壯藥解酒方對(duì)酒精性肝病大鼠肝損傷的保護(hù)作用

符穎欣，黃光臨，林泉志，梁淇棋，覃婕，馬卓飛*

(1.右江民族醫(yī)學(xué)院，廣西 百色 533000；2.那坡縣中醫(yī)醫(yī)院，廣西 百色 533900)

酒精性肝病(Alcoholic liver disease，ALD)是因長期過量飲酒導(dǎo)致的肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)異常和(或)功能障礙性疾病[1]，相關(guān)研究表明造成ALD的主要原因是由于酒精代謝所產(chǎn)生的氧化反應(yīng)和炎癥反應(yīng)促使肝細(xì)胞壞死、脂肪蓄積、肝纖維化、肝硬化等病變[2]。隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，飲酒的人群數(shù)量不斷增多，ALD的發(fā)病率不斷升高，已成為我國繼病毒性肝炎之后的第二大肝病[3]。目前西醫(yī)治療ALD方式單一，僅限于戒酒治療、對(duì)癥治療、營養(yǎng)支持和肝移植等[4]。在壯醫(yī)理論中，機(jī)體毒、虛會(huì)導(dǎo)致各種疾病的發(fā)生，人體正氣虛衰，毒邪侵襲，藏伏咪疊(肝)，蘊(yùn)生諸毒，噓勒(氣血)瘀滯，致“三道兩路”不通而為肝病。治療上應(yīng)以祛邪排毒、補(bǔ)益正氣、疏通道路為主。本實(shí)驗(yàn)通過建立大鼠ALD模型，檢測(cè)大鼠血清中天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、總膽固醇(CHOL)、甘油三酯(TRIG)的含量，以及肝組織中丙二醛(MDA)的含量、谷胱甘肽-過氧化物酶(GSH-Px)及超氧化物歧化酶(SOD)的活性，肝指數(shù)及肝組織形態(tài)學(xué)改變等方面，研究并探討壯藥解酒方對(duì)酒精性肝病大鼠肝損傷保護(hù)作用及其作用機(jī)制，為酒精性肝病的防治及壯藥解酒方開發(fā)和應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SD清潔級(jí)大鼠70只，雌雄各半，體質(zhì)量(200±20)g，由右江民族醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供(許可證號(hào)：SCXK桂2017-0004)。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物及試劑

黨參、柴胡、丹參、白芍、葛花等購自廣西大參林連鎖藥店有限公司，巖黃連由那坡縣中醫(yī)醫(yī)院提供，經(jīng)覃道光副教授(右江民族醫(yī)學(xué)院民族醫(yī)學(xué)門診部)鑒定為正品。美他多辛膠囊(浙江震元制藥有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：H20052458)。56°紅星二鍋頭酒(北京紅星股份有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：20180402)?？捡R斯亮蘭試劑盒(南京建成生物工程研究所，生產(chǎn)批號(hào)：20180615)、超氧化物歧化酶試劑盒(南京建成生物工程研究所，生產(chǎn)批號(hào)：20181116)、谷胱甘肽過-氧化物酶試劑盒(南京建成生物工程研究所，生產(chǎn)批號(hào)：20181122)、丙二醛(MDA)測(cè)試盒(南京建成生物工程研究所，生產(chǎn)批號(hào)：20181121)。

1.3 壯藥解酒方水提取物的制備

將黨參30 g、柴胡10 g、巖黃連10 g、丹參10 g、白芍30 g、葛花20 g清洗后充分浸泡，煎煮2 h，過濾。再加入水煎煮，將2次藥液混合濃縮至濃度 5 g·mL-1，分裝備用，冰箱4 ℃保存。使用前以無菌蒸餾水按所需濃度配制成水溶液，在37 ℃水浴，搖勻。

1.4 主要儀器

日立7600全自動(dòng)生化分析儀(株式會(huì)社日立高新技術(shù)公司)；JM-B1003型電子天平(諸暨市超澤衡器設(shè)備有限公司)；HH-W600型恒溫水箱(金壇市醫(yī)療儀器廠)；TGL-16G型離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；722型可見分光光度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司)。

2 方法

2.1 造模及分組

70只大鼠分開適應(yīng)性飼養(yǎng)5日，從雌雄兩組中隨機(jī)分組(每組14只)：正常組、模型組、美他多辛組(9 mg·kg-1·d-1美他多辛)、壯藥解酒方低劑量組(2.5 g·kg-1·d-1)、壯藥解酒方高劑量組(5 g·kg-1·d-1)。每日予正常組和模型組0.9%生理鹽水灌胃，美他多辛組及壯藥低、高劑量組予相應(yīng)藥物灌胃；2 h后，除正常組予0.9%生理鹽水灌胃外，其余各組按10 mL·kg-1給予56°二鍋頭酒灌胃，共56天。

2.2 標(biāo)本采集

第56天末次給藥后12 h，稱量每只大鼠體質(zhì)量，7%水合氯醛進(jìn)行麻醉，腹主動(dòng)脈取血，制備血清，分離完整肝臟組織備用，處死。

2.3 指標(biāo)檢測(cè)

2.3.1 肝指數(shù) 用4 ℃無菌0.9%生理鹽水將剝離的完整肝臟組織表面血跡沖洗干凈，后用濾紙將水分吸干，稱重，計(jì)算肝指數(shù)(公式：肝指數(shù)%=肝濕重÷末次大鼠體重×100%)。

2.3.2 血清肝功能 所采集的大鼠血液標(biāo)本送至右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，使用日立7600全自動(dòng)生化分析儀測(cè)量血清ALT、AST活性和CHOL、TRIG含量。

2.3.3 肝組織SOD、MDA、GSH-Px的測(cè)定 取部分肝組織，迅速用4 ℃ 0.9%生理鹽水沖洗肝臟表面，分裝至高壓滅菌無酶的EP管，置于-80 ℃保存?zhèn)溆?。將保存?80 ℃的肝組織按1∶9加入4 ℃ 0.9%生理鹽水機(jī)械勻漿，將組織勻漿離心10 min，3 000 r·min-1，取上清液制成10%組織勻漿。按各試劑盒說明書操作，用722型可見分光光度計(jì)檢測(cè)各項(xiàng)指標(biāo)的分光光度值(MDA、SOD、GSH-Px、考馬斯亮蘭測(cè)量肝組織蛋白質(zhì)濃度比色測(cè)定波長分別為532 nm、550 nm、412 nm、595 nm)。

2.3.4 肝組織形態(tài)學(xué)制片 切取中間部肥厚的肝組織，用15%甲醛溶液固定，制作病理切片(方法：梯度酒精脫水→二甲苯透明→恒溫箱透蠟→石蠟中包埋→石蠟塊的固定和整修→切片機(jī)上切片→水上撈片→烘干切片→HE染色→二甲苯透明→膠水貼片→樹膠封片)，使用數(shù)碼顯微鏡觀察并拍攝各肝組織切片在形態(tài)學(xué)上的變化。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 對(duì)大鼠肝指數(shù)和體質(zhì)量的影響

實(shí)驗(yàn)期間，正常組大鼠皮毛順滑，動(dòng)作敏捷，精力充沛，脾性溫順；模型組大鼠皮毛蓬亂，活動(dòng)遲緩，嗜睡，脾性躁狂。從表1可見，模型組大鼠的體質(zhì)量增長值明顯低于正常組大鼠(P<0.05)，美他多辛組和壯藥各劑量組大鼠體質(zhì)量增長值高于模型組大鼠(P<0.05)；模型組大鼠的肝指數(shù)高于正常組大鼠(P<0.05)，美他多辛組和壯藥低、高劑量組大鼠肝指數(shù)低于模型組大鼠(P<0.05)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 壯藥解酒方對(duì)大鼠肝指數(shù)和體質(zhì)量增長值的影響

3.2 對(duì)血清中ALT、AST、CHOL、TRIG水平的影響

從表2可見，模型組大鼠血清中ALT、AST水平明顯高于正常組大鼠(P<0.01)，證明模型組大鼠已造成肝損傷，本次造模成功。模型組大鼠血清中ALT、AST水平高于美他多辛組及壯藥低、高劑量組(P<0.05，P<0.01)，表明各藥物干預(yù)組大鼠肝損傷程度低于模型組。正常組大鼠血清中CHOL、TRIG水平高于模型組(P<0.05)，模型組大鼠肝臟內(nèi)脂質(zhì)代謝能力減弱，模型組大鼠血清中CHOL、TRIG水平均高于美他多辛組及壯藥低、高劑量組(P<0.05，P<0.01)，各藥物的干預(yù)對(duì)酒精性肝病模型大鼠具有降脂作用。其中壯藥低劑量組大鼠的血清中ALT、AST水平低于美他多辛組，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表2 壯藥解酒方對(duì)大鼠血清中ALT、AST、CHOL、TRIG水平的影響

3.3 對(duì)肝組織中MDA、SOD及GSH-Px的影響

從表3可見，模型組大鼠肝組織中MDA水平高于正常組大鼠，SOD及GSH-Px活性低于正常組大鼠(P<0.05)；美他多辛組及壯藥低、高劑量組肝組織中MDA水平低于模型組大鼠，SOD及GSH-Px活性高于模型組大鼠(P<0.05，P<0.01)，其中壯藥低劑量組和模型組大鼠肝組織中SOD活性(P>0.05)，差異不具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表3 壯藥解酒方對(duì)酒精性大鼠肝組織中MDA含量、SOD及GSH-Px活性的影響

3.4 對(duì)大鼠肝組織的影響

3.4.1 大鼠肝組織肉眼觀 正常組大鼠肝臟呈暗紅色，表面光滑有光澤，質(zhì)地軟。模型組肝臟顏色黃褐色，個(gè)別可見黃色結(jié)節(jié)，表面緊致無光澤，質(zhì)地軟。美他多辛組及壯藥低、高劑量組肝臟大體相似，顏色稍粉紅，表面尚有光澤，質(zhì)地軟。

3.4.2 大鼠肝組織形態(tài)學(xué)改變 由圖1可見，正常組肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，輻射狀肝索排列整齊，無變性壞死及中性粒細(xì)胞浸潤。模型組肝小葉結(jié)構(gòu)已破壞，肝索間排列混亂，大量肝細(xì)胞壞死、脂肪樣變性，可見空泡脂滴、氣球樣變，中性粒細(xì)胞浸潤；美他多辛組及壯藥低、高劑量組肝組織形態(tài)大體相似，相較于模型組輻射狀肝索排列破壞減輕，可見空泡脂滴、氣球樣變比例大大降低，中性粒細(xì)胞浸潤明顯減少。

A.正常組；B-C.酒精性肝病模型組；D.美他多辛組；E.壯藥低劑量組；F.壯藥高劑量組

4 討論

酒精性肝損傷的形成基礎(chǔ)是長期大量的攝入酒精，乙醇及其代謝產(chǎn)物在機(jī)體中消耗大量抗氧化因子[4]，當(dāng)機(jī)體內(nèi)氧化物大量積累、肝細(xì)胞無法及時(shí)清除時(shí)，則會(huì)導(dǎo)致肝細(xì)胞膜發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)[5]，引起肝細(xì)胞炎癥，出現(xiàn)腫脹、脂肪變性、炎細(xì)胞浸潤，甚至出現(xiàn)肝細(xì)胞的壞死[6]。變性壞死的肝細(xì)胞會(huì)使細(xì)胞膜的通透性增加，使血清中ALT、AST含量升高，故通過檢測(cè)血清中ALT和AST含量可作為肝損傷診斷依據(jù)[3]。大量乙醇在機(jī)體中脫氫氧化為乙醛和乙酸鹽，使三羧酸循環(huán)障礙和脂肪酸氧化減弱，從而影響機(jī)體脂肪代謝[7]，進(jìn)一步導(dǎo)致血清中CHOL、TRIG升高。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，壯藥解酒方能降低ALD大鼠血清中ALT、AST水平，對(duì)肝臟損傷具有一定的保護(hù)作用；血清中CHOL、TRIG水平下降，表明壯藥解酒方能調(diào)節(jié)機(jī)體脂肪代謝，防止甘油三酯在肝細(xì)胞中大量堆積。

氧化應(yīng)激是酒精性肝病發(fā)生的重要機(jī)制之一，MDA作為脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的主要終產(chǎn)物，MDA的含量能直接反映機(jī)體脂質(zhì)過氧化損傷的程度[8]；而SOD為體內(nèi)超氧化物陰離子清除劑，GSH-Px可以清除脂質(zhì)過氧化物，對(duì)肝損傷具有保護(hù)作用，SOD活性和GSH-Px含量的高低可以反映機(jī)體抗氧化能力的強(qiáng)弱[9]。本實(shí)驗(yàn)中，壯藥解酒方能顯著降低肝臟中MDA含量，升高ALD大鼠肝組織中GSH-Px、SOD水平，對(duì)酒精性肝病肝細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用；其機(jī)制可能是與增強(qiáng)體內(nèi)抗脂質(zhì)過氧化和清除氧自由基的能力相關(guān)。

壯醫(yī)認(rèn)為肝病的發(fā)生是由于人體正氣不足，毒邪侵襲，藏伏咪疊(肝)，蘊(yùn)生諸毒，噓勒瘀滯，致“三道兩路”不通。壯藥解酒方是那坡縣中醫(yī)醫(yī)院肝病科在民間驗(yàn)方的基礎(chǔ)上經(jīng)多年臨床實(shí)踐研發(fā)而成，方中主要成分巖黃連為廣西壯族地區(qū)常用壯藥，性味苦寒，具有疏通調(diào)節(jié)兩路、調(diào)和谷道、清瘀毒的作用；葛花善解酒毒；柴胡、白芍疏肝解郁；丹參活血化瘀。全方合用具有祛邪排毒、補(bǔ)益正氣、疏通道路之功效，故而對(duì)于酒精性肝病有一定的治療作用。

綜上所述，壯藥解酒方在一定程度上能保護(hù)ALD大鼠肝細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)及功能、減輕乙醇所致的肝損傷，其作用機(jī)制可能與維持機(jī)體抗氧化平衡有關(guān)。本研究為壯藥解酒方的進(jìn)一步研究、開發(fā)和應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。