楊 蓉，趙懿寧，楊文靜，趙善民，柴宇靜，張成財，袁 征，崔淑芳#

（1. 海軍軍醫(yī)大學基礎醫(yī)學院實驗動物學教研室，上海 200433；2. 上海市楊浦區(qū)精神衛(wèi)生中心醫(yī)技科，上海 200090；3. 軍事科學院軍事醫(yī)學研究院實驗動物中心，北京 100071）

隨著核能和核技術(shù)在醫(yī)療衛(wèi)生、工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、科學研究和國防中大量應用，輻射的危害已不容忽視。目前，輻射耐受相關(guān)研究主要采用小鼠和大鼠、非人靈長類動物、小型豬、犬、秀麗隱桿線蟲等進行[1-4]，但上述模型動物并不具有輻射耐受特性，只是單純作為人類的替代進行輻射損傷的模擬，無法對輻射損傷防護提供有利的參考。裸鼴鼠是一種具有多種生物學特性的新型實驗動物，如抗衰老、抗腫瘤、耐低氧、耐疼痛等特性。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，相較于小鼠、大鼠等動物，裸鼴鼠具有更強的輻射耐受能力[5]，利用裸鼴鼠或許有助于更好地探索抗輻射相關(guān)機制。

電離輻射是由直接或間接電離粒子或二者混合組成的波長小于100 nm的電磁輻射，能使受作用物質(zhì)發(fā)生電離現(xiàn)象。電離輻射的特點是波長短、頻率高、能量高的射線。輻射可對機體多種組織器官造成損傷。作為機體最大免疫器官的脾臟，對輻射損傷較為敏感。前人研究發(fā)現(xiàn)，輻射會導致小鼠脾臟組織內(nèi)氧化應激失衡[6]，脾臟超微結(jié)構(gòu)改變[7]，脾臟淋巴細胞功能異常[7-9]，脾臟全基因組DNA甲基化水平降低[10]，脾臟細胞周期和凋亡節(jié)律改變[11]。本課題組前期研究結(jié)果表明，裸鼴鼠與小鼠的脾臟在解剖學、組織學和超微結(jié)構(gòu)上都具有較大的差異[12]。本研究觀察10 Gy60Coγ射線照射對裸鼴鼠脾臟功能的影響，為研究裸鼴鼠耐輻射機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

18月齡健康雄性裸鼴鼠28只，由海軍軍醫(yī)大學實驗動物學教研室生產(chǎn)，飼養(yǎng)于屏障設施[SYXK（滬）2017-0004]。

1.2 實驗動物分組與實驗處理

28只裸鼴鼠隨機分為2組，分別為對照組7只和實驗組21只。實驗組裸鼴鼠給予一次性全身60Co γ射線輻射，輻射劑量率為1.163 Gy/min，輻射時間為8.6 min，總輻射劑量為10 Gy，由海軍軍醫(yī)大學輻照中心完成。

1.3 主要儀器設備及試劑

熒光標記流式用抗體購自美國Biolegend公司；氧化應激指標測定試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 脾臟淋巴細胞的分離 分別取對照組、實驗組輻照后7 d、14 d和21 d各3只裸鼴鼠，通過腹腔注射0.3%戊巴比妥鈉麻醉裸鼴鼠，打開胸腔，取脾臟，迅速置于預冷的PBS液中剪碎，研磨脾臟獲取細胞懸液，經(jīng) 200目篩網(wǎng)過濾細胞懸液，離心（1 500 r/min，4℃）5min，棄上清液；加入紅細胞裂解液5mL混勻，靜置5 min，離心（1 500 r/min，4℃）5min棄上清液；用5 mLPBS清洗2次，每次離心（1500 r/min，4℃）5 min 后棄上清液；用PBS 將其制成細胞懸液，并調(diào)整細胞密度至 1×106個/mL，用于后續(xù)檢測。

1.4.2 B細胞亞群的檢測 取100 μL淋巴細胞懸液，加入 1 μL FITC 抗小鼠 CD3 和 1 μL APC 抗小鼠 CD19，細胞熒光染色30 min。設置單染及空白對照管；加入PBS1mL，振蕩混勻，1 500 r/min 離心2 min，去上清液；加入PBS 200μL，振蕩懸浮細胞，進行流式檢測。

1.4.3 巨噬細胞亞群的檢測 取100 μL淋巴細胞懸液，加入1 μL PE 抗小鼠 CD11b，細胞熒光染色30 min。設置空白對照管；加入PBS 1 mL，振蕩混勻，1 500 r/min 離心2 min，去上清液；加入PBS 200 μL，振蕩懸浮細胞，進行流式檢測。

1.4.4 脾臟組織氧化應激水平檢測 分別取對照組、實驗組輻照后7 d、14 d和21 d各4只裸鼴鼠，通過腹腔注射0.3%戊巴比妥鈉麻醉裸鼴鼠，迅速打開胸腔，取脾臟，剪取0.1g脾臟組織，經(jīng)40 μm孔徑篩網(wǎng)研磨過濾后加入1 mL裂解液，12 000×g，4 ℃離心10 min，取上清液用于檢測丙二醛（malondialdehyde，MDA）、總抗氧化能力（total antioxidative capacity，T-AOC）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）和氧化型谷胱甘肽（oxidative glutathione，GSSG）含量，檢測步驟嚴格參照試劑盒說明書。

1.5 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 輻射對裸鼴鼠脾臟免疫細胞的影響

從圖1、表1可見，裸鼴鼠經(jīng)10 Gy60Co γ射線全身照射后，與對照組相比較，輻照后7 d裸鼴鼠脾臟組織中CD3-CD19+B淋巴細胞的比例有輕微下降，差異沒有統(tǒng)計學意義，但輻照后14 d、21 d顯著高于對照組（P＜0.01）。輻照后7 d、14 d、21 d 裸鼴鼠脾臟中CD11b+巨噬細胞的比例顯著高于對照組（P＜0.01），表明輻照未對裸鼴鼠脾臟組織的免疫系統(tǒng)造成損傷。

2.2 輻射對裸鼴鼠脾臟氧化應激水平的影響

與對照組相比較，輻照后7 d 脾臟組織中MDA含量明顯升高（P＜0.05）；隨著輻照時間延長，脾臟組織中MDA含量仍在增加，輻照后21 d 顯著高于對照組（P＜0.01）。輻照后7d脾臟組織中GSH與GSSG含量均有輕微降低，但與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；輻照后14 d、21 d GSH與GSSG含量均明顯降低（P＜0.05）。T-AOC水平于輻照后7d和14 d均顯著降低（P＜0.01），輻照后21 d有所上升，明顯高于輻照后7 d和14 d（P＜0.01），但仍低于對照組（P＜0.01）（表2）。

圖 1 流式細胞術(shù)檢測裸鼴鼠脾臟免疫細胞Figure 1 Flow cytometry tests for immune cells in spleen of naked mole rats

表 1 輻射對裸鼴鼠脾臟免疫細胞的影響Table 1 Effects of radiation on immune cells in spleen of naked mole rats

表 2 輻射對裸鼴鼠脾臟氧化應激水平的影響Table 2 Effects of radiation on oxidative stress in spleen of naked mole rats

3 討論

脾臟是機體最大的免疫器官，是成熟淋巴細胞定居的場所。Paranich等[13]發(fā)現(xiàn)，小鼠脾臟細胞在2 Gy γ射線照射后開始失去功能活性和形態(tài)結(jié)構(gòu)特征，且隨著輻射劑量的增加，這些變化過程越明顯。淋巴細胞是對輻射最敏感的細胞群之一，是放射損傷早期診斷的重要參考指標。Anderson等[14]發(fā)現(xiàn)電離輻射能引起免疫系統(tǒng)和淋巴細胞的嚴重損傷；Harrington 等[15]發(fā)現(xiàn)電離輻射能引起 T、B細胞迅速減少，對絲裂原的反應能力明顯降低；何穎等[16]研究發(fā)現(xiàn)，1 Gy60Coγ射線全身照射24 h后，小鼠脾臟B淋巴細胞比例顯著降低，說明電離輻射導致小鼠脾臟B淋巴細胞數(shù)量減少，輻射對小鼠免疫功能造成了損傷。本課題組預實驗發(fā)現(xiàn)，輻照后15 d內(nèi)全部小鼠陸續(xù)死亡。本研究結(jié)果顯示，輻照后7 d裸鼴鼠脾臟 B 淋巴細胞比例有輕微下降，但輻照后14 d、21 d裸鼴鼠脾臟B淋巴細胞比例均明顯高于對照組；與對照組相比，輻照后巨噬細胞比例明顯升高，提示輻照后裸鼴鼠脾臟免疫系統(tǒng)可以做出相應的免疫應答，表明輻照未對裸鼴鼠脾臟造成嚴重損傷，不影響其發(fā)揮免疫應答功能。

脂質(zhì)過氧化代謝產(chǎn)物MDA的含量反映活性氧在體內(nèi)的積累情況。GSH和GSSG作為機體內(nèi)重要的抗氧化和自由基清除劑，反映機體清除活性氧的能力。左麗麗等[17]發(fā)現(xiàn)，小鼠經(jīng)6Gy的60Co γ射線照射后，其脾臟組織MDA含量顯著增加，表明6 Gy的輻射劑量導致小鼠脾臟組織產(chǎn)生了明顯的脂質(zhì)過氧化反應；李輝等[18]發(fā)現(xiàn)，小鼠經(jīng)7 Gy60Co γ射線照射后，其脾臟組織中GSH含量顯著降低。本研究發(fā)現(xiàn)，輻照后7 d 裸鼴鼠脾臟組織MDA水平明顯升高，隨著輻照后時間延長，裸鼴鼠脾臟組織MDA水平進一步升高，表明輻照后脾臟組織發(fā)生了明顯的脂質(zhì)過氧化反應。隨著活性氧在體內(nèi)的積累，輻照后裸鼴鼠脾臟組織中GSH和GSSH水平均明顯降低，體現(xiàn)了抗氧化物質(zhì)的消耗，與小鼠研究結(jié)果一致。T-AOC反映機體總體的抗氧化能力，輻照后7 d裸鼴鼠脾臟組織T-AOC明顯降低，表明裸鼴鼠脾臟組織總體抗氧化能力下降，但輻照后21 d 裸鼴鼠脾臟組織T-AOC出現(xiàn)了相當程度的回升，表明裸鼴鼠在遭受氧化應激損傷后脾臟組織總體的抗氧化能力得到較大恢復。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，雖然MDA的積累提示裸鼴鼠脾臟出現(xiàn)了氧化應激損傷，但輻照后21d裸鼴鼠脾臟組織總體的抗氧化能力逐漸恢復，且輻照并未影響脾臟B淋巴細胞發(fā)揮免疫應答功能。結(jié)果表明裸鼴鼠脾臟組織確實具有一定程度的輻射耐受能力，另一方面也說明裸鼴鼠脾臟組織中還可能存在其他尚未明確的抗氧化修復機制。本研究結(jié)果為進一步探討裸鼴鼠抗電離輻射機制提供了參考。