王文龍，蘇 倩，趙學(xué)亮，孫 柯，翟 帥，王騰宇，呼和巴特爾

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動(dòng)物疾病臨床診療技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018）

捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)（Haemonchus contortus）屬于毛圓科血矛屬，其主要以吸食宿主血液為生，會(huì)導(dǎo)致宿主出現(xiàn)貧血、消瘦、皺胃粘膜損傷等癥狀[1]，嚴(yán)重者可致宿主，特別是幼齡宿主死亡。目前捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)病呈全世界性分布，尤其是熱帶、亞熱帶及降雨量充沛的地區(qū)[2]。而關(guān)于該病的治療，臨床上常使用伊維菌素、阿苯達(dá)唑、左旋咪唑等[3]藥物。其中阿苯達(dá)唑作為一種廣譜、高效、低毒的抗蠕蟲(chóng)藥物，在國(guó)內(nèi)外普遍使用[4]。但阿苯達(dá)唑的不合理使用導(dǎo)致捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)對(duì)其產(chǎn)生了耐藥性[5]，給養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)重大的經(jīng)濟(jì)損失。研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)阿苯達(dá)唑產(chǎn)生耐藥性的主要原因是捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)的I 型β 微管蛋白基因的3 個(gè)單核苷酸多態(tài)性（SNP）位點(diǎn)發(fā)生了突變（F167Y、E198A 和F200Y）[6-7]。

本實(shí)驗(yàn)室前期在耐藥蟲(chóng)株給藥前和給藥后以及敏感和耐藥蟲(chóng)株全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，篩選出捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)對(duì)阿苯達(dá)唑耐藥的候選基因—細(xì)胞色素P450 基因（Cytochrome P450，CYP450）[8]。細(xì)胞色素P450 是存在于所有需氧生物的一種蛋白酶系[9]，參與藥物代謝、自然發(fā)生分子的生物轉(zhuǎn)化和外源性生物的氧化代謝等，被認(rèn)為是與捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)耐藥性相關(guān)的重要基因[10]。P450 通過(guò)增加酶的表達(dá)量、酶活力的改變加快機(jī)體對(duì)藥物的代謝，使機(jī)體產(chǎn)生一定的適應(yīng)性，從而產(chǎn)生耐藥性。本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了pET-P450 重組表達(dá)質(zhì)粒，純化得到P450 重組蛋白（rP450），并對(duì)該蛋白的生物信息學(xué)進(jìn)行分析，為捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)耐藥性的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)采自?xún)?nèi)蒙古鄂爾多斯市烏審旗和烏蘭察布市察右后旗，鏡下鑒定雌雄后凍存。Trans1-T1 和E. coil BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞均購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；克隆載體pMD19-T、TRIzol 試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、DNA ATailing Kit、限制性?xún)?nèi)切酶EcoR I、Xho I、T4 DNA連接酶、DNA Marker 均購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；表達(dá)載體pET-30a（+）由本實(shí)驗(yàn)室保存；質(zhì)粒提取試劑盒、DNA 凝膠回收試劑盒購(gòu)自AXYGEN 公司；Ni-NTA 蛋白純化試劑盒購(gòu)自生工生物工程（上海）有限公司；溶菌酶、DNase I、苯甲基磺酰氟（PFMS）、MgCl2和SDS-PAGE 凝膠制備試劑盒購(gòu)自北京索萊寶生物技術(shù)公司。

1.2P450基因的PCR 擴(kuò)增和原核表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定根據(jù)捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)通過(guò)Primer 5.0 軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增P450 基因的引物F：5'-GCAGAATTCATGGCTAACAGTGGACAGT-3'（EcoR I）/R：5'-CACTCGAGCTATGCAATCAAACTGG-3'（Xho I），引物由北京六合華大基因科技有限公司合成。采用TRIzol法提取捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)的RNA 后，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以其為模板，利用上述引物經(jīng)PCR擴(kuò)增P450基因，膠回收PCR產(chǎn)物，測(cè)序鑒定后，克隆至pET-30a（+），構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET-P450 后經(jīng)PCR、雙酶切鑒定后，由北京六合華大基因科技有限公司測(cè)序鑒定。

1.3 rP450 表達(dá)的鑒定與純化將pET-P450 轉(zhuǎn)化E. coil BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞構(gòu)建pETP450/BL21，經(jīng)IPTG 誘導(dǎo)蛋白質(zhì)表達(dá)后，離心收菌，加入溶菌酶、DNase I、PFMS 和MgCl2裂解細(xì)胞，-20 ℃反復(fù)凍融，12 000 r/min離心15 min，收集上清和沉淀。將沉淀用終濃度8 mol/L 尿素充分溶解，離心收集上清用0.45 μm 孔徑的濾器過(guò)濾后，按照Ni-NTA 蛋白純化試劑盒說(shuō)明書(shū)純化蛋白，利用SDS-PAGE 凝膠電泳檢測(cè)rP450 的表達(dá)與純化效果。

1.4 P450 蛋白的生物信息學(xué)分析利用ExPASy-Prot Param 分析P450 基因編碼產(chǎn)物的組成及理化性質(zhì)[11]；利用TMHMM Server 預(yù)測(cè)P450 蛋白的跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)[12]；利用SignaIP 4.1 Server 分析P450 蛋白的信號(hào)肽[13]；利用Bepipred 1.0 Server、ABCpred Predic?tion Server[14]以及DNAstar 中的Protean 軟件預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)B、T 細(xì)胞抗原表位；利用SWISS-MODEL 預(yù)測(cè)該蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)[15]等。

2 結(jié)果與討論

2.1P450基因的PCR 擴(kuò)增和原核表達(dá)載體的鑒定結(jié)果以反轉(zhuǎn)錄得到的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)的cDNA 為模板，PCR 擴(kuò)增P450 基因。結(jié)果顯示，獲得約為678 bp 的目的片段，與預(yù)期大小一致（圖1A）。對(duì)構(gòu)建的重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切鑒定，出現(xiàn)兩條目的帶，分別為678 bp 和5 422 bp（圖1B），測(cè)序比對(duì)結(jié)果與全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序得到的基因序列一致。表明正確構(gòu)建了原核表達(dá)載體pET-P450。

2.2 rP450 表達(dá)的鑒定與純化結(jié)果將構(gòu)建的pETP450/BL21 經(jīng)IPTG 誘導(dǎo)后，利用SDS-PAGE 鑒定。結(jié)果顯示，在沉淀物中出現(xiàn)大小為31.58 ku的目的條帶，而上清液中無(wú)該條帶（圖2A）。經(jīng)Ni-NTA 柱純化，獲得了純化的rP450（圖2B）。表明，P450 基因在大腸桿菌中獲得了表達(dá)，且在包涵體中表達(dá)。

圖1 P450 基因的PCR 擴(kuò)增（A）和重組質(zhì)粒pET-P450 的雙酶切鑒定（B）結(jié)果Fig. 1 The PCR product of P450 gene(A) and the dual-enzyme digestion of pET-P450(B)

圖2 rP450 表達(dá)（A）以及純化（B）的SDS-PAGE 檢測(cè)結(jié)果Fig. 2 Detection of expression products of rP450(A) and purification (B)

2.3 P450 蛋白的生物信息學(xué)分析

2.3.1 P450 蛋白的理化性質(zhì)分析 利用ExPASy-Prot Param 分析P450 蛋白理化性質(zhì)，結(jié)果顯示P450 蛋白原子總數(shù)3 625 個(gè)，分子式為C1154H1812N314O330S15，理論等電點(diǎn)（PI）值為5.72。該蛋白由20 種氨基酸組成，帶31 個(gè)負(fù)電荷殘基（Asp+Glu），帶26 個(gè)正電荷殘基（Arg+Lys）；其中Leu（L）含量最高為10.2%，Trp（W）含量最低為1.3%；當(dāng)N 端的1 個(gè)氨基酸為M（Met）時(shí)，P450 蛋白在體外哺乳動(dòng)物網(wǎng)狀紅細(xì)胞中的半衰期為30 h，在酵母體內(nèi)的半衰期大于20 h，在大腸埃希菌體內(nèi)的半衰期大于10 h。蛋白質(zhì)不穩(wěn)定系數(shù)（Instability index）為51.08，表明其是不穩(wěn)定蛋白；總平均親水性（Grand average of hydropathicity）為-0.212，為親水性蛋白，親水性蛋白有利于蛋白的高效率表達(dá)和抗原抗體的嵌合。

2.3.2 P450 蛋白跨膜區(qū)和信號(hào)肽的預(yù)測(cè) 利用TMH MM 預(yù)測(cè)P450 蛋白跨膜區(qū)和信號(hào)肽，結(jié)果顯示該蛋白跨膜區(qū)中的氨基酸期望值約為0.0829，當(dāng)期望值>18 時(shí)有跨膜區(qū)，P450 蛋白無(wú)跨膜區(qū)，蛋白全部在膜外。利用SignalP 軟件對(duì)P450 蛋白的信號(hào)肽序列預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)其不存在信號(hào)肽。但利用SecretomeP 軟件預(yù)測(cè)非典型分泌蛋白發(fā)現(xiàn)，P450 蛋白NN-Score=0.800（若NN-Score>0.5，判定為分泌蛋白），所以該蛋白屬于分泌蛋白。結(jié)果表明，該蛋白不含有跨膜區(qū)和信號(hào)肽，屬于膜外分泌蛋白，推測(cè)該蛋白可能在細(xì)胞合成后直接被分泌從而發(fā)揮生物學(xué)作用。

2.3.3 P450 蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 利用SWISSMODEL 對(duì)P450 蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示，P450 蛋白由α 螺旋、β 折疊、β 轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)卷曲等二級(jí)結(jié)構(gòu)，經(jīng)盤(pán)繞、折疊和卷曲等一系列復(fù)雜的過(guò)程形成的三級(jí)結(jié)構(gòu)（圖3）。

圖3 P450 蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig. 3 Tertiary structure prediction of P450 protein

2.3.4 P450 蛋白抗原表位的分析 在機(jī)體的免疫應(yīng)答過(guò)程中，T 細(xì)胞的抗原受體（TCR）和B 細(xì)胞的抗原受體（BCR）所識(shí)別的表位特性不同，分別被稱(chēng)為T(mén) 細(xì)胞表位和B 細(xì)胞表位。綜合3 種B 細(xì)胞抗原表位預(yù)測(cè)方法結(jié)果顯示，B 細(xì)胞抗原表位分別位于P450蛋 白 的aa5～aa7、aa24～aa31、aa45～aa57、aa97～aa108、aa123～aa137、aa152～aa165、aa209～aa223 等7 個(gè)氨基酸區(qū)段。該蛋白有11 個(gè)潛在的T 細(xì)胞抗原表位，分別 位 于aa12～aa15、 aa25～aa28、 aa43～aa57、 aa68～aa77、aa81～aa87、aa103～aa106、aa135～aa138、aa165～aa174、aa196～aa200、aa206～aa210、aa213～aa217 氨基酸區(qū)間。這表明P450 蛋白具有較好的抗原性，有成為免疫診斷抗原的潛力。

P450 蛋白為親水性膜外分泌蛋白，具有7 個(gè)潛在B 細(xì)胞抗原表位，11 個(gè)潛在T 細(xì)胞抗原表位。在機(jī)體的免疫應(yīng)答過(guò)程中，抗原通過(guò)抗原表位與相應(yīng)的淋巴細(xì)胞表面的抗原受體結(jié)合，而捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)P450 蛋白有較多的抗原表位，說(shuō)明其具有良好的抗原性，有望用作捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)耐藥性診斷抗原。細(xì)胞色素P450 蛋白酶是公認(rèn)的藥物代謝第一相關(guān)酶，了解其相關(guān)性質(zhì)及作用機(jī)制，對(duì)臨床上合理、安全用藥、避免藥物的不良反應(yīng)及充分發(fā)揮藥效具有重要的意義，但是目前對(duì)于細(xì)胞色素P450 的研究多集中于哺乳動(dòng)物，對(duì)于寄生蟲(chóng)尤其是捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)的研究卻很少。本研究構(gòu)建了原核表達(dá)質(zhì)粒pETP450，表達(dá)了rP450，為捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)藥物代謝以及耐藥性產(chǎn)生機(jī)制的深入研究奠定了基礎(chǔ)。