• 
    

    
    

      99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

      健脾消癌方對結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞遷移、侵襲的影響研究*

      2021-01-21 07:11:14簡小蘭曾普華杜佳何鳳姣李克雄蔣益蘭
      中醫(yī)學(xué)報 2021年1期
      關(guān)鍵詞:消癌胎牛含藥

      簡小蘭,曾普華,杜佳,何鳳姣,李克雄,蔣益蘭

      1.湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院,湖南長沙410006;2.中醫(yī)腫瘤學(xué)湖南省重點實驗室,湖南長沙410006;3.湖南中醫(yī)藥大學(xué),湖南長沙410208

      結(jié)直腸癌(Colorectal cancer)在全球的發(fā)病率及死亡率均處于第3位。近年來隨著醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展,在早期診斷方面有所進展,仍有1/3的患者在確診時已發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移[1-2],5年總體生存率低于50%[3]。引起結(jié)直腸癌患者死亡的主要原因——侵襲及轉(zhuǎn)移[4-5],積極探索復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移機制并進行阻斷是提高結(jié)直腸癌患者生存率的關(guān)鍵。大量的臨床研究均顯示中醫(yī)藥在結(jié)直腸癌的綜合治療中發(fā)揮重要作用[6-8]。中醫(yī)藥具有抗腫瘤、抗復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移、調(diào)節(jié)免疫力、提高生活質(zhì)量、延長生存期等作用。多年的臨證研究證實,健脾消癌方抗結(jié)直腸癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移具有良好療效[9-12],但其機制尚未完全闡明。本研究從癌細(xì)胞遷移、侵襲力方面,運用血清藥理學(xué)方法研究健脾消癌方對結(jié)腸癌細(xì)胞遷移及侵襲作用的影響,進一步探討健脾消癌方抗復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移療效機制,為臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

      1 材料

      1.1 動物和細(xì)胞株SD大鼠購自湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司,體質(zhì)量(200±20)g,雌雄各半,合格證號:SYXK(湘)2015-008。人結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116購買于中國科學(xué)院細(xì)胞庫,編號TCHu 99。

      1.2 藥物健脾消癌方主要藥物是人參10 g,薏苡仁30 g,重樓10 g,半枝蓮30 g,郁金15 g,莪術(shù)10 g,從湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院中藥房購買。取上述2倍量藥物,用水浸泡1 h,水量超出藥物3~5 cm,大火煮沸后轉(zhuǎn)小火煎30 min,過濾,藥渣按前法再煎煮2次,將3次藥液混勻、過濾,減壓濃縮為相當(dāng)于生藥1.5 g·mL-1,4℃保存,1周內(nèi)用完。

      1.3 試劑與儀器胎牛血清(以色列Biological industries公司,批號:1616316);DMEM培養(yǎng)基(美國Hyclone公司,批號:NZD1131);BCA蛋白濃度測定試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司,批號:P0012);RIPA裂解液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司,批號:P0013b);結(jié)晶紫(上海碧云天生物技術(shù)有限公司,批號:C0121);MMP-2(美國Abcam公司,貨號:ab92536);MMP-9(美國Abcam公司,貨號:ab228402);β-actin(美國Abcam 公司,貨號:ab6276);山羊抗兔IgG(康為世紀(jì)生物科技有限公司,貨號:01325);山羊抗小鼠IgG(康為世紀(jì)生物科技有限公司,貨號:50237)。

      細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國Thermo公司);Hoefer電泳(美國Hoefer公司);凝膠成像系統(tǒng)(美國Syngene公司);EIX808U型全自動酶標(biāo)儀(美國BioTek公司)。

      2 方法

      2.1 含藥血清的制備SD大鼠20只,雌雄各半,隨機分成2組,每組10只。實驗組按10.8 g·kg-1(相當(dāng)于70 kg成年人120 g·d-1的等效量)灌胃;對照組以等容積的生理鹽水灌胃。每天灌胃1次,連續(xù)7 d,第7天灌胃1 h后,10%水合氯醛(0.3 mL·100 g-1)腹腔麻醉,腹主動脈采血,血液4℃保存,24 h內(nèi)離心,收集合并同組動物血清,微孔濾膜(0.22μm)過濾除菌,保存于-20℃冰箱。

      2.2 細(xì)胞培養(yǎng)HCT116細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1%青鏈霉素的DMEM 高糖培養(yǎng)液中,置于37℃,5%的CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞長滿培養(yǎng)皿底約90%時,進行細(xì)胞傳代,更換培養(yǎng)液,傳代比率為1∶2或1∶3。需要進行實驗處理時,取匯合率為80%的對數(shù)期細(xì)胞。

      2.3 細(xì)胞劃痕實驗取對數(shù)生長期HCT116細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞密度為5×105mL-1,按每孔2 mL接種于6孔板中,待細(xì)胞長滿后,吸棄培養(yǎng)液,將一張事先畫有直線的紙放于6孔板下,各直線間隔適中,用100μL槍頭沿直線劃痕,每孔3條,PBS沿壁輕輕沖洗細(xì)胞3遍,吸棄PBS,分別加入濃度為10%、15%、20%的含藥血清培養(yǎng)液2 mL,10%、15%、20%的鼠對照血清培養(yǎng)液2 mL,及10%胎牛血清為陰性對照組,每組設(shè)置3個復(fù)孔,培養(yǎng)24 h、48 h后取出培養(yǎng)板,有脫落細(xì)胞影響觀察則予以更換培養(yǎng)液,倒置顯微鏡(×50)任意選取5個不同視野拍照,測量劃痕的距離。

      2.4 Transwell檢測細(xì)胞遷移、侵襲能力侵襲實驗選用Transwell小室(孔徑8μm),首先制備含Matrigel膠的Transwell小室。取對數(shù)期生長HCT116細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞密度為5×105mL-1,接種于6孔板,分別以10%、15%、20%含藥血清和10%、15%、20%鼠對照血清,10%胎牛血清處理細(xì)胞。24 h后收集細(xì)胞,用DMEM高糖培養(yǎng)基重懸細(xì)胞均調(diào)整密度為2×106mL-1,分別取100μL各組細(xì)胞懸液加入Transwell小室上室,24孔板下室加入600μL含15%的胎牛血清(FBS)培養(yǎng)液。培養(yǎng)24 h后,取出小室清洗,4%的多聚甲醇固定15 min,晾干10 min,0.1%結(jié)晶紫染色20 min,PBS清洗3遍,33%的醋酸將Transwell膜上細(xì)胞洗滌下來,酶標(biāo)儀570 nm波長讀取OD值,計算細(xì)胞遷移抑制率。遷移實驗除不在小室鋪膠外,其余步驟同侵襲實驗。

      遷移抑制率=[(胎牛血清對照組平均吸光值-實驗組平均吸光值)/胎牛血清對照組平均吸光值]×100%

      2.5 Western Blot法檢測基質(zhì)金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase-2,MMP-2)、基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)蛋白的表達(dá)以15%的有效濃度處理細(xì)胞,15%鼠血清對照組、10%的FBS為陰性對照組,干預(yù)48 h,收集細(xì)胞,預(yù)冷PBS洗細(xì)胞3次,加入含有4μL的含PMSF的RIPA緩沖液400μL,冰上裂解30 min,4℃、12 000 g離心15 min,取上清,BCA試劑盒進行蛋白定量,按照比例加入SDS-PAGE蛋白緩沖液,煮沸5 min,立即分裝,置-80℃?zhèn)溆?。?0μg蛋白上樣,SDS-PAGE凝膠電泳后轉(zhuǎn)膜至PVDF膜,封閉,一抗室溫孵育4 h、二抗室溫孵育2 h,ECL發(fā)光,分別檢測MMP-2、MMP-9蛋白的表達(dá)水平,β-actin為內(nèi)參。以Image J軟件分析結(jié)果。

      2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計統(tǒng)計分析采用SPSS 19.0軟件,計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,多組間比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用LSD檢驗,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

      3 結(jié)果

      3.1 健脾消癌方對細(xì)胞劃痕的影響健脾消癌方含藥血清處理24 h、48 h后,含藥血清劃痕距離寬于相同濃度空白血清組。處理24 h,與相同濃度鼠血清對照組相比,10%、15%、20%的含藥血清組劃痕距離均較明顯增寬(P<0.05);處理48 h,與相同濃度鼠血清對照組相比,10%、15%、20%的含藥血清組劃痕距離均較顯著增寬(P<0.01),且濃度越大劃痕距離越大。同濃度含藥血清,對細(xì)胞遷移抑制能力48 h優(yōu)于24 h。說明健脾消癌方能夠抑制HCT116細(xì)胞的遷移,其抑制作用與濃度和時間呈正相關(guān)。見圖1、圖2、圖3,表1。

      圖1 含藥血清對HCT116細(xì)胞劃痕距離的影響

      圖2 對照鼠血清對HCT116細(xì)胞劃痕距離的影響

      圖3 胎牛血清對HCT116細(xì)胞劃痕距離的影響

      3.2 健脾消癌方對細(xì)胞遷移的影響處理24 h后,與相同濃度鼠血清對照組相比,10%、15%、20%的含藥血清細(xì)胞遷移抑制率增大(P<0.05,P<0.01),且隨濃度增加遷移抑制率增大。說明健脾消癌方能夠抑制HCT116細(xì)胞遷移,與濃度呈正相關(guān)。見表2。

      3.3 健脾消癌方對細(xì)胞侵襲的影響處理24 h后,與相同濃度鼠血清對照組相比,10%、15%、20%的含藥血清細(xì)胞侵襲抑制率增加(P<0.05;P<0.01),且隨濃度增加侵襲抑制率增高。說明健脾消癌方能夠抑制HCT116細(xì)胞侵襲,與濃度呈正相關(guān)。見表3。

      表1 含藥血清對HCT116細(xì)胞遷移距離的影響(n=3×5,±s)

      表1 含藥血清對HCT116細(xì)胞遷移距離的影響(n=3×5,±s)

      注:與胎牛血清組比較,*P<0.05,△P<0.01;與相同濃度對照組比較,#P<0.05,▲P<0.01;含藥血清48 h與24 h比較,○P<0.05

      組別0 h(l/cm)24 h(l/cm)48 h(l/cm)10%含藥血清組7.11±0.24 4.47±0.32*# 5.10±0.38△▲ 15%含藥血清組6.98±0.31 5.04±0.45*# 5.56±0.51△▲20%含藥血清組7.10±0.25 5.12±0.37*# 6.03±0.41△▲○10%對照鼠血清組7.22±0.36 3.56±0.39 0.55±0.36*15%對照鼠血清組6.80±0.34 3.20±0.40 0.38±0.30 20%對照鼠血清組6.86±0.25 2.95±0.31 0.15±0.23 10%胎牛血清組7.04±0.23 3.05±0.34 0.10±0.06

      表2 健脾消癌方含藥血清對細(xì)胞遷移的影響(±s,n=3)

      表2 健脾消癌方含藥血清對細(xì)胞遷移的影響(±s,n=3)

      注:與胎牛血清組比較,*P<0.05,△P<0.01;與相同濃度對照組比較,#P<0.05,▲P<0.01

      /%10%含藥血清組2.21±0.15*組別OD值遷移抑制率21.9 15%含藥血清組2.17±0.23*#23.3 20%含藥血清組1.39±0.25△▲50.9 10%對照鼠血清組2.52±0.26 10.9 15%對照鼠血清組2.60±0.14 8.1 20%對照鼠血清組2.81±0.20 0.7 10%胎牛血清組2.83±0.18/

      表3 健脾消癌方含藥血清對細(xì)胞侵襲的影響(±s,n=3)

      表3 健脾消癌方含藥血清對細(xì)胞侵襲的影響(±s,n=3)

      注:與胎牛血清組比較,*P<0.05,△P<0.01;與相同濃度對照組比較,#P<0.05,▲P<0.01

      /%10%含藥血清組0.79±0.14*組別OD值侵襲抑制率25.5 15%含藥血清組0.66±0.12△#37.7 20%含藥血清組0.54±0.15△▲49.1 10%對照鼠血清組0.94±0.11 11.3 15%對照鼠血清組0.97±0.13 8.5 20%對照鼠血清組1.02±0.10 3.8 10%胎牛血清組1.06±0.09/

      3.4 健脾消癌方對MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)的影響與15%鼠血清對照組比較,15%的含藥血清細(xì)胞的MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.01)。說明健脾消癌方能夠下調(diào)MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)。見表4,圖4。

      表4 MMP-2、MMP-9蛋白相對表達(dá)水平(±s,n=3)

      表4 MMP-2、MMP-9蛋白相對表達(dá)水平(±s,n=3)

      注:與胎牛血清組比較,△P<0.01;與相同濃度對照組比較,▲P<0.01

      -actin 15%含藥血清組0.58±0.04△▲0.34±0.02組別MMP-2/β-actin MMP-9/β△▲15%對照鼠血清組1.06±0.02 0.58±0.03△10%胎牛血清組1.11±0.03 0.72±0.02

      圖4 MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)水平

      4 討論

      大腸癌屬于中醫(yī)學(xué)“腸覃”“腸癖”“臟毒”“癥瘕”“鎖肛痔”等范疇。我院腫瘤中心長期從事中醫(yī)藥抗結(jié)直腸癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移臨床及基礎(chǔ)研究,總結(jié)腸癌基本病機為“脾虛、瘀積、癌毒”,當(dāng)以健脾益氣,化瘀解毒為治療法則。擬定健脾消癌方,主要藥物組成有人參、薏苡仁健脾益氣,郁金、莪術(shù)活血化瘀,重樓、半枝蓮清熱解毒,全方配伍,寒溫并用,標(biāo)本兼顧,攻補兼施。

      轉(zhuǎn)移是引起腫瘤患者死亡的主要原因[13]。腫瘤細(xì)胞的黏附、遷移能力與癌轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。單個腫瘤細(xì)胞從原發(fā)腫瘤脫落游離是腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的第一步,腫瘤細(xì)胞與細(xì)胞之間黏附因子的損失是腫瘤細(xì)胞脫離的要素。脫落的腫瘤細(xì)胞即為循環(huán)腫瘤細(xì)胞,與脈管內(nèi)皮細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)細(xì)胞黏附,遷移到特定的組織器官,并發(fā)展成為繼發(fā)癌灶的過程,即是轉(zhuǎn)移。遷移是腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移過程中必不可缺的環(huán)節(jié)之一[14]。故抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵之一乃是抑制腫瘤細(xì)胞向外遷移。

      MMPs是一類高度保守的鋅原子依賴內(nèi)肽酶家族,大部分成員具有降解細(xì)胞基膜及細(xì)胞外基質(zhì)功能,是腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移過程中的重要分子。MMPs在腫瘤轉(zhuǎn)移的多個步驟均有參與,包括腫瘤的遷移、侵襲、免疫逃逸、血管的生成、腫瘤的生長[13]。MMP-2和MMP-9是MMPs的明膠酶組成員,通過降解基底膜的膠原成分、細(xì)胞外基質(zhì)和細(xì)胞黏附分子,促進血管生成和調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附,從而導(dǎo)致癌細(xì)胞運動性增強,促進癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移[15-17]。端傳友[18]檢測86例結(jié)腸癌組織及正常結(jié)腸組織中MMP-2、MMP-9的表達(dá),發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌組織中MMP-2、MMP-9表達(dá)水平及陽性率均顯著高于正常結(jié)腸組織,其中有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌組織中MMP-2、MMP-9陽性表達(dá)率高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者,提示MMP-2、MMP-9高表達(dá)與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。故通過降低MMP-2及MMP-9的表達(dá),可以抑制腫瘤細(xì)胞的脫落、遷移,從而降低轉(zhuǎn)移率。

      本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),健脾消癌方能夠抑制細(xì)胞遷移及侵襲,并下調(diào)MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)水平,健脾消癌方抗復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移機制可能是通過下調(diào)MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá),從而抑制HCT116細(xì)胞遷移、侵襲力。

      猜你喜歡
      消癌胎牛含藥
      健脾消癌方通過PI3K/Akt信號通路抑制結(jié)腸癌血管生成的研究
      細(xì)胞貼壁效應(yīng)是評價胎牛血清質(zhì)量的重要因素
      2021年本刊一些常用詞匯可直接用縮寫(一)
      急救含藥姿勢要正確
      乳病消片含藥血清對MCF-7細(xì)胞增殖的抑制作用
      中成藥(2018年10期)2018-10-26 03:40:44
      Estimation of boundary-layer flow of a nanofluid past a stretching sheet: A revised model*
      胎牛血清對人內(nèi)皮細(xì)胞HMEC-1體外成血管實驗影響的觀察△
      消癌平注射液提取濃縮工藝的優(yōu)化
      中成藥(2016年8期)2016-05-17 06:08:18
      消癌平注射液用于晚期胃癌化療患者效果觀察
      消癌平注射液治療晚期惡性腫瘤機制研究進展
      巴里| 托克托县| 文化| 武隆县| 蒙自县| 宣化县| 思南县| 扎赉特旗| 阿瓦提县| 漳州市| 库车县| 汕尾市| 裕民县| 万宁市| 屯门区| 云南省| 荥阳市| 安新县| 高陵县| 石台县| 漳平市| 恩平市| 柳林县| 黄浦区| 廊坊市| 无极县| 藁城市| 文水县| 凤山县| 海丰县| 文安县| 黄龙县| 临泽县| 泾阳县| 新余市| 平邑县| 屏南县| 江源县| 印江| 嘉善县| 清水县|