張楠馳，李 娟，王 利*，魏 勇

（1.西南民族大學(xué)青藏高原動(dòng)物遺傳資源保護(hù)與利用教育部和四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610041；2.四川省畜牧科學(xué)研究院動(dòng)物遺傳育種四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610066；3.阿壩職業(yè)學(xué)院，四川 阿壩 623200）

金堂黑山羊是我國(guó)重要的山羊品種之一，具有體質(zhì)結(jié)實(shí)、性成熟早、繁殖力強(qiáng)、多胎性好、生長(zhǎng)速度快和抗病能力強(qiáng)等特點(diǎn)。諸多研究者從基因角度對(duì)金堂黑山羊生長(zhǎng)、免疫和營(yíng)養(yǎng)等方面進(jìn)行研究以提高金堂黑山羊肉質(zhì)和產(chǎn)量。熒光定量PCR（qP?CR）技術(shù)是基因相關(guān)研究中的重要方法之一。為獲得較為真實(shí)、準(zhǔn)確的基因轉(zhuǎn)錄情況，在檢測(cè)目的基因轉(zhuǎn)錄水平時(shí)需要加入內(nèi)參基因，因此選擇可靠、穩(wěn)定的內(nèi)參基因尤為重要。目前在qPCR 的研究中通常使用GAPDH 和ACTB 等基因作為內(nèi)參基因，但是同一內(nèi)參基因可能在不同物種、不同組織等情況下轉(zhuǎn)錄水平的穩(wěn)定性存在差異[1]。肽基脯氨酰異構(gòu)酶B（Peptidylprolyl isomerase B，PPIB）和羥甲基膽汁合酶（Hydroxymethylbilane synthase，HMBS）是分析簡(jiǎn)陽(yáng)山羊骨骼肌發(fā)育過程中肌內(nèi)脂肪（Intramuscular fat，IMF）相關(guān)基因的最佳內(nèi)參基因，而18S rRNA 和GAPDH 穩(wěn)定性相對(duì)較差[2]。ACTB 在山羊胃、小腸和卵巢中轉(zhuǎn)錄水平的穩(wěn)定性最佳，18S rRNA 在心和脾中轉(zhuǎn)錄水平的穩(wěn)定性最佳，HMBS 在子宮和肺中轉(zhuǎn)錄水平的穩(wěn)定性最佳[3]。雖然國(guó)內(nèi)外已有關(guān)于綿羊和山羊等家畜內(nèi)參基因篩選的研究，但品種間的差異可能會(huì)影響羊亞科內(nèi)不同品種山羊內(nèi)參基因的穩(wěn)定性[4]。目前尚未見金堂黑山羊不同組織內(nèi)參基因篩選的研究。因此，對(duì)金堂黑山羊不同組織內(nèi)參基因的篩選在提高目的基因在金堂黑山羊不同組織內(nèi)轉(zhuǎn)錄水平研究結(jié)果的準(zhǔn)確性方面有著重要意義。本實(shí)驗(yàn)以金堂黑山羊6 種不同組織作為研究對(duì)象，采用不同程序分析其16 個(gè)候選基因的穩(wěn)定性，從而篩選出可應(yīng)用于金堂黑山羊不同組織qPCR 分析的最佳內(nèi)參基因，以期為檢測(cè)金堂黑山羊目的基因轉(zhuǎn)錄水平的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物RNAiso Plus、Prime ScriptTMRT Reagent Kit、DL2000 Marker、TB GreenTMPremix ExTaqTMⅡ酶，均購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為12 只110 日齡四川金堂黑山羊，雌雄各半，體重為（18.98±0.75）kg，購(gòu)自四川省某山羊核心育種公司。解剖后取心、肝、脾、瘤胃、背最長(zhǎng)肌和臀肌組織裝入凍存管中后立即放入液氮中凍存，用于各組織樣品總RNA 的提取。

1.2 引物設(shè)計(jì)與合成以山羊GAPDH、PPIB、UXT和ACTB 等16 個(gè)基因作為候選基因，參考GenBank登錄的基因序列，采用Primer Premier 5.0 設(shè)計(jì)引物（表1），引物均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.3 候選基因在山羊不同組織中的轉(zhuǎn)錄水平分別取12 只黑山羊的心、肝、脾、瘤胃、背最長(zhǎng)肌和臀肌組織，按常規(guī)方法處理后，提取各組織總RNA，利用NanoDrop Lite 和Aligent 2100 檢測(cè)總RNA 質(zhì)量，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明反轉(zhuǎn)錄為cDNA。

各基因RT-qPCR 總體系為10 μL，各組分含量分別為：上下游引物各0.8 μL；DEPC H2O 2.2μL；TB GreenTMPremix ExTaqTMⅡ5.2 μL；cDNA 模板1.0 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃3 min；95 ℃10 s，退火（47 ℃～60 ℃）20 s（各基因退火溫度見表1），72 ℃30 s，共39 個(gè)循環(huán)；溶解曲線階段95 ℃15 s，60 ℃1 min，95 ℃5 s。取最適退火溫度的擴(kuò)增產(chǎn)物，分別稀釋103、104、105、106、107、108、109倍，進(jìn)行RT-qP?CR 擴(kuò) 增，利 用QuantStudioTMDesign & Analysis Soft?ware v1.4.2 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并檢測(cè)表1 中各候選基因在各組織樣品中的轉(zhuǎn)錄水平，每個(gè)樣品平行重復(fù)3次，并設(shè)置無(wú)cDNA 模板的陰性對(duì)照。

1.4 內(nèi)參基因的穩(wěn)定性驗(yàn)證采用鄭姚等設(shè)計(jì)的山羊DQB1 基因引物（F：ATGTCTGGGATGCTGGC/R：CGCACGAGCCCCTTCTG）[5]，分別以篩選出的最佳候選基因組合、最佳候選基因和2 個(gè)轉(zhuǎn)錄水平最不穩(wěn)定的候選基因?yàn)閮?nèi)參，利用RT-qPCR 檢測(cè)DQB1 基因在黑山羊心、脾和臀肌中的轉(zhuǎn)錄水平，以驗(yàn)證內(nèi)參基因的穩(wěn)定性。RT-qPCR 反應(yīng)體系和條件同1.3。

表1 候選基因引物序列Table 1 Primers for candidate genes

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和分析利用QuantStudioTMDesign &Analysis Software v1.4.2 統(tǒng)計(jì)候選基因轉(zhuǎn)錄水平數(shù)據(jù)和繪制各基因標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用GraphPad Prism5.0 繪制基因轉(zhuǎn)錄水平圖譜，以SPSS 26.0 分析數(shù)據(jù)之間的差異性。分別采用geNorm 程序、NormFinder 程序和BestKeeper 程序并參照吳建陽(yáng)等描述的方法對(duì)各候選基因的穩(wěn)定性進(jìn)行分析[6]。采用上述3 種程序分析得到的各候選基因穩(wěn)定性排序結(jié)果的平均值，作為各候選基因的綜合穩(wěn)定性分析的判定依據(jù)。

2 結(jié) 果

2.1 RNA 質(zhì)量檢測(cè)提取的各組織RNA 質(zhì)量檢測(cè)結(jié)果顯示，其OD260nm/OD280nm值均在1.9～2.1，OD260nm/OD230nm值均大于1.90，RNA 完整性（RIN 值）均大于9.0，28 S/18 S 值均大于1.5。這說明各樣品RNA 提取質(zhì)量較好，純度和完整性均較高，滿足后續(xù)分析要求。

2.2 候選基因引物的特異性及擴(kuò)增效率金堂黑山羊GAPDH、PPIB、UXT 和ACTB 等16 個(gè)候選基因的PCR 結(jié)果顯示，均未見二聚體和雜帶，產(chǎn)物長(zhǎng)度與預(yù)期基本一致，表明引物特異性好（圖1）。各候選基因標(biāo)準(zhǔn)曲線R2均大于0.99，擴(kuò)增效率均在90%～120%，表明各引物可用于RT-qPCR 擴(kuò)增并得到可靠的結(jié)果。

圖1 候選基因引物特異性Fig. 1 Primer specificity for candidate genes

2.3 候選基因在山羊不同組織中的轉(zhuǎn)錄水平經(jīng)熒光定量PCR 檢測(cè)，結(jié)果顯示：不同候選基因在不同組織中的轉(zhuǎn)錄水平存在一定的差異性，其中PPIB、ACTB、YWHAZ、RPL4、RPLP0 在不同組織中轉(zhuǎn)錄水平基本一致，GAPDH、UXT、SDHA、PGK1、PPIA、TBP 和ELL2 在不同組織中轉(zhuǎn)錄水平相對(duì)一致，而HPRT1、18S rRNA、TOP2β、EIF3K 在不同組織中轉(zhuǎn)錄水平一致性相對(duì)最差（圖2）。

2.4 geNorm 程序分析候選基因在山羊不同組織中轉(zhuǎn)錄水平的穩(wěn)定性利用geNorm 程序分析候選基因的穩(wěn)定性，根據(jù)吳建陽(yáng)等的判斷標(biāo)準(zhǔn)，M 值越小候選基因穩(wěn)定性越好[6]。結(jié)果顯示，在不同組織中，PPIB 和YWHAZ 穩(wěn)定性相對(duì)最好，18S rRNA、EIF3K穩(wěn)定性相對(duì)最差（圖3）。另外，配對(duì)變異系數(shù)結(jié)果顯示，V2/3=0.085<0.15，表明目的基因在山羊不同組織轉(zhuǎn)錄水平的檢測(cè)只需使用2 個(gè)內(nèi)參基因即可（PPIB 和YWHAZ）（圖4）。上述結(jié)果表明，PPIB 和YWHAZ 是最佳內(nèi)參基因組合。

2.5 NormFinder 程序分析候選基因在山羊不同組織中轉(zhuǎn)錄水平的穩(wěn)定性利用NormFinder 程序分析候選基因穩(wěn)定性，根據(jù)吳建陽(yáng)等介紹的，穩(wěn)定值越小的候選基因穩(wěn)定性越好[6]。因此，PPIB 和ACTB 穩(wěn)定性相對(duì)最好，穩(wěn)定值分別為0.171 和0.220，而18S rRNA、EIF3K 穩(wěn)定性相對(duì)最差，穩(wěn)定值分別為0.416 和0.456（圖5）。另外，NormFinder 程序篩選出最佳組合為PPIB 和YWHAZ，其穩(wěn)定值為0.134，進(jìn)一步表明最佳內(nèi)參基因組合是PPIB+YWHAZ。

圖2 候選基因在不同組織中的轉(zhuǎn)錄水平Fig. 2 The transcription levels of candidate genes in different tissues

圖3 利用geNorm 程序分析候選基因的平均轉(zhuǎn)錄水平穩(wěn)定性Fig. 3 The stability of average transcription levels of candidate genes by geNorm program

圖4 利用geNorm 程序分析候選基因的配對(duì)變異系數(shù)Fig. 4 The pairwise variations of candidate genes by geNorm program

圖5 利用NormFinder 程序分析候選基因的穩(wěn)定值Fig. 5 The stability values of candidate genes by NormFinder program

2.6 BestKeeper 程序分析候選基因在山羊不同組織中轉(zhuǎn)錄水平的穩(wěn)定性利用BestKeeper 程序分析候選基因的穩(wěn)定性，根據(jù)吳建陽(yáng)等介紹的判斷標(biāo)準(zhǔn)，相關(guān)系數(shù)（r）越大且標(biāo)準(zhǔn)差（SD）和變異系數(shù)（CV）越小的候選基因穩(wěn)定性越好[6]。因此，穩(wěn)定性相對(duì)最好的候選基因?yàn)镻GK1，其次是YWHAZ、ACTB、PPIB 和HPRT1；穩(wěn)定性相對(duì)最差候選基因?yàn)镋IF3K，其次是TOP2β、RPL4、TBP 和18S rRNA（表2）。各基因p 值均小于0.05，說明結(jié)果均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以上結(jié)果表明，PGK1 和YWHAZ 為最佳組合，該組合的相關(guān)系數(shù)為0.986。

表2 利用BestKeeper 程序分析候選基因的穩(wěn)定性Table 2 The expression stability of candidate genes by BestKeeper program

2.7 綜合分析候選基因在山羊不同組織中轉(zhuǎn)錄水平的穩(wěn)定性分別將geNorm、NormFinder 和BestKeeper程序分析得到的GAPDH、PPIB、UXT 等16 個(gè)候選基因的穩(wěn)定性進(jìn)行排序（基因穩(wěn)定性越好，穩(wěn)定性等級(jí)數(shù)值越小），計(jì)算各候選基因平均穩(wěn)定性等級(jí)（表3）。結(jié)果顯示，PPIB 在黑山羊不同組織中轉(zhuǎn)錄水平的穩(wěn)定性相對(duì)最好，其次是YWHAZ 和ACTB，而18S rRNA、TOP2β 和EIF3K 在黑山羊不同組織中轉(zhuǎn)錄水平的穩(wěn)定性相對(duì)最差。綜合分析候選基因穩(wěn)定性結(jié)果表明，PPIB 和YWHAZ 可作為黑山羊不同組織的最佳內(nèi)參基因組合，PPIB 是最佳內(nèi)參基因。

表3 綜合分析候選基因的穩(wěn)定性Table 3 Overall stability ranks of candidate genes

2.8 內(nèi)參基因穩(wěn)定性驗(yàn)證為驗(yàn)證篩選出的最佳內(nèi)參基因組合的穩(wěn)定性，分別以穩(wěn)定性最佳的基因組合PPIB 和YWHAZ（Ct 值平均數(shù)）、穩(wěn)定性最佳基因PPIB 以及穩(wěn)定性最差基因TOP2β、EIF3K 為內(nèi)參基因，檢測(cè)DQB1 在黑山羊心、脾和臀肌中的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果顯示，以最佳基因組合（PPIB+YWHAZ）和最佳基因（PPIB）為內(nèi)參基因時(shí)，檢測(cè)DQB1 基因在心、脾和臀肌中的轉(zhuǎn)錄水平結(jié)果相近，兩組間無(wú)顯著差異（p>0.05）；而以TOP2β、EIF3K 為內(nèi)參基因時(shí)，DQB1 基因在心、脾和臀肌中的轉(zhuǎn)錄水平存在顯著的差異性（p<0.05），且與最佳基因組合和最佳基因所得結(jié)果均差異顯著（p<0.05）（圖6）。上述結(jié)果表明最佳內(nèi)參基因組合（PPIB+YWHAZ）穩(wěn)定性較好。

圖6 內(nèi)參基因穩(wěn)定性驗(yàn)證Fig. 6 The verification of reference gene stability

3 討 論

RT-qPCR 技術(shù)具有高敏感性和高重復(fù)性，被廣泛應(yīng)用于基因轉(zhuǎn)錄水平分析。已應(yīng)用的內(nèi)參基因在不同組織、不同物種、不同時(shí)間等條件下的轉(zhuǎn)錄水平均存在一定的差異，且目前尚未發(fā)現(xiàn)在任何實(shí)驗(yàn)條件下均能穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因[7]。選擇不穩(wěn)定的內(nèi)參基因會(huì)導(dǎo)致結(jié)果的變化和不準(zhǔn)確，因此篩選出在不同條件下轉(zhuǎn)錄水平較穩(wěn)定的內(nèi)參基因具有重要的意義[8]。Wang 等在RNA 制備方法影響豬卵母細(xì)胞內(nèi)參基因轉(zhuǎn)錄水平的研究中發(fā)現(xiàn)，GAPDH 和18S rRNA 是卵丘細(xì)胞的最佳內(nèi)參基因，YWHAZ 和ACTB是卵母細(xì)胞的最佳內(nèi)參基因[9]。在反芻動(dòng)物脂肪、乳腺和肝臟等組織內(nèi)參基因篩選的研究中發(fā)現(xiàn)，UXT，EIF3K 和RPLP0 是牛脂肪中最穩(wěn)定的內(nèi)參基因[4]。本實(shí)驗(yàn)中，采用RT-qPCR 檢測(cè)GAPDH、PPIB、UXT 等16 個(gè)候選基因在黑山羊不同組織中的轉(zhuǎn)錄水平結(jié)果表明，任何一種內(nèi)參基因在不同組織中的轉(zhuǎn)錄水平均存在一定差異，這與別人的研究結(jié)果一致，也說明了內(nèi)參基因篩選的重要性[10]。目前常用的內(nèi)參穩(wěn)定性分析有g(shù)eNorm、NormFinder、BestKeeper 和RefFinder 等程序，且已被眾多研究者用于內(nèi)參基因的篩選分析。Augustyniak 等組合Best?Keeper、geNorm、NormFinder 程序和ΔCt 法篩選出人類神經(jīng)細(xì)胞的內(nèi)參基因[11]。Zhu 等采用geNorm、NormFinder 和BestKeeper 程序篩選山羊肌內(nèi)脂肪最佳內(nèi)參基因是PPIB[2]。Toscano 等采用NormFinder、BestKeeper 和RefFinder 程序篩選綿羊胃幽門組織最佳內(nèi)參基因是YWHAZ[12]。許晴等采用geNorm、Norm Finder、BestKeeper 程序和ΔCt 法發(fā)現(xiàn)山羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞相對(duì)最不穩(wěn)的內(nèi)參基因是EIF3K[13]。在單一內(nèi)參基因不能滿足實(shí)驗(yàn)要求時(shí)可選擇2 個(gè)或2 個(gè)以上的內(nèi)參基因進(jìn)行校正。本實(shí)驗(yàn)通過geNorm、Norm?Finder 和BestKeeper 程序綜合分析得出，在黑山羊不同組織中PPIB 可作為最佳的內(nèi)參基因，在PPIB 單一內(nèi)參基因無(wú)法滿足實(shí)驗(yàn)要求的情況下，可選擇PPIB+YWHAZ 作為內(nèi)參基因組合。

針對(duì)不同品種的山羊所篩選出的最佳內(nèi)參基因也不相同。Zhang 等對(duì)波爾山羊心、肝、脾等10 種組織篩選內(nèi)參基因結(jié)果表明，18S rRNA、TBP 和HMBS 是最佳內(nèi)參組合[3]。池永東等篩選簡(jiǎn)洲大耳羊組織最佳內(nèi)參基因結(jié)果表明TBP、UXT 和RPLP0 穩(wěn)定性均較好[14]。Bai 等研究發(fā)現(xiàn)SDHA、YWHAZ 和UBC 是遼寧絨山羊皮膚組織最佳內(nèi)參基因組合[15]。本實(shí)驗(yàn)中，18S rRNA、TBP、UXT 和RPLP0 穩(wěn)定性均不佳，而YWHAZ 穩(wěn)定性較好。這說明了同一內(nèi)參基因在同一物種不同品種間穩(wěn)定性存在較大差異。同一品種在不同生長(zhǎng)時(shí)期的內(nèi)參基因穩(wěn)定性也存在一定差異。陳利等研究表明，在同一生長(zhǎng)時(shí)期（3 日齡）的11 個(gè)南江黃羊組織中HPRT1、RP2 轉(zhuǎn)錄水平穩(wěn)定性最佳，在不同生長(zhǎng)時(shí)期的骨骼肌中YWHAZ 和ACTB 轉(zhuǎn)錄水平穩(wěn)定性最佳[16]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)110 日齡金堂黑山羊6 種組織的最佳內(nèi)參基因進(jìn)行篩選，而篩選出的最佳內(nèi)參基因組合PPIB+YWHAZ 在其他生長(zhǎng)時(shí)期的穩(wěn)定性是否最佳需進(jìn)一步驗(yàn)證。目前已有的關(guān)于金堂黑山羊目的基因轉(zhuǎn)錄水平的研究中，多以GAPDH 和ACTB 為內(nèi)參基因[17]。而有關(guān)山羊內(nèi)參基因篩選的研究結(jié)果均表明ACTB 和GAPDH 轉(zhuǎn)錄水平穩(wěn)定性一般[13-14,16]。本實(shí)驗(yàn)得到了相似的結(jié)果，GAPDH 和ACTB 分別在16 種候選基因中排名第5 和第3。本實(shí)驗(yàn)利用DQB1 基因驗(yàn)證篩選基因的穩(wěn)定性結(jié)果表明篩選出的最佳內(nèi)參基因在各組織中均具有較好的穩(wěn)定性，可作為檢測(cè)金堂黑山羊不同組織中目的基因轉(zhuǎn)錄水平中的內(nèi)參基因，也表明本實(shí)驗(yàn)采用的geNorm、NormFinder 和BestKeeper 程序得到的結(jié)果準(zhǔn)確。

綜上所述，PPIB 基因在金堂黑山羊不同組織中轉(zhuǎn)錄水平的穩(wěn)定性相對(duì)最佳，PPIB+YWHAZ 是最佳內(nèi)參基因組合，可在金堂黑山羊不同組織熒光定量PCR 分析中作為內(nèi)參基因，而EIF3K 基因轉(zhuǎn)錄水平的穩(wěn)定性相對(duì)最差。