殷志斌 黃文潔 伍欣宙 晏石娟

（1. 廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物基因研究中心 廣東省農(nóng)作物種質(zhì)資源保存和利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510640；2. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，廣州 510642）

植物體內(nèi)含有極其豐富且化學(xué)結(jié)構(gòu)多樣的代謝物。這些內(nèi)源代謝物在維持植物生長發(fā)育和抵御各種逆境脅迫中都發(fā)揮了至關(guān)重要的作用［1-3］。眾多植物內(nèi)源代謝物還是人類生活必需品的重要來源。例如，除蟲菊可用于提取殺蟲劑成分，茉莉和檀香可用作香水，三葉膠可用作橡膠，香樟可用作香料等［4］。很多藥用植物被人們陸續(xù)發(fā)現(xiàn)和被用于提取特異性藥物成分，例如從青蒿中提取出有抗瘧活性的倍半萜內(nèi)酯類化合物青蒿素［5］。盡管近10年來我們結(jié)合代謝組與基因組等技術(shù)，對(duì)主要農(nóng)作物中代謝物生物合成途徑的調(diào)控機(jī)制及遺傳解析［6］、代謝工程研究［7］和代謝網(wǎng)絡(luò)及功能研究進(jìn)展迅速［8-11］，但是對(duì)代謝物在植物體內(nèi)何時(shí)、何地產(chǎn)生和貯藏仍有待進(jìn)一步探究。事實(shí)上，植物體內(nèi)代謝物的合成和累積往往具有精準(zhǔn)的空間分布，且生理功能常與其在組織甚至單細(xì)胞中的空間分布緊密相關(guān)。因此，實(shí)現(xiàn)高空間分辨地精準(zhǔn)定位組織中代謝物的分布對(duì)闡明植物中代謝物的合成、積累和調(diào)控機(jī)理至關(guān)重要。

圖1 1997-2019年間代謝組學(xué)文章發(fā)表數(shù)

傳統(tǒng)的代謝組學(xué)旨在闡析動(dòng)植物組織或細(xì)胞中含有的代謝物整體含量及其變化規(guī)律。隨著研究的不斷深入，缺少空間分辨信息對(duì)于代謝組學(xué)分析來說是不完整的?？臻g分辨代謝組學(xué)作為一個(gè)新興前沿的分析技術(shù)，即整合質(zhì)譜成像（Mass spectrometry imaging，MSI）和代謝組學(xué)手段，利用前者可準(zhǔn)確識(shí)別并定位多種代謝物在組織、甚至細(xì)胞間的差異性分布，利用后者可對(duì)目標(biāo)微區(qū)域組織進(jìn)行深度代謝組學(xué)分析，獲得代謝物種類和含量。質(zhì)譜成像技術(shù)以其無需探針標(biāo)記、非特異性檢測(cè)、可一次分析同時(shí)獲得數(shù)百個(gè)代謝物分子的成像等優(yōu)勢(shì)，可直接捕獲目標(biāo)代謝物在動(dòng)/植物組織中的空間分布，為代謝組學(xué)分析提供了一種新的研究手段。空間分辨代謝組學(xué)（Spatially resolved metabolomics）一詞最早于2007年由Sumner課題組在美國植物學(xué)聯(lián)合年會(huì)上提出［12］，當(dāng)時(shí)主要是利用激光切割顯微鏡技術(shù)結(jié)合代謝組學(xué)手段來進(jìn)行代謝物在組織層面的分辨。從2010年開始，Sumner等［1］、Lee等［13］和Horn等［14］才真正將MSI技術(shù)引入到植物組織的代謝組學(xué)研究中。2019年，Sun等［15］和Yamamoto等［16］利用基于MSI的空間代謝組學(xué)技術(shù)分別對(duì)人鱗片狀食管癌組織中代謝相關(guān)的差異代謝物和植物單細(xì)胞中功能代謝物進(jìn)行空間定位。進(jìn)一步將空間分辨代謝組學(xué)技術(shù)從植物領(lǐng)域拓展到了動(dòng)物組織甚至單細(xì)胞領(lǐng)域。得益于質(zhì)譜儀器成像分辨率和檢測(cè)靈敏度的提高，空間分辨代謝組學(xué)突破了傳統(tǒng)代謝組學(xué)信息深度不足的缺點(diǎn)，將組學(xué)信息拓展到了二維水平，極大地提升了對(duì)樣品信息的認(rèn)知。如圖1所示，以關(guān)鍵詞“Mass spectrometry imaging”、“Metabonomics& metabolomics”和“Spatial metabolomics & Spatially resolved metabolomics”在Web of Science上進(jìn)行搜索。從1997年-2019年間質(zhì)譜成像、代謝組學(xué)和空間分辨代謝組學(xué)技術(shù)的發(fā)表論文數(shù)目的增長趨勢(shì)來看，MSI技術(shù)仍是當(dāng)前十分熱門的研究領(lǐng)域之一。本文系統(tǒng)總結(jié)了代謝組學(xué)和MSI技術(shù)的研究現(xiàn)狀；重點(diǎn)綜述了空間分辨代謝組學(xué)在動(dòng)/植物組織和單細(xì)胞層面的最新應(yīng)用進(jìn)展；最后對(duì)空間分辨代謝組學(xué)技術(shù)的現(xiàn)有瓶頸和未來發(fā)展進(jìn)行了總結(jié)和展望。

1 空間分辨代謝組學(xué)的研究進(jìn)展

1.1 代謝組學(xué)技術(shù)

代謝組學(xué)（Metabonomics 或者M(jìn)etabolomics）的概念是在20世紀(jì)末由Jeremy Nicholson和 Oliver Fiehn先后提出［17-18］，旨在對(duì)某一特定條件下（病理、生理或基因型）的生物、組織或細(xì)胞中所有低分子量化合物進(jìn)行定性與定量分析，以及對(duì)不同條件下代謝動(dòng)態(tài)應(yīng)答的定量測(cè)定［19］。因此，代謝組學(xué)是一門關(guān)于生物體內(nèi)源性代謝物質(zhì)的整體及其變化規(guī)律的科學(xué)，它是繼蛋白質(zhì)組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和基因組學(xué)發(fā)展之后的一種新興組學(xué)技術(shù)。由于其發(fā)展迅速，目前已被成功地應(yīng)用于生命科學(xué)和食品科學(xué)的多個(gè)研究領(lǐng)域。直至2019年，代謝組學(xué)的研究論文發(fā)表數(shù)一直處于指數(shù)級(jí)增長（圖1）。

代謝組學(xué)的數(shù)據(jù)采集技術(shù)主要基于（1）色譜技術(shù)，如氣相色譜（Gas chromatography，GC）、液相 色 譜（Liquid chromatography，LC）、毛 細(xì) 管 電泳（Capillary electrophoresis，CE）；（2）質(zhì)譜（Mass spectrometry，MS）技術(shù)；（3）核磁共振技術(shù)（Nuclear magnetic resonance，NMR）；（4）傅里葉變換-紅外光譜技術(shù)（Fourier transform-infrared spectrometer，F(xiàn)T-IR）等。其中，發(fā)展迅速、研究深入且應(yīng)用廣泛的主要是NMR技術(shù)和色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)。NMR技術(shù)是通過對(duì)小分子代謝物中1H、13C、15N和32P等原子核在電場(chǎng)中能級(jí)躍遷進(jìn)行檢測(cè)，從而獲得代謝物的化學(xué)組成。由于樣品前處理簡(jiǎn)單、對(duì)樣品破壞性小、非特異性檢測(cè)且結(jié)構(gòu)信息豐富，NMR技術(shù)已成為代謝組學(xué)研究中不可或缺的方法之一。但該技術(shù)也有一些不足，如靈敏度相對(duì)較低、動(dòng)態(tài)檢測(cè)范圍較小，不太適合于復(fù)雜體系中含量差異較大的多種物質(zhì)同時(shí)檢測(cè)。為此，通過提高磁場(chǎng)強(qiáng)度或使用超低溫冷卻探頭等手段，可在一定程度上提高NMR技術(shù)的靈敏度和分辨率問題［20］。GC-MS技術(shù)具有高靈敏度、高分辨、高重現(xiàn)性和較為完整的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖數(shù)據(jù)庫等優(yōu)點(diǎn)，應(yīng)用非常廣泛，迄今仍然是主要的代謝組學(xué)研究平臺(tái)之一。但由于GC-MS技術(shù)常要求待測(cè)分子具有揮發(fā)性，因此無法對(duì)熱穩(wěn)定性差或分子量較大的化合物進(jìn)行檢測(cè)。盡管可以利用衍生化等手段來改善樣品的揮發(fā)性，但衍生化反應(yīng)過程中常常會(huì)引入一些干擾物質(zhì)。相比于氣態(tài)樣品分析，LC-MS技術(shù)不僅具有相同的優(yōu)勢(shì)（如靈敏度高、分析速度快和分辨率高），還十分適合于高沸點(diǎn)、熱不穩(wěn)定性和大分子量等待測(cè)物的檢測(cè)。此外，相比于NMR技術(shù)，其動(dòng)態(tài)范圍和檢測(cè)靈敏度得以大幅提升。最近，二維液相色譜技術(shù)的提出，大大提高了LC-MS技術(shù)的分離能力和峰容量，進(jìn)一步提高了分析通量。CE-MS是利用陰/陽離子電泳速度不同來實(shí)現(xiàn)離子型化合物的分析，由于該技術(shù)樣品消耗量小，成本低，且無需進(jìn)行衍生化處理等優(yōu)勢(shì)而得到廣泛應(yīng)用，但其在靈敏度和分辨率方面略有不足，因此在植物代謝組學(xué)分析中應(yīng)用相對(duì)較少。

代謝組學(xué)的數(shù)據(jù)分析技術(shù)包括質(zhì)譜數(shù)據(jù)的預(yù)處理（峰對(duì)齊、濾噪、離子提取等）、未知代謝物的鑒定、化學(xué)計(jì)量學(xué)理論和多元統(tǒng)計(jì)分析等相關(guān)技術(shù)，它們隨著代謝組數(shù)據(jù)采集技術(shù)的迅速發(fā)展而不斷更新［21-26］。盡管系列公共代謝組學(xué)數(shù)據(jù)庫的公開在未知代謝物的鑒定中發(fā)揮了重要作用，如Madison metabolomics consortium database（MMCD）［27］、MassBank［28］、KNApSAcK core database［29］、Plant metabolome database（PMD）［30］、Metlin［31］、RIKEN tandem mass spectral database（ReSpect）［32］、MeltDB［33］、Golm metabolome database（GMD）［34］等。但至今為止，大部分代謝物還是不能被鑒定出來。因此，國內(nèi)外研究人員致力于開發(fā)出用于解析質(zhì)譜和核磁共振數(shù)據(jù)的新技術(shù)及通過整合代謝途徑信息進(jìn)行代謝物注釋的工具［35-39］。朱正江課題組開發(fā)了一款MetDNA軟件算法，可實(shí)現(xiàn)小分子代謝物的精確結(jié)構(gòu)鑒定，無需依賴于完備的代謝物標(biāo)準(zhǔn)品二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫，便可大規(guī)模提高其鑒定數(shù)量和覆蓋率［38］。最近，他們還發(fā)展了一種基于離子淌度質(zhì)譜的碰撞截面數(shù)據(jù)庫（AIICCS），并針對(duì)生命體內(nèi)已知和未知代謝物的化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了鑒定［39］。

植物代謝組學(xué)是代謝組學(xué)的重要分支，植物相關(guān)的代謝物約有20-100萬種。因此，植物代謝組學(xué)對(duì)揭示生命基本活動(dòng)和規(guī)律十分重要，隨著靶向/非靶向代謝組學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，以及代謝物數(shù)據(jù)庫和數(shù)據(jù)分析軟件的不斷完善，代謝組學(xué)已被廣泛用于功能基因組、天然產(chǎn)物的合成生物學(xué)及質(zhì)量評(píng)價(jià)研究等。Fiehn等［18］最早將代謝組學(xué)技術(shù)用于擬南芥的功能基因組研究中。對(duì)4種不同基因型擬南芥材料共檢測(cè)到326個(gè)代謝物，并最終區(qū)分沒有明顯表型的突變體及野生型擬南芥。Baniasadi等［40］在6個(gè)區(qū)域種植了50種非轉(zhuǎn)基因玉米品種，隨后利用非靶向代謝組學(xué)探究了種植環(huán)境和遺傳因素對(duì)其影響。結(jié)果表明相比于遺傳背景，種植環(huán)境對(duì)玉米谷粒的代謝組影響更大。Chang等［41］利用代謝組學(xué)和脂質(zhì)組學(xué)方法對(duì)農(nóng)藥脅迫不同時(shí)間后非轉(zhuǎn)基因和轉(zhuǎn)基因水稻葉片上的代謝應(yīng)答進(jìn)行了分析，證明了轉(zhuǎn)基因確實(shí)會(huì)對(duì)農(nóng)藥脅迫下水稻的代謝應(yīng)答產(chǎn)生影響。

此外，代謝組學(xué)技術(shù)還被用于動(dòng)物科學(xué)和食品科學(xué)等研究領(lǐng)域。如Sun等［42］利用代謝組學(xué)技術(shù)對(duì)食用常規(guī)飼糧和高脂肪飼糧的豬的尿液、糞便和血漿進(jìn)行了聚類分析，發(fā)現(xiàn)了氨基酸類、脂質(zhì)類和膽汁酸等代謝物可作為不同飼糧喂食后豬代謝絮亂差異的生物標(biāo)志物。De Pascali等［43］通過代謝組學(xué)技術(shù)對(duì)喂食5種混合藥物后的仔豬尿液進(jìn)行了差異代謝物分析和評(píng)價(jià)。同時(shí)，代謝組學(xué)也為食品中營養(yǎng)及功能成分的作用機(jī)制和代謝途徑的研究提供了可能。例如，Xia等［44］利用代謝組學(xué)手段確定了馬奶發(fā)酵為馬奶酒過程中的7個(gè)關(guān)鍵代謝途徑，并揭示了初級(jí)膽汁酸和γ-亞麻酸等功能代謝物的下調(diào)與馬奶及馬奶酒的功效有直接關(guān)聯(lián)。除了功能性營養(yǎng)成分，風(fēng)味也是影響食品品質(zhì)的關(guān)鍵因素之一。Potts等［45］通過液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)鑒定到乳清酸、泛酸、馬尿酸和對(duì)甲酚硫酸酯4種化合物對(duì)脫脂牛奶、低脂牛奶、全脂牛奶等的口感和風(fēng)味有很大影響。

1.2 質(zhì)譜成像技術(shù)

質(zhì)譜成像技術(shù)，亦稱為成像質(zhì)譜技術(shù)，是最近發(fā)展起來的一門新興成像技術(shù)，已被廣泛用于動(dòng)物組織、植物組織、甚至單細(xì)胞中藥物、代謝物、多肽和蛋白的時(shí)空分布研究。為了避免與離子淌度譜（Ion mobility spectrometry，IMS）技術(shù)混淆，本文中統(tǒng)一將其表述為MSI。早在1967年，Liebl等［46］就利用二次離子質(zhì)譜（Secondary ion mass spectrometry，SIMS）對(duì)元素和小分子有機(jī)物進(jìn)行了成像分析。但直 到1987年，Tanaka等［47］和Karas等［48］發(fā) 明了基質(zhì)輔助激光解吸/電離（Matrix-assisted laser desorption/ionization，MALDI）技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)分子量大于10 kD蛋白的測(cè)定，開創(chuàng)了將MALDI質(zhì)譜技術(shù)用于生物大分子檢測(cè)的應(yīng)用中。在20世紀(jì)90年代初，Spengler等［49］和Caprioli等［50］才真正意義上將MALDI技術(shù)與MSI技術(shù)相結(jié)合并應(yīng)用到生物組織中小分子、多肽和蛋白成像，由此開啟了MSI的新紀(jì)年。此后該技術(shù)得到了不斷的發(fā)展和應(yīng)用拓展，時(shí)至今日MSI已成為最熱門且活躍的交叉學(xué)科研究領(lǐng)域之一。

目前，按照離子源不同，常將MSI分為以下幾種：MALDI-MSI、SIMS成像、解吸電噴霧電離質(zhì)譜成像（Desorption electrospray ionization MSI，DESI-MSI）、激光濺射-電噴霧電離質(zhì)譜成像（Laser ablation electrospray ionization MSI，LA-ESI-MSI）等。其中，MALDI-MSI已成為當(dāng)前最主流且應(yīng)用最廣泛的一類技術(shù)。首先，根據(jù)動(dòng)/植物組織樣品性質(zhì)不同選擇合適的樣品制備，如針對(duì)動(dòng)物組織（腦、腎臟等）和植物組織（根、莖等）進(jìn)行冷凍切片（厚度約為5-20 μm），針對(duì)葉片和花瓣等植物組織進(jìn)行壓印轉(zhuǎn)移［49］；根據(jù)待測(cè)物種類和性質(zhì)選擇合適的MALDI基質(zhì)進(jìn)行噴涂；采用激光束對(duì)每個(gè)采樣點(diǎn)進(jìn)行解吸采樣并使其離子化產(chǎn)生離子；隨后，通過XY二維平臺(tái)對(duì)組織樣品進(jìn)行移動(dòng)，通過質(zhì)譜儀對(duì)待測(cè)物離子進(jìn)行分離和檢測(cè)，獲得與樣品空間位置相關(guān)聯(lián)的質(zhì)譜圖；最后，將所有的質(zhì)譜數(shù)據(jù)與其相應(yīng)的二維空間位置進(jìn)行匹配重組便可獲得MSI圖。MALDI-MSI的基本原理是將能吸收337 nm或355 nm紫外激光的基質(zhì)分子與待測(cè)物混合形成共晶，利用基質(zhì)分子吸收激光能量以防止多余能量直接作用在待測(cè)物分子使其發(fā)生碎片。因此，MALDI技術(shù)因其具有軟電離特性、超高的檢測(cè)靈敏度和耐鹽性好等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛用于蛋白、核酸等生物大分子分析。事實(shí)上，1997年Caprioli等［50］就利用MALDI-MSI實(shí)現(xiàn)了小鼠胰腺組織中胰島素和小鼠腦垂體中激素肽的空間分布成像。隨著MALDI基質(zhì)的不斷開發(fā)和質(zhì)譜儀器的迅猛發(fā)展，使得該技術(shù)在內(nèi)源性代謝物、脂質(zhì)、外源性藥物等小分子成像中得到了廣泛的關(guān)注和發(fā)展。受限于激光聚焦光斑大小和共結(jié)晶顆粒大小，MALDIMSI的空間分辨率一般約為20 μm。

SIMS是目前為止具有最高空間分辨率的一種質(zhì)譜成像方法。根據(jù)離子束類型和束流大小不同可分為動(dòng)態(tài)SIMS和靜態(tài)SIMS。前者通常使用高能濺射離子束，如O-源（正離子模式）和Cs+源（負(fù)離子模式），可獲得低至50 nm的超高空間分辨率。但由于離子束束流很大，具有極強(qiáng)的破壞性，會(huì)將所有分子全部打碎成單原子離子或多原子離子，因此只適用于元素成像?？紤]到采用元素來代表完整分子進(jìn)行空間定位，常受到其他背景元素的干擾，因此無法真實(shí)反映細(xì)胞內(nèi)代謝物分子的原始分布。此外，盡管動(dòng)態(tài)SIMS擁有目前為止最高的空間分辨率，但由于其無法獲得完整分子信息，在代謝物和生物大分子成像領(lǐng)域應(yīng)用仍十分受限。為此，以多原子離子束（等）［51-52］和團(tuán)簇原子離子束等）［53-54］為核心的靜態(tài)SIMS很好地補(bǔ)充了上述動(dòng)態(tài)SIMS成像分析的不足，可用于分子量小于1000 Da的脂質(zhì)、代謝物、小分子藥物和部分元素的單細(xì)胞成像分析［55］。雖然靜態(tài)SIMS成像對(duì)元素和分子碎片可實(shí)現(xiàn)低至亞微米級(jí)的空間分辨率，但受限于較低的電離效率，其在完整分子水平的空間分辨率仍停留在低微米量級(jí)，因此在空間分辨代謝組學(xué)研究中仍有待進(jìn)一步發(fā)展。

與MALDI-MSI和SIMS成像技術(shù)都在高真空下進(jìn)行有所不同，DESI-MSI在大氣壓下即可實(shí)現(xiàn)待測(cè)物分子的離子化和成像，樣品前處理簡(jiǎn)單，適合小分子和大分子分析，可實(shí)現(xiàn)真正意義上的原位分析。2004年，Nanita等［56］首次報(bào)道了DESI源，其基本原理是萃取溶劑在霧化氣和電壓的作用下形成電噴霧，并以一定角度噴掃樣品表面，當(dāng)二者接觸時(shí)溶劑可以快速地將待測(cè)物溶解并形成帶電液滴，隨后帶電液滴以合適的角度進(jìn)入質(zhì)譜進(jìn)樣口，從而被質(zhì)譜檢測(cè)。因其工作于常溫常壓下，且無需復(fù)雜樣品前處理和基質(zhì)輔助，DESI-MSI被廣泛用于動(dòng)/植物組織成像中。然而，DESI-MSI也有一些不足之處，例如電噴霧溶劑組成對(duì)不同的待測(cè)物可能存在解吸和離子化效率差異；其次，考慮到電噴霧液滴到達(dá)組織樣品表面時(shí)存在擴(kuò)散，因此DESI-MSI空間分辨率一般約為200 μm，較適合于大組織樣品的成像。盡管Laskin等［57］采用了解吸納噴源可將空間分辨率提高至12 μm，但普適性和操作性仍十分局限。

激光采樣技術(shù)因其具有高空間分辨率、高重復(fù)頻率和高能量輸出而被廣泛應(yīng)用于質(zhì)譜成像應(yīng)用中。2007年，Nemes等［58］首次提出了LA-ESI源，并于2009年將其用于植物細(xì)胞的整體代謝物檢測(cè)［59］。其基本原理是采用聚焦透鏡或者刻蝕后的光纖對(duì)波長為2.94 μm的遠(yuǎn)紅外激光進(jìn)行聚焦和傳輸，由于植物組織中含有的大量水分子可與該波段激光發(fā)生共振吸收，從而將植物組織甚至細(xì)胞液中代謝物濺射出來，隨后輔以一路垂直方向的ESI源對(duì)其進(jìn)行后電離，并進(jìn)入采樣口被質(zhì)譜檢測(cè)。相比于DESIMSI，LA-ESI-MSI技術(shù)的空間分辨率得以大幅提升，Shrestha等［60］以50 μm的空間分辨率實(shí)現(xiàn)了洋蔥表皮細(xì)胞間槲皮素和花青素等代謝物的差異性分布。Coello等［61］采用800 nm飛秒激光進(jìn)行非共振濺射采樣，實(shí)現(xiàn)了A. cepa表皮細(xì)胞的高分辨成像（空間分辨率為10-15 μm）。與DESI源相似，LA-ESI技術(shù)的優(yōu)勢(shì)在于可在大氣壓下直接分析且無需復(fù)雜的樣品前處理過程，但該方法要求組織樣品必須含有一定水分（與2.94 μm遠(yuǎn)紅外激光共振），盡管可采用非共振飛秒激光彌補(bǔ)這不足，但其昂貴的激光器成本不容小覷。同時(shí)，有限的空間分辨率（50-100 μm）使得該方法一般較適合于植物細(xì)胞的整體分析和較大植物組織的成像分析。

2 空間分辨代謝組學(xué)技術(shù)的前沿應(yīng)用

2.1 動(dòng)物組織

盡管代謝組學(xué)已被廣泛用于動(dòng)物組織和病理組織應(yīng)用中，但由于缺少空間維度信息導(dǎo)致無法準(zhǔn)確反映組織的動(dòng)態(tài)代謝過程以及代謝網(wǎng)絡(luò)。目前，空間分辨代謝組學(xué)在動(dòng)物組織中的應(yīng)用主要是研究腫瘤組織代謝通路、監(jiān)測(cè)外源性藥物分子在組織內(nèi)的吸收（Absorption）、分布（Distribution）、代謝（Metabolism）和排泄（Excretion）即ADME過程、候選藥物評(píng)價(jià)等。如表1所示，在細(xì)胞癌變的發(fā)生和發(fā)展過程中，癌細(xì)胞會(huì)改變自身代謝模式以適應(yīng)其生長，而代謝重編程則是維持其無限增殖的關(guān)鍵機(jī)制。許多研究表明，腫瘤細(xì)胞相比于正常細(xì)胞往往具有獨(dú)特的代謝模式和特征［15］。為此，Sun等［15］利用基于空氣動(dòng)力輔助解吸電噴霧電離（Airflow-assisted desoprtion electrospray ionization，AFADESI）的質(zhì)譜成像技術(shù)，建立了空間分辨的代謝組學(xué)方法，并以“上游代謝酶與下游代謝物相關(guān)聯(lián)”的研究策略對(duì)食管癌異常的代謝通路進(jìn)行了可視化分析。作者以256例人鱗片狀食管癌組織樣品為研究對(duì)象，利用AFADESI-MSI技術(shù)篩選出與癌細(xì)胞代謝相關(guān)的差異代謝物，揭示了包括脯氨酸合成，谷氨酸代謝，尿苷代謝，組氨酸代謝，脂肪酸合成和多胺生物合成在內(nèi)的6個(gè)代謝通路都在食管癌組織中發(fā)生了明顯的變化。同時(shí)，還驗(yàn)證了與之密切相關(guān)的6個(gè)異常表達(dá)的代謝酶，它們都廣泛參與了食管癌相關(guān)的代謝過程。因此，空間分辨代謝組學(xué)可以高通量地發(fā)現(xiàn)腫瘤組織異常變化的代謝通路，從而為深入探究腫瘤的代謝過程提供全新的研究視角。Sun等［62］還利用基于質(zhì)譜成像的代謝組學(xué)策略對(duì)乳腺癌中肉堿的新陳代謝重編程過程進(jìn)行了可視化。代謝組學(xué)結(jié)果顯示，不論是在人體還是小鼠模型中，左旋肉堿和短鏈肉堿都在乳腺癌組織中發(fā)生重新編程。此外，還發(fā)現(xiàn)了3個(gè)異常表達(dá)的代謝酶，包括肉堿棕櫚基轉(zhuǎn)移酶1A，肉堿棕櫚基轉(zhuǎn)移酶2和肉堿乙酰轉(zhuǎn)移酶，都直接參與了脂肪酸的氧化過程。Morse等［63］還利用DESI-MSI技術(shù)對(duì)前列腺癌組織進(jìn)行了空間分辨代謝組學(xué)分析，鑒定得到25個(gè)具有明顯差異分布的代謝物，其中脂肪酸和腦磷脂在癌組織中顯著上調(diào)。

除了動(dòng)物組織中內(nèi)源性代謝物外，了解并監(jiān)測(cè)外源性藥物分子在組織內(nèi)的ADME過程，對(duì)于候選藥物評(píng)價(jià)和新藥研制至關(guān)重要。Wang等［64］利用AFADESI-MSI技術(shù)對(duì)服用馬兜鈴酸I藥物后的小鼠腎臟組織進(jìn)行了空間代謝組學(xué)分析。結(jié)果表明，經(jīng)過藥物處理后的小鼠腎臟組織，其與精氨酸-肌酸酐代謝途徑、尿素循環(huán)、絲氨酸合成途徑、以及與脂質(zhì)、膽堿、組胺、賴氨酸和ATP代謝相關(guān)的38種代謝物都發(fā)生了空間分布的變化。此外，探究同分異構(gòu)體藥物在體內(nèi)的作用機(jī)制和代謝差異對(duì)于質(zhì)譜技術(shù)具有一定的挑戰(zhàn)性。Luo等［65］利用相同的方法針對(duì)兩種鎮(zhèn)靜催眠同分異構(gòu)體藥物（YZG-331和YZG-330）及其代謝物在整只小鼠切片的空間分布進(jìn)行了成像。

2.2 植物組織

植物組織中的初生和次生代謝物對(duì)于維持其生長、繁殖、營養(yǎng)和生理功能都具有緊密的關(guān)聯(lián)。因此，對(duì)植物組織中代謝物的精準(zhǔn)定位和含量測(cè)定，對(duì)闡明代謝物的合成及調(diào)控機(jī)制具有重要意義。目前，空間分辨代謝組學(xué)在植物組織中的應(yīng)用主要是代謝物的精準(zhǔn)定位、重要功能代謝產(chǎn)物的生物合成和轉(zhuǎn)運(yùn)途徑、功能基因驗(yàn)證等（表1）。理想的生物分析方法是無需進(jìn)行樣品前處理，就能提供空間分辨的定量信息。實(shí)際上，依靠單一的分析方法通常無法滿足所有需求。Berisha等［66］在不進(jìn)行樣品制備的情況下，利用LA-ESI-MSI技術(shù)得知花青素主要分布在外表皮，利用色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)藍(lán)莓中包含氨基酸、碳水化合物和花青素在內(nèi)的41種代謝物進(jìn)行鑒定。Li等［67］利用MALDI-MSI技術(shù)對(duì)光果甘草根莖組織中黃酮苷元、黃酮苷和皂苷類化合物的空間分布進(jìn)行了成像。結(jié)果表明，與黃酮苷類化合物主要分布在韌皮纖維和木纖維中不同，黃酮苷元類化合物則主要富集在木栓層中。萌發(fā)和成熟是種子生長發(fā)育過程中代謝高度活躍的兩個(gè)階段，而種子質(zhì)量又與植物的生長發(fā)育狀況密切相關(guān)。為此，Bhandari等［68］對(duì)油菜種子發(fā)育過程中不同代謝物的空間分布及動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行了研究，揭示了環(huán)亞精胺和三咖啡亞精胺會(huì)在種子萌發(fā)過程中從種子的胚軸胚根區(qū)移動(dòng)到剛要萌發(fā)的幼根上，為闡明植物不同生長發(fā)育過程中代謝物的動(dòng)態(tài)變化提供了強(qiáng)有力的研究手段［68］。Li等［69］通過對(duì)銀杏葉片內(nèi)黃酮類化合物進(jìn)行空間分辨代謝組學(xué)分析，揭示了銀杏特有的穗花雙黃酮和白果素等雙黃酮類化合物只富集在葉片表面。最近，Dai等［70］利用微型樣品制備裝置，將完整葉片分別裁切出多個(gè)1.7×1.7 mm2小葉片分別進(jìn)行代謝組學(xué)分析，開發(fā)了一種單葉片靶向空間分辨代謝組學(xué)方法。該方法實(shí)現(xiàn)了兒茶素、生物堿等56種代謝物的空間分布和定量分析，并證明了兒茶素、槲皮素苷和槲皮素可能參與了茶樹對(duì)生物/非生物脅迫的防御反應(yīng)。

表1 空間分辨代謝組學(xué)技術(shù)在動(dòng)/植物組織、單細(xì)胞中最新應(yīng)用匯總

表1 續(xù)表

除了精準(zhǔn)定位植物體內(nèi)代謝物的空間分布，綜合運(yùn)用質(zhì)譜成像技術(shù)與多組學(xué)技術(shù)，探究代謝產(chǎn)物的生物合成、轉(zhuǎn)運(yùn)和積累規(guī)律，可為發(fā)掘關(guān)鍵代謝物的生物合成途徑和解析重要酶功能提供重要的科學(xué)依據(jù)。例如，Li等［71］首次揭示了芍藥根中五～九沒食子酰葡萄糖等沒食子酰單寧類物質(zhì)的空間分布。除了五沒食子酰葡萄糖主要分布在芍藥根中，其他4種沒食子酰葡萄糖只聚集分布在木栓層和木質(zhì)部，為探究芍藥中沒食子酰單寧類物質(zhì)的合成、轉(zhuǎn)運(yùn)及積累規(guī)律提供了重要的參考依據(jù)。此外，Li等［69］還結(jié)合基因表達(dá)分析和MSI結(jié)果，證實(shí)了銀杏內(nèi)脂等物質(zhì)先在根中進(jìn)行合成，隨后從莖轉(zhuǎn)運(yùn)到葉片中。Kusari等［72］利用MSI技術(shù)揭示了兩種金絲桃屬植物（H. perforatum和H. olympicum）中金絲桃素（hypericin）等二蒽酮類化合物的前體物質(zhì)大黃素主要分布在葉片表面除腺點(diǎn)外的廣泛區(qū)域；然而，在缺少金絲桃素及其衍生物的H. patulum植物中，大黃素只聚集在葉片表面的腺點(diǎn)中。這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證了之前的假說：金絲桃素是在葉片腺點(diǎn)之外的部位進(jìn)行生物合成，再經(jīng)轉(zhuǎn)運(yùn)和積累在腺點(diǎn)中。油籽工程成分的改變是通過引入新的酶反應(yīng)或者阻斷/促進(jìn)現(xiàn)有酶反應(yīng)進(jìn)行的。然而在實(shí)際過程中，種子中積累的脂類種類數(shù)量往往與酶表達(dá)水平所預(yù)測(cè)的不同。為此，Woodfield等［73］利用MSI技術(shù)發(fā)現(xiàn)油菜（Brassica napus）的三酰基甘油及其磷脂前體在子葉和胚軸中分布不同，暗示了三酰基甘油代謝存在組織特異性。棕櫚酸主要分布于胚軸處，而異油酸、亞麻油酸和α-亞油酸等優(yōu)先定位于種皮和糊狀層。此外，Horn等［74］還揭示了脂質(zhì)分布在細(xì)胞水平上的異質(zhì)性可能普遍存在，通過對(duì)陸地棉種子組織中的多種脂類物質(zhì)（如三酰基甘油、磷脂酰乙醇胺、磷脂酸、甾醇和棉酚等）進(jìn)行MSI分析，發(fā)現(xiàn)三?；视秃土字Ｄ憠A主要貯存于棉花胚胎。最近，Dong等［75］利用超高質(zhì)量分辨率MALDIMSI方法對(duì)番茄果實(shí)中甾體糖苷類生物堿（Steroidal glycoalkaloids，SGAs）的合成途徑進(jìn)行了可視化分析，通過比較GAME25基因沉默型和野生型的番茄果實(shí)中SGAs的空間分布差異，證實(shí)了GAME25基因確實(shí)會(huì)導(dǎo)致飽和SGAs朝非飽和SGAs轉(zhuǎn)化途徑移動(dòng)。Korenblum等［76］利用相同的方法對(duì)不同微生物群落誘導(dǎo)番茄根系分泌物的特異性變化進(jìn)行了分析，揭示了Acylsucrose S1：5主要分布在側(cè)根尖，而Acylsucrose S4：19主要分布在主根的根毛上；與之相反，SGAs、木脂素、羥基肉桂酸和有機(jī)酸等代謝物在整個(gè)根部都有積累。Schleyer等［77］利用MSI方法揭示了海洋球石藻（Emiliania huxleyi）與其特定病毒之間的宿主-病毒相互作用的代謝機(jī)制。以葉綠素和7個(gè)脂質(zhì)類分子作為生物標(biāo)志物，動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)了整個(gè)病毒感染過程。

除了對(duì)植物自身代謝物的轉(zhuǎn)運(yùn)和積累過程進(jìn)行可視化外，還可利用MSI技術(shù)對(duì)病蟲害侵染之后的植物應(yīng)激代謝物進(jìn)行探究。Barbosa等［78］比較了受根結(jié)線蟲侵染和未受根結(jié)線蟲侵染的番茄根節(jié)中次生代謝物、多肽和蛋白的空間差異分布，揭示了根結(jié)線蟲侵染后會(huì)使得某些多肽和蛋白表達(dá)量下調(diào)，且脂類代謝物的種類和豐度也明顯下降。Shroff等［79］結(jié)合MSI和高效液相色譜分析，發(fā)現(xiàn)了幾種主要芥子油甙在葉片的中脈和邊緣分布比內(nèi)部位置更多，而芥子油甙類代謝物在葉片中分布可能控制了棉鈴幼蟲的取食偏好，這也解釋了為什么棉鈴蟲幾乎不食用擬南芥葉片的中脈和邊緣，只食用內(nèi)部葉片。芥子油甙類代謝物的差異性分布可能對(duì)葉片的防御機(jī)制起到了重要作用，避免食草動(dòng)物或昆蟲經(jīng)常從葉片邊緣開始食用。

2.3 單細(xì)胞水平

一切生命的關(guān)鍵科學(xué)問題都要到細(xì)胞中去尋找。隨著質(zhì)譜儀器空間分辨率和靈敏度的快速提升，使得單細(xì)胞分析甚至單細(xì)胞成像成為了可能。每個(gè)細(xì)胞，即使是相同類型的細(xì)胞，自身都具有較大的異質(zhì)性，因此在單個(gè)細(xì)胞水平上進(jìn)行研究，不僅可以探究生命科學(xué)的起源，還可揭示重大疾病病變機(jī)理、生命現(xiàn)象活動(dòng)規(guī)律、靶向藥物開發(fā)和治療等科學(xué)問題。單細(xì)胞中代謝物分析主要分為整體分析和成像分析，前者只能獲得細(xì)胞與細(xì)胞間的代謝物差異，而丟失了它們的空間定位信息；而后者可以進(jìn)一步洞悉單細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞器間代謝物的差異性分布（圖2）。然而，不同于單細(xì)胞的蛋白組學(xué)或基因組學(xué)可對(duì)待測(cè)物分子進(jìn)行熒光標(biāo)記和信號(hào)放大，即使是對(duì)單細(xì)胞進(jìn)行整體分析都十分具有挑戰(zhàn)性。目前，空間分辨代謝組學(xué)在單細(xì)胞中的應(yīng)用主要是內(nèi)源性代謝物和外源性藥物分布、功能性代謝物的從頭生物合成過程監(jiān)測(cè)、納米載藥誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡等。

Mizuno和Masujima等［80-81］于2008年首次提出了“Live single-cell video-mass spectrometry”策略，即先在高倍顯微鏡下利用1-5 μm曲率直徑的毛細(xì)管針尖對(duì)單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行采樣，隨后將其作為納噴針直接進(jìn)行電噴霧電離質(zhì)譜分析。結(jié)果表明，在正離子模式下可檢測(cè)到66個(gè)顆粒體特異的譜峰和8個(gè)細(xì)胞質(zhì)特異的譜峰。隨后，他們對(duì)7種不同細(xì)胞的不同位置進(jìn)行了主成分分析實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞的聚類和鑒別。Gong等［82］結(jié)合了固相微萃?。⊿olid-phase microextraction，SPME）技術(shù)，開發(fā)了探針電噴霧離子源。將直徑約為1 μm的SPME探針插入活細(xì)胞中對(duì)代謝物進(jìn)行富集，隨后輔以ESI將富集得到的代謝物直接電離檢測(cè)，靈敏度可提高近30倍。利用該方法可實(shí)現(xiàn)單個(gè)洋蔥細(xì)胞中多種代謝物的測(cè)定（如6種果聚糖、4種脂質(zhì)和8種黃酮類衍生物等）。還發(fā)現(xiàn)了不同細(xì)胞類型之間及同一細(xì)胞不同細(xì)胞器之間的代謝物差異顯著，內(nèi)表皮細(xì)胞相比外表皮細(xì)胞具有20倍含量更高的果聚糖，而外表皮細(xì)胞則含有較多的脂質(zhì)成分。此外，Wei等［83-84］進(jìn)一步將直流電壓改成脈沖電壓和階梯升壓形式，有助于快速移除細(xì)胞液中基體分子，還可延長分析時(shí)間，僅需pL級(jí)的單細(xì)胞液體便可同時(shí)獲得一級(jí)譜圖和串級(jí)譜圖，從而實(shí)現(xiàn)單個(gè)洋蔥細(xì)胞中162種代謝物和28種不同修飾多糖分子的精確鑒定。

圖2 激光采樣的空間分辨率對(duì)單細(xì)胞質(zhì)譜成像的影響［85-88］

除了細(xì)胞間代謝物組成和含量的差異分析，我們更希望進(jìn)一步探究細(xì)胞內(nèi)分子的差異性分布，特別是內(nèi)源性代謝物分布、外源性藥物及其代謝產(chǎn)物的作用位點(diǎn)信息。然而相比于單細(xì)胞整體分析，要想實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞質(zhì)譜成像就要求其具有超高空間分辨率（采樣的激光光斑或離子束斑小于1 μm）且絕對(duì)檢出限應(yīng)達(dá)到amol量級(jí)［85］。2012年，Schober等［86］將MALDI技術(shù)用于HeLa細(xì)胞成像中，對(duì)DIOC6熒光染料分子可實(shí)現(xiàn)空間分辨率為7 μm的成像分析，雖然也可以獲得一些脂質(zhì)分子的成像，但7 μm的分辨率對(duì)于單細(xì)胞來說仍然無法提供太多空間分布細(xì)節(jié)；2017年，Kompauer等［87］進(jìn)一步優(yōu)化質(zhì)譜儀器系統(tǒng)，對(duì)單細(xì)胞中如甘油一/二酯、卵磷脂、神經(jīng)酰胺和小肽等實(shí)現(xiàn)了1.4 μm的高空間分辨率成像，共檢測(cè)到P. caudatum和Rotifera細(xì)胞中19個(gè)內(nèi)源代謝物。為了進(jìn)一步突破光學(xué)衍射極限，國內(nèi)Yin等［88］研制了一臺(tái)基于納米有孔光纖的近場(chǎng)激光解吸后電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀，并將其應(yīng)用于單細(xì)胞的化學(xué)-形貌共成像分析。該儀器兼具高傳輸效率（高真空采樣）、高電離效率（157 nm單光子后電離源）和高空間分辨率（～ 350 nm），可實(shí)現(xiàn)成像分辨率高達(dá)250 nm、絕對(duì)檢出限低至亞amol的單細(xì)胞藥物成像分析。首次在真空下將原子力顯微鏡和質(zhì)譜儀合二為一，自帶的原子力成像功能使其可同時(shí)獲得單細(xì)胞表面三維形貌圖，大大拓展了MSI技術(shù)在單細(xì)胞水平的綜合表征能力。Cheng等［89］利用該儀器揭示了具有相似結(jié)構(gòu)的兩種吖啶類藥物在HeLa細(xì)胞內(nèi)分布規(guī)律完全不同，且熒光成像無法獲得依沙吖啶藥物的空間分布，進(jìn)一步證明了質(zhì)譜成像技術(shù)的無標(biāo)記、廣譜性等優(yōu)勢(shì)。同時(shí)，還實(shí)現(xiàn)了單細(xì)胞中金納米粒子（AuNPs）和銀納米粒子（AgNPs）的分布成像［90］。最近，Meng等［91］成功研制出了微透鏡光纖激光解吸/電離成像質(zhì)譜儀，實(shí)現(xiàn)了對(duì)細(xì)胞內(nèi)多種內(nèi)/外源性的元素和分子在細(xì)胞器水平上的可視化定位。該方法在單細(xì)胞表面可得到低至350 nm直徑的采樣彈坑，且對(duì)2 μm起伏高度的實(shí)際樣品可保持均勻剝蝕，避免了由于高度起伏造成的成像假象。將抗癌藥物紅霉素負(fù)載在葉酸信號(hào)分子修飾的超順磁性氧化鐵納米顆粒表面，并與HeLa細(xì)胞共同培養(yǎng)，利用MSI技術(shù)對(duì)靶向藥物從納米顆粒表面釋放進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，而后進(jìn)入細(xì)胞核，并最終誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡這一動(dòng)態(tài)過程進(jìn)行了直接可視化。

萜類吲哚類生物堿（Terpenoid indole alkaloid，TIA）是一類具有重要生物活性的化合物，為此，Yamamoto等［16］利用質(zhì)譜成像技術(shù)和單細(xì)胞代謝組學(xué)技術(shù)，對(duì)長春花藥用植物中TIA等抗腫瘤藥物及其中間產(chǎn)物在單細(xì)胞水平進(jìn)行了空間定位。結(jié)果表明，長春堿、Serpentine、Ajmalicine和Vindoline等TIA中間體，主要積累在異形細(xì)胞和乳管細(xì)胞中。以嘌呤小體為代表的代謝區(qū)室，是指由代謝途徑的順序酶組成的多蛋白復(fù)合物，亦被科學(xué)界廣泛認(rèn)為是細(xì)胞內(nèi)生物合成的“熱點(diǎn)”。最近，Pareek等［92］利用空間分辨代謝組學(xué)手段，直接可視化觀測(cè)了嘌呤小體對(duì)功能最豐富的細(xì)胞代謝產(chǎn)物——嘌呤的從頭生物合成過程。結(jié)果表明，嘌呤小體是由9種協(xié)同作用的酶組成，引導(dǎo)中間體合成嘌呤核苷酸，提高了整個(gè)通路的運(yùn)行速率和通量，并影響一磷酸腺苷/鳥苷的比例。質(zhì)譜成像結(jié)果揭示了嘌呤的產(chǎn)生聚集于細(xì)胞的嘌呤小體內(nèi)，靠近線粒體的嘌呤小體可能是嘌呤從頭合成的活性中心。該研究也是第一次整合單細(xì)胞質(zhì)譜成像和代謝組學(xué)技術(shù)證明了嘌呤小體的存在，有助于更好地理解嘌呤小體這一代謝區(qū)室在癌癥發(fā)病和治療發(fā)揮的作用，并對(duì)開發(fā)新的癌癥治療策略具有重大意義。Geier等［93］以單個(gè)深海貽貝上皮宿主細(xì)胞與共生細(xì)菌（如甲烷氧化菌和硫氧化菌等）為研究對(duì)象，利用空間分辨代謝組學(xué)技術(shù)一共獲得了約2500個(gè)代謝物信息，并通過聚類分析將其劃分為7個(gè)簇，其中4個(gè)簇與宿主相關(guān)，3個(gè)簇與共生菌相關(guān)。同時(shí)，繪制了它們的空間代謝組圖像，揭示了宿主細(xì)胞對(duì)共生體的代謝適應(yīng)和細(xì)菌的代謝表型變化，并從宿主-微生物界面發(fā)現(xiàn)了新的代謝物。隨著MSI空間分辨率的不斷提高，使得空間分辨代謝組學(xué)有望實(shí)現(xiàn)單細(xì)菌分辨的分析。

3 空間分辨代謝組學(xué)技術(shù)的現(xiàn)有瓶頸

3.1 空間分辨率與檢測(cè)靈敏度

要實(shí)現(xiàn)植物組織甚至單細(xì)胞的高分辨質(zhì)譜成像分析，最重要的就是提高M(jìn)SI的空間分辨率，即要求采樣的激光光斑或離子束直徑盡可能地?。▓D2）。但僅提高空間分辨率是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的，因?yàn)椴蓸用娣e的縮小會(huì)帶來另一個(gè)制約問題，即質(zhì)譜儀器的檢測(cè)靈敏度和可采樣的分子數(shù)。事實(shí)上，隨著MSI中每個(gè)像素點(diǎn)的采樣量降低，由此獲得的分子離子數(shù)目會(huì)大幅降低。因此，相比于空間分辨率的提高，如何在有限的采樣量前提下進(jìn)一步提高質(zhì)譜儀器的檢測(cè)靈敏度更為重要。表2所示為常用質(zhì)譜成像技術(shù)的空間分辨率、樣品制備要求、最佳檢出限和適用分子種類等信息。由于傳統(tǒng)的激光光束和一次離子束等離子源電離效率較低（一般為10-5-10-3）［85］，因此尋求可提高分子電離效率的手段就顯得尤為重要。多種后電離技術(shù)的發(fā)展也為高空間分辨質(zhì)譜成像分析提供了可能。通過將激光解吸采樣過程和電離過程在時(shí)間和空間維度上分開，選擇不同波長、能量、脈寬的激光作為后電離源，可大幅提高質(zhì)譜方法的檢測(cè)靈敏度。Soltwisch等［94］將波長可調(diào)諧的激光束引入到商品化MALDI儀器作為后電離源（MALDI-2），顯著提高了電離效率、拓寬了可分析的分子種類。針對(duì)動(dòng)物和植物組織中脂質(zhì)分子、維他命、多糖等電離效率提高了1-2個(gè)數(shù)量級(jí)，空間分辨率可達(dá)5 μm。隨后，Spivey等［95］和Niehaus等［96］將透射式質(zhì)譜成像技術(shù)和激光后電離源整合一起，實(shí)現(xiàn)了小鼠腦部、腎臟切片以及Vero B4細(xì)胞中多種磷脂和糖脂的亞微米級(jí)質(zhì)譜成像分析。最近，Yin等［97-98］采用第二束激光作為后電離源可以顯著提高待測(cè)物的電離效率，首次實(shí)現(xiàn)了亞納米級(jí)平均濺射率，對(duì)15種鑭系元素混合殘?jiān)色@得～ng/mL的相對(duì)檢出限和fg量級(jí)的絕對(duì)檢出限。高空間分辨率和高檢測(cè)靈敏度是質(zhì)譜成像技術(shù)永恒的追求，盡管目前已有多種基于納米粒子輔助［99-101］、激光電離［88，90，94］、電噴霧電離［4，102］等報(bào)道出來并取得了很大的進(jìn)展，但仍需開發(fā)更多提高檢測(cè)靈敏度的方法，才能滿足高空間分辨成像的需求，并將MSI技術(shù)推向單細(xì)胞分析領(lǐng)域。

表2 常用質(zhì)譜成像技術(shù)的空間分辨率、樣品制備要求、最佳檢出限、適用分子種類等信息匯總

3.2 空間分辨率、質(zhì)量分辨率和分析時(shí)間

在MSI分析中，僅僅依靠高空間分辨率是不足以實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)分析的?？紤]到MSI技術(shù)常用于分析復(fù)雜的生物組織樣品，缺少足夠高的質(zhì)量分辨本領(lǐng)勢(shì)必會(huì)導(dǎo)致相鄰m/z譜峰交疊，從而造成分子鑒定困難和假陽性結(jié)果。因此，高質(zhì)量分辨率和高質(zhì)量精度是實(shí)現(xiàn)化合物鑒定的必要條件，由此提供可靠和高置信度的質(zhì)譜數(shù)據(jù)。同時(shí)，高空間分辨率即要求一張MSI圖中具有更多的像素點(diǎn)（例如空間分辨率提高10倍，總像素點(diǎn)相應(yīng)會(huì)提高100倍），此時(shí)分析時(shí)間會(huì)大大增加。因此，在MSI分析中必須兼顧空間分辨率、質(zhì)量分辨率和分析時(shí)間三者之間的關(guān)系。由于飛行時(shí)間（Time-of-flight，TOF）質(zhì)量分析器具有高靈敏度、高分析速度、多分子同時(shí)檢測(cè)、理論上無質(zhì)量檢測(cè)上限等優(yōu)勢(shì)，目前大多數(shù)的質(zhì)譜成像儀器都是與TOF質(zhì)量分析器相結(jié)合。同時(shí)，考慮到脈沖激光離子源和TOF本身所具有的脈沖特性完美匹配，使它們二者的結(jié)合體成為了MSI技術(shù)中發(fā)展最為迅猛且應(yīng)用領(lǐng)域最為廣泛的質(zhì)譜儀器。但由于高激光能量常常會(huì)造成較高的離子動(dòng)能分散，因此TOF的質(zhì)量分辨率和質(zhì)量精度有限。隨著日益增長的復(fù)雜生物樣品的分析需求，越來越多的課題組也開始將MSI技術(shù)與具有更高質(zhì)量分辨本領(lǐng)和質(zhì)量精度的質(zhì)量分析器結(jié)合，例如傅里葉變換離子回旋共振（Fourier transform ion cyclotron resonance，F(xiàn)TICR）和軌道阱（Orbitrap）等，可提供高于10萬的質(zhì)量分辨率和優(yōu)于1 ppm的質(zhì)量精度。但由于FTICR和Orbitrap都屬于掃描類型的質(zhì)量分析器，因此高質(zhì)量分辨率的獲取常常是以較長的掃描時(shí)間為代價(jià)，這無疑對(duì)高空間分辨MSI技術(shù)的分析通量造成了一定的困擾。為此，近年來有越來越多的研究者開始了新儀器的研制。例如，針對(duì)TOF質(zhì)量分辨率有限的問題，Plaβ等［103］研制了多重反射飛行時(shí)間（Multiple-reflection TOF，MR-TOF）質(zhì)譜，可將質(zhì)譜分辨率提高至10萬以上。盡管如此，不同的質(zhì)量分析器往往具有不同的分析能力和局限性，因此將兩種不同的質(zhì)量分析器合二為一提供多種成像模式也是一種可行的方法。Passarelli等［104］結(jié)合了Orbitrap和TOF的優(yōu)勢(shì)，研制了一臺(tái)OrbitrapSIMS儀器，當(dāng)需要高通量的MSI分析時(shí)可選擇TOF成像模式；當(dāng)需要高質(zhì)量分辨率的MSI分析時(shí)可切換為Orbitrap成像模式，很好地克服了空間分辨率、質(zhì)量分辨率和分析時(shí)間三者的制約關(guān)系。因此，在實(shí)際MSI分析中，需要對(duì)空間分辨率、質(zhì)量分辨率和分析時(shí)間三者進(jìn)行綜合考慮，以期獲得高通量、高質(zhì)量的成像數(shù)據(jù)。

3.3 串級(jí)質(zhì)譜與分子鑒定

相比于以色質(zhì)聯(lián)用為基礎(chǔ)的代謝組學(xué)分析技術(shù)，MSI的另一個(gè)不足之處在于分子的精確鑒定。由于缺少樣品前處理和色譜分離過程，光靠MSI分析有時(shí)候很難對(duì)未知化合物進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定。雖然直接進(jìn)行MSI分析可大大簡(jiǎn)化樣品處理步驟，但由此帶來的嚴(yán)重離子信號(hào)抑制卻不容小覷；另一方面，由于固體直接采樣的電離效率有限且缺少色譜分離富集過程，可檢測(cè)到的代謝物數(shù)量和區(qū)分同分異構(gòu)體的能力都相對(duì)有限。目前，常用的一種互補(bǔ)方法是同時(shí)對(duì)整體組織進(jìn)行提取和基于色質(zhì)聯(lián)用的代謝組學(xué)分析。但值得注意的是，MALDI-MSI僅采樣非常薄的表層樣品，所以代謝組學(xué)分析所獲得的完整組織成分及含量可能與表面成像分析結(jié)果存在一定的差異。此外，植物組織中常常共存多種代謝物同分異構(gòu)體，這也使得精準(zhǔn)化學(xué)鑒定更加困難。雖然部分同分異構(gòu)體可通過色譜進(jìn)行分離，但在分辨率較低和缺少串級(jí)質(zhì)譜功能的MSI儀器中則無能為力。為此，可通過以下3個(gè)方面來顯著提高M(jìn)SI技術(shù)對(duì)未知代謝物的鑒定能力。首先，第一種是通過提高M(jìn)SI中提取質(zhì)量數(shù)的質(zhì)量精度來實(shí)現(xiàn)，這一策略常常要求質(zhì)譜儀器具有較高的質(zhì)量分辨率。例如，C29烷烴和C28醛類化合物間質(zhì)量差僅為0.036 Da，此時(shí)可以結(jié)合高分辨質(zhì)譜和較窄的質(zhì)量窗（如±0.01 Da）來實(shí)現(xiàn)二者的差異成像［71，105］。第二種是采用串級(jí)質(zhì)譜（MS/MS）成像，當(dāng)采用單級(jí)質(zhì)譜用于成像分析時(shí)，僅靠m/z信息常常無法對(duì)代謝物進(jìn)行精確鑒定，而MS/MS可提供補(bǔ)充的碎片信息，從而結(jié)合數(shù)據(jù)庫和文獻(xiàn)報(bào)道數(shù)據(jù)來實(shí)現(xiàn)未知代謝物和同分異構(gòu)體的鑒定［106］。第三種方法是結(jié)合離子淌度譜（Ion mobility spectrometry，IMS）技術(shù)，來提供另一維度的氣相分離過程，在同分異構(gòu)體鑒別中已被廣泛使用［107-108］。例如，Mclean等［109］利用多肽離子和脂質(zhì)離子在IMS氣相分離中的些許差異，實(shí)現(xiàn)了二者的MSI分析。盡管IMS可在氣相分離方面提高M(jìn)SI的分子鑒定能力，但I(xiàn)MS分辨率較低和碰撞截面（Collision cross section，CCS）數(shù)據(jù)庫缺失仍限制了其進(jìn)一步發(fā)展。為此，Giles等［110］研制了環(huán)形IMS儀器，可將IMS的分辨率從～ 50提高到～ 750，大大拓展了該技術(shù)的分辨本領(lǐng)和應(yīng)用領(lǐng)域。此外，由于串級(jí)質(zhì)譜技術(shù)的引入會(huì)產(chǎn)生大量的數(shù)據(jù)集，因此針對(duì)空間信息和分子碎片信息開發(fā)自動(dòng)譜圖解析方法，對(duì)于實(shí)現(xiàn)高通量的MSI分析尤為重要［111］。

3.4 空間分辨率與單細(xì)胞組學(xué)分析

傳統(tǒng)的單細(xì)胞整體分析（Single-cell profiling）已經(jīng)無法滿足科學(xué)家們的好奇心，我們需要深入洞悉代謝物或關(guān)鍵分子在細(xì)胞間，甚至是細(xì)胞器間的差異表達(dá)和空間分布，這也推動(dòng)了對(duì)單細(xì)胞水平的空間分辨代謝組學(xué)方法的開發(fā)。雖然基因組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)發(fā)展迅猛，但單細(xì)胞水平的代謝組學(xué)進(jìn)展則相對(duì)滯后，這主要是因?yàn)樾盘?hào)放大和分子標(biāo)記策略不適合于動(dòng)態(tài)變化的代謝物分子。同時(shí)，單細(xì)胞中代謝過程十分迅速，在采樣分析過程中難以保證其代謝物含量不發(fā)生變化，因此對(duì)單細(xì)胞中代謝物進(jìn)行定量分析仍然存在困難。此外，單細(xì)胞尺寸極?。ú溉閯?dòng)物細(xì)胞直徑約為20 μm，植物細(xì)胞直徑約為100 μm）、體積量極少（約為pL量級(jí)）、代謝物含量極低（fmol-amol）且濃度范圍差異大（pmol/L-mmol/L），也對(duì)單細(xì)胞分析造成了極大的挑戰(zhàn)。盡管目前最新質(zhì)譜儀器的檢出限可達(dá)amol量級(jí)，但考慮到單細(xì)胞內(nèi)復(fù)雜的環(huán)境和含量差異極大的代謝物種類，單細(xì)胞質(zhì)譜分析技術(shù)仍有待進(jìn)一步開發(fā)。首先，應(yīng)提高質(zhì)譜技術(shù)對(duì)單細(xì)胞內(nèi)代謝物的檢測(cè)靈敏度，例如采用富集萃取方法［82，112］、納米材料及納米陣列基底［100］等。Ibá?ez等［113］采用高密度微陣列基底靶對(duì)單個(gè)酵母細(xì)胞中ADP/ATP代謝過程進(jìn)行了高通量監(jiān)測(cè)。Walker等［114］利用納米陣列圖案作為樣品基底靶，對(duì)單個(gè)酵母細(xì)胞中包括富馬酸、吲哚、胞啶在內(nèi)的24個(gè)代謝物進(jìn)行了高靈敏檢測(cè)。其次，要進(jìn)一步提高質(zhì)譜技術(shù)的空間分辨率（達(dá)到亞微米級(jí)），例如采用極紫外激光［115-116］、近場(chǎng)激光離子源［88-90，117］等。Kuznetsov等［115］采用46.9 nm極紫外激光對(duì)單個(gè)分支桿菌中兩個(gè)代謝物碎片進(jìn)行了三維成像，空間分辨率為75 nm，深度分辨率為20 nm。Yin等［88］利用近場(chǎng)激光離子源對(duì)單個(gè)HeLa細(xì)胞中原黃素藥物進(jìn)行了高分辨率成像，揭示了藥物分子只富集在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)未進(jìn)入細(xì)胞核。

3.5 質(zhì)譜成像定量分析

基于色質(zhì)聯(lián)用的代謝組學(xué)方法常用于動(dòng)/植物組織中代謝物的定量分析，然而MSI技術(shù)更適合于代謝物的定性分析。雖然MSI在數(shù)據(jù)處理、代謝物信息提取以及精準(zhǔn)分子鑒定方面都取得了長足的發(fā)展，但由于組織異質(zhì)性、基質(zhì)沉積均勻性、樣品形貌起伏、基體效應(yīng)、離子抑制效應(yīng)以及不均一的離子化效率，都使得MSI的定量能力仍面臨較大的挑戰(zhàn)［118］。在發(fā)展定量MSI技術(shù)之前，傳統(tǒng)的MSI定量分析常常是將感興趣的目標(biāo)區(qū)域從動(dòng)/植物組織上切割出來，隨后消融進(jìn)行色質(zhì)聯(lián)用定量檢測(cè)［119］。一旦得知目標(biāo)化合物的絕對(duì)量后，再根據(jù)該區(qū)域的MSI信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)行數(shù)據(jù)換算。雖然該方法被廣泛使用，但分析步驟較為繁瑣。目前，定量MSI方法主要可分為相對(duì)定量和絕對(duì)定量，前者是通過直接比較不同組織切片上目標(biāo)分子的信號(hào)強(qiáng)度，但這類方法常常由于組織樣品中存在其他的干擾分子、較強(qiáng)的基體效應(yīng)和離子抑制效應(yīng)，導(dǎo)致在定量精度上存在較大的偏差。對(duì)此最常用的方法是對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理，可降低由于基質(zhì)沉積不均勻或者離子抑制效應(yīng)導(dǎo)致的像素點(diǎn)間信號(hào)強(qiáng)度差異，這一策略目前已被用于核苷酸、脂質(zhì)、酶切肽段及其他小分子等分析［120］。多種MSI數(shù)據(jù)處理軟件都可提供歸一化計(jì)算功能，例如SciLS軟件可以在數(shù)據(jù)分析前先對(duì)各個(gè)感興趣離子和總離子流進(jìn)行歸一化，從而更加真實(shí)地反映代謝物在不同組織上的含量信息。值得一提的是，不同組織部位間基體效應(yīng)不同所導(dǎo)致的信號(hào)強(qiáng)度差異，可能會(huì)影響不同組織間測(cè)得的含量差異［118］。

相比于相對(duì)定量，準(zhǔn)確測(cè)得MSI中某一特定分子的真實(shí)含量則困難得多，特別是考慮到不同種類分子常常具有不同的電離效率。與傳統(tǒng)代謝組學(xué)定量分析類似，通過引入與待測(cè)分子理化性質(zhì)相近的內(nèi)標(biāo)化合物有助于提高定量準(zhǔn)確度［121］。由于具有相似結(jié)構(gòu)的化合物常被認(rèn)為具有較一致的電離效率，因此可根據(jù)目標(biāo)分子的結(jié)構(gòu)選擇合適的內(nèi)標(biāo)物，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)更為準(zhǔn)確的定量分析。Bergman等［122］通過在納噴霧溶液中加入氘代試劑，對(duì)小鼠腦部組織切片中神經(jīng)遞質(zhì)（如乙酰膽堿、氨基丁酸和谷氨酸等）進(jìn)行了DESI-MSI定量分析。理想情況下，MALDIMSI分析也可通過繪制外標(biāo)曲線來進(jìn)行化合物的定量，然而由于缺少了樣品基體及其自身可能存在的異質(zhì)性常會(huì)導(dǎo)致定量失準(zhǔn)。為此，Chumbley等［123］通過在肝臟組織上沉積不同量的氘代內(nèi)標(biāo)物來獲得外標(biāo)曲線，兼顧了組織的基體效應(yīng)和不同部位的異質(zhì)性。Maeno等［124］采用噴墨印刷技術(shù)將穩(wěn)定同位素標(biāo)記的內(nèi)標(biāo)物分子均勻地沉積在角質(zhì)層樣品上，實(shí)現(xiàn)對(duì)天然保濕因子的直接定量分析。盡管如此，考慮到組織樣品間的復(fù)雜性和不均一性，定量MSI分析仍是目前的研究難點(diǎn)。此外，由于MSI技術(shù)大多屬于固體采樣，因此其靈敏度和檢出限往往與傳統(tǒng)代謝組學(xué)分析存在一定差異，因此二者的定量信息匹配仍是空間分辨代謝組學(xué)發(fā)展的重點(diǎn)和難點(diǎn)之一。

4 總結(jié)與展望

目前，質(zhì)譜成像技術(shù)已成為動(dòng)/植物組織甚至單細(xì)胞中代謝物分析的強(qiáng)有力工具，為傳統(tǒng)代謝組學(xué)分析提供了全新的可視化視角和多維的信息深度，也為動(dòng)物組織中外源性藥物和植物組織中內(nèi)源性代謝物的轉(zhuǎn)運(yùn)途徑、代謝通路和積累規(guī)律提供了新技術(shù)和新方法。隨著質(zhì)譜成像技術(shù)空間分辨率和質(zhì)譜儀器檢測(cè)靈敏度的不斷提升，使得空間分辨代謝組學(xué)逐漸朝單細(xì)胞代謝組學(xué)分析方向發(fā)展。單細(xì)胞代謝組學(xué)因其種類豐富多樣、代謝過程快速、含量極低且無法對(duì)其進(jìn)行信號(hào)放大和熒光標(biāo)記，仍然是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。隨著高空間分辨質(zhì)譜成像技術(shù)的不斷發(fā)展和完善，相信該技術(shù)將會(huì)在植物細(xì)胞研究中展現(xiàn)更廣闊的應(yīng)用前景。