不同，單核細(xì)胞增生性李斯特菌在 4 ℃的條件下仍可生長(zhǎng)繁殖,因此它是冷藏類食品中威脅人類健康的主要病原菌，其潛在的危害性應(yīng)引起人們的足夠重視[9]。