鐘光華 鄭守鏈 唐娉

膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最為常見(jiàn)的惡性腦腫瘤，患者預(yù)后極差。多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（glioblastoma multiforme，GBM）是膠質(zhì)瘤中最?lèi)盒缘牟±眍?lèi)型[1-3]。患者在接受最大安全的手術(shù)切除、大劑量放射治療和標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)治療后，總體中位總生存率仍然較短[4]。導(dǎo)致GBM 患者治療效果不理想的一個(gè)重要因素是，腫瘤內(nèi)部細(xì)胞異質(zhì)性以及膠質(zhì)瘤腫瘤干細(xì)胞的存在，導(dǎo)致了腫瘤細(xì)胞內(nèi)部存在耐受現(xiàn)有的免疫治療和分子靶向治療[5-7]。因此，發(fā)現(xiàn)新的生物標(biāo)志物有助于腫瘤精準(zhǔn)治療的發(fā)展。驅(qū)動(dòng)蛋白家族成員15（Kinesin Family Member 15，KIF15）是一種蛋白質(zhì)編碼基因，編碼的蛋白與21q22.11q22.12 微缺失綜合征和乳腺癌的發(fā)病有關(guān)[8-9]。目前，國(guó)內(nèi)關(guān)于KIF15 在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)特征及臨床意義的研究報(bào)道罕見(jiàn)。本研究通過(guò)挖掘美國(guó)癌癥基因圖譜計(jì)劃（The Cancer Genome Atlas，TCGA）和中國(guó)腦膠質(zhì)瘤基因圖譜計(jì)劃（Chinese Glioma Genome Atlas，CGGA）膠質(zhì)瘤患者的腫瘤樣本的全轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，結(jié)合相關(guān)基因和蛋白表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)，初步探討了KIF15 在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)特征及臨床意義，現(xiàn)報(bào)道如下。

資料與方法

一、數(shù)據(jù)庫(kù)

人類(lèi)基因蛋白表達(dá)庫(kù)數(shù)據(jù)（https://www.proteinatlas.org/）用于分析KIF15 在人體器官組織中的表達(dá)特征。TCGA 和CGGA 基因全轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)（mRNAseq） 用于分析KIF15 在各級(jí)別膠質(zhì)瘤中的表達(dá)差異。

二、膠質(zhì)瘤芯片及免疫組織化學(xué)染色

包含94 例膠質(zhì)瘤樣本（含WHO 標(biāo)準(zhǔn)下Ⅱ～Ⅳ級(jí)，其中Ⅱ級(jí)24 例，Ⅲ級(jí)31 例，Ⅳ級(jí)39）的腫瘤組織芯片（武漢谷歌生物科技有限公司）用于KIF15的免疫組織化學(xué)染色。染色方法：組織芯片經(jīng)二甲苯脫蠟、乙醇脫水后，用檸檬酸鈉緩沖液進(jìn)行抗原修復(fù)，3%H2O2溶液去除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性。KIF15抗體（1∶400，ab251836，Abcam 公司，美國(guó)）用于一抗孵育（4℃冰箱中孵育16 h）。Polink-2 plus 聚合物HRP 檢測(cè)系統(tǒng) （北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）檢測(cè)抗體。KIF15 的染色強(qiáng)度評(píng)分采用Image-Pro Plus 軟件進(jìn)行評(píng)估。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為：未見(jiàn)染色為0 分，陽(yáng)性細(xì)胞＜10%為1 分，陽(yáng)性細(xì)胞在10%～70%為2分，陽(yáng)性細(xì)胞＞70%為3 分。

三、轉(zhuǎn)錄組的生信分析

將TCGA 的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)樣本根據(jù)KIF15 的mRNA 水平進(jìn)行分組，KIF15 的mRNA 水平排序在四分位數(shù)P75 及以上的作為KIF15 高水平組，KIF15的mRNA 水平排序在四分位數(shù)P25 及以下的作為KIF15 低水平組，比較2 組間所有基因轉(zhuǎn)錄水平和中位生存期差異，按照差異倍數(shù)在2 或以上，且P＜0.05作為篩選條件，篩選出所有的差異基因（differential expressed genes，DEGs），并以熱圖的形式進(jìn)行表示。所有DEGs 進(jìn)行基因本體（gene ontology，GO）分析和信號(hào)通路富集（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）分析。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS20.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，轉(zhuǎn)錄組mRNAseq 數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示，組間分析采用計(jì)量資料的t 檢驗(yàn)，免疫組化染色強(qiáng)度評(píng)分轉(zhuǎn)化為秩次，比較采用等級(jí)資料的Mann-Whitney U 檢驗(yàn)，生存分析采用Kaplan-Meier 生存分析法。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

一、KIF15 的正常人體組織及神經(jīng)系統(tǒng)中的表達(dá)特征

在中樞神經(jīng)系統(tǒng)大腦中，各部位組織可檢測(cè)到KIF15 的蛋白水平和轉(zhuǎn)錄水平均較低。在正常人各組織器官中，KIF15 的蛋白水平均在中等水平或以下，近半數(shù)組織器官中幾乎不能檢測(cè)到KIF15 的蛋白表達(dá)。其中，KIF15 在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中為低表達(dá)。同時(shí)，KIF15 的轉(zhuǎn)錄水平（mRNA）除在胸腺、睪丸、骨密質(zhì)中較高外，而在包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)在內(nèi)的絕大多數(shù)各組織器官中極為低下（圖1）。

二、膠質(zhì)瘤患者腫瘤組織KIF15 轉(zhuǎn)錄水平的特征

TCGA 和CGGA 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析顯示，膠質(zhì)瘤WHO 級(jí)別越高，KIF15 的mRNA 水平顯著增高，WHO Ⅱ級(jí)和Ⅲ級(jí)分別與WHO Ⅳ級(jí)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖2A～B）。并且，在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中KIF15 的mRNA 水平最高，相比較于星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤、少突星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤、間變性星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤、間變性少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖2C～D）。在中位生存期上，KIF15 高水平組患者的中位生存期較KIF15 低水平組更短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖2E～F）。膠質(zhì)瘤組織芯片染色結(jié)果顯示，WHO 級(jí)別越高，膠質(zhì)瘤組織染色強(qiáng)度評(píng)分趨向更高，WHO Ⅳ級(jí)膠質(zhì)瘤評(píng)分以2 分（20.51%）、3 分（74.36%）為主，而WHO Ⅱ級(jí)以0 分（29.17%）、1 分（50.00%）為主（圖2G～H）。

三、KIF15 轉(zhuǎn)錄水平與相關(guān)腫瘤增殖指標(biāo)Ki67的相關(guān)性

在TCGA 轉(zhuǎn) 錄 組 數(shù) 據(jù) 中，KIF15 和Ki67 的mRNA 水平之間為顯著性正相關(guān)關(guān)系 （r=0.725，P＜0.001，圖3A）；在CGGA 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中，KIF15 和Ki67 的mRNA 水平之間也呈顯著性正相關(guān)關(guān)系（r=0.706，P＜0.001，圖3B）。

四、KIF15 參與調(diào)控的分子信號(hào)通路

共篩選到707 個(gè)DEGs，KIF15 高水平組相比較于KIF15 低水平組，表達(dá)水平升高的DEGs 有328個(gè)，表達(dá)水平降低的DEGs 有379 個(gè)（圖4A）。GO 分析顯示，這些DEGs 參與的生物學(xué)過(guò)程前10 位包含細(xì)胞周期轉(zhuǎn)換和細(xì)胞有絲分裂調(diào)控（圖4B）。分子信號(hào)通路富集，KEGG 分析顯示，DEGs 參與的分子信號(hào)通路包括細(xì)胞周期、P53 通路和DNA 復(fù)制（圖4C）。

討論

GBM 是腦腫瘤中最為常見(jiàn)且惡性程度最高的腫瘤。膠質(zhì)瘤內(nèi)部細(xì)胞的異質(zhì)性以及存在一類(lèi)“腫瘤干細(xì)胞”，可引起術(shù)后化學(xué)治療藥物的耐受及脫靶效應(yīng)，以至于常規(guī)治療效果不盡如人意，患者中位生存期較短[1-3]。GBM 的致病基因突變極為復(fù)雜，對(duì)致病基因的識(shí)別是腫瘤精準(zhǔn)治療的前提，目前越來(lái)越多的特異性腫瘤靶點(diǎn)被發(fā)現(xiàn)，為疾病的個(gè)性化治療提供了科學(xué)線(xiàn)索和依據(jù)。

圖1 KIF15 的正常人體組織及神經(jīng)系統(tǒng)中的表達(dá)特征

圖2 KIF15 在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及臨床意義

圖3 KIF15 轉(zhuǎn)錄水平與相關(guān)腫瘤增殖指標(biāo)Ki67 的相關(guān)性

圖4 KIF15 參與調(diào)控的分子信號(hào)通路

驅(qū)動(dòng)蛋白家族（kinesin family members，KIFs）是包含40 多個(gè)蛋白成員的超家族，參與了細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)和細(xì)胞器的運(yùn)輸、細(xì)胞有絲分裂等重要過(guò)程[10]。在KIFs 家族中，KIF15 是一種基于微管的、正端導(dǎo)向的運(yùn)動(dòng)蛋白，參與多種細(xì)胞過(guò)程，如紡錘體裝配、質(zhì)膜運(yùn)輸和細(xì)胞分裂[11-13]。據(jù)報(bào)道，KIF15 和KIF11 可促進(jìn)雙極紡錘體的形成[14]。近年來(lái)研究報(bào)道，KIF15 也被證實(shí)參與多種腫瘤的生長(zhǎng)，如胰腺癌、肺癌、乳腺癌等[15-18]。但KIF15 在膠質(zhì)瘤腫瘤中的表達(dá)及與預(yù)后的關(guān)系尚不清楚，國(guó)內(nèi)KIF15 在膠質(zhì)瘤中的相關(guān)報(bào)道少見(jiàn)。本研究基于目前全國(guó)兩大膠質(zhì)瘤基因譜——TCGA 和CGGA，挖掘了KIF15 在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)特征及臨床意義，并初步探討了KIF15 在分子機(jī)制上的功能。首先，通過(guò)人類(lèi)基因和蛋白表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)探究了KIF15 在健康人神經(jīng)系統(tǒng)中的表達(dá)特征，結(jié)果顯示，KIF15 在人類(lèi)絕大部分組織器官中是較低表達(dá)的，尤其是在腦組織中蛋白水平和轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)量均極低。然而，TCGA 和CGGA 膠質(zhì)瘤患者樣本轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)提示，無(wú)論是在WHO 不同級(jí)別分組比較，抑或是根據(jù)腫瘤病理學(xué)分組比較，均顯示KIF15 在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中異常高表達(dá)；并且，KIF15 高表達(dá)患者的中位生存期顯著縮短。由此可見(jiàn)，KIF15 異常高表達(dá)與膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的發(fā)生及臨床預(yù)后有較大的臨床聯(lián)系，KIF15 很可能是膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的一個(gè)特征性蛋白標(biāo)記物。而且，KIF15 的轉(zhuǎn)錄水平與腫瘤惡性指標(biāo)Ki67 存在顯著正相關(guān)，說(shuō)明高水平表達(dá)KIF15 的膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖能力也相應(yīng)更強(qiáng)，腫瘤惡性程度更高，因此患者的中位生存期越差。最后，本研究對(duì)KIF15 高表達(dá)組和低表達(dá)組間篩選出的DEGs 進(jìn)行GO 分析和信號(hào)通路KEGG 分析，結(jié)果顯示，DEGs 顯著富集在了細(xì)胞增殖相關(guān)的生物學(xué)過(guò)程以及分子信號(hào)通路中，如細(xì)胞周期、P53等經(jīng)典腫瘤信號(hào)通路。研究已經(jīng)證實(shí)，P53 是重要的抑癌基因，其在通過(guò)調(diào)控細(xì)胞周期檢查點(diǎn)上發(fā)揮重要的作用，通過(guò)對(duì)細(xì)胞周期的調(diào)控影響了腫瘤細(xì)胞的惡行增殖速度[19]。這就提示，KIF15 明顯參與調(diào)控了細(xì)胞分裂信號(hào)通路。由此，筆者初步得出了KIF15是膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的一個(gè)特征性標(biāo)志物，具有重要的臨床研究?jī)r(jià)值。

綜上所述，KIF15 在膠質(zhì)瘤中高表達(dá)，并且高水平KIF15 預(yù)示膠質(zhì)瘤惡性程度高，患者生存期較差。KIF15 參與調(diào)控了腫瘤細(xì)胞周期通路，可能是一個(gè)潛在的膠質(zhì)瘤基因治療靶點(diǎn)。對(duì)于該基因的后續(xù)研究，應(yīng)結(jié)合其DEGs 的GO 分析和KEGG 分析結(jié)果，著重對(duì)P53 信號(hào)通路和細(xì)胞周期分析信號(hào)軸進(jìn)行研究。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突