郭 銘，孫莉莎，司二靜，姚立蓉，汪軍成，李葆春，楊 軻，孟亞雄，馬小樂，王化俊

(1. 甘肅省干旱生境作物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/甘肅省作物遺傳改良與種質(zhì)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730070；2. 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，蘭州 730070；3. 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，蘭州 730070)

大麥(HordeumvulgareL.)是種植最早的農(nóng)作物之一，大約有5000多年的種植歷史，與小麥相比，大麥有較強(qiáng)的適應(yīng)能力和耐逆性[1]。大麥主要應(yīng)用于飼料、食糧、釀酒等方面，種植面積僅次于小麥、水稻和玉米而位居第四[2]。大麥病害的普遍發(fā)生一方面阻礙了其產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，另一方面使其產(chǎn)量和品質(zhì)均嚴(yán)重下降[3]。大麥條紋病(Barleystripe)是大麥的主要病害之一，該病原菌有性態(tài)病菌為麥類核腔菌(PyrenophoragramineaIto et Kuribayashi)，無性態(tài)病菌為禾內(nèi)臍蠕孢[Drechsleragraminea(Rabenh)Shoemaker][4]。大麥條紋病主要危害植物的葉片、葉鞘和莖稈部位，主要通過種子帶菌傳播[5]，在北歐和地中海地區(qū)發(fā)生比較嚴(yán)重，在中國主要發(fā)生在江蘇、上海、浙江、四川以及甘肅河西走廊等地[6]。近年來，通過種子包衣、藥劑防治、改善農(nóng)田環(huán)境和土壤結(jié)構(gòu)等均能有效地防治大麥條紋病，但種子包衣技術(shù)在甘肅、青海和西藏等大麥種植區(qū)域還未能有效地應(yīng)用[7]。

活性氧(Reactive oxygen species，ROS)一直被認(rèn)為是有氧代謝的有毒副產(chǎn)物，植物在受到病菌侵染后，ROS量急劇增加，進(jìn)而影響脂質(zhì)、蛋白質(zhì)以及核酸的功能[8]。另外，一些防御酶如超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)、過氧化物酶(Peroxidase，POD)、過氧化氫酶(Catalase，CAT)、苯丙氨酸解氨酶(Phenylalanine ammonialyase，PAL)以及其他酶類活性均有明顯的變化，但是植物本身可以通過增強(qiáng)酶的活性來提高其抵抗逆境的能力，并維持其存活[9-11]。陳捷等[12]發(fā)現(xiàn)接種玉米彎孢病病菌毒素后，抗病品種的PAL和POD活性增加快于感病品種。王桂清等[13]研究發(fā)現(xiàn)灰斑病病菌侵染玉米20d后，抗、感品種的CAT活性均降低，POD活性均升高，并且感病品種的酶活性高于抗病品種。丙二醛(Malondialdehyde，MDA)與游離的脯氨酸(Proline)可作為重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，在植物遭受脅迫時(shí)通過在細(xì)胞內(nèi)積累這些物質(zhì)，來維持細(xì)胞膜兩側(cè)的滲透勢平衡，從而達(dá)到抵抗逆境脅迫的目的[14]。林仁輝[15]研究表明，鎂顯著影響小白菜生物量的積累，鎂離子缺乏使小白菜葉綠素含量下降并產(chǎn)生大量活性氧引起MDA的積累，適量施用鎂肥可以顯著提高光合作用及SOD、POD的活性。目前，有關(guān)病菌侵染植物后其防御酶活性的變化也有相關(guān)報(bào)道[16-20]，但是，對于條紋病病菌與大麥的互作機(jī)制缺乏系統(tǒng)研究，對大麥條紋病發(fā)生后對大麥防御酶的影響鮮見報(bào)道，因此，本研究以對條紋病病菌表現(xiàn)高感的大麥品種Alexis為研究材料，研究條紋病病菌侵染后對大麥防御酶的變化，以期為大麥的抗條紋病機(jī)理和抗病育種提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

大麥品種Alexis和大麥條紋病病菌菌株QWC[21]均由甘肅省作物遺傳改良與種質(zhì)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/甘肅省干旱生境作物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室麥類種質(zhì)創(chuàng)新課題組提供。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)主要采用“三明治法”進(jìn)行人工接種[22]。將高感品種Alexis的20粒種子經(jīng)φ=70%的酒精處理30 s后，再用φ=5%的次氯酸鈉溶液處理5 min，用無菌水清洗4～5次后晾干2.5～3 h，將種子擺放在長滿菌絲的PDA培養(yǎng)基上，用另一長滿菌絲的PDA培養(yǎng)基的皿覆蓋在種子上，置于6 ℃冰箱中保存至種子萌發(fā)(約20 d)，密封后，放置在22 ℃，無光照的條件下繼續(xù)培養(yǎng)7～14 d。試驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)。

將土、沙、蛭石按體積比3∶1∶1混合均勻，作為大麥生長培養(yǎng)基質(zhì)，經(jīng)高壓蒸汽滅菌 (121 ℃，30 min)后備用。將萌發(fā)的種子移栽至直徑為9 cm的花盆中，待其生長至三葉期時(shí)，分別采集第3天、第6天、第9天和第12天的大麥葉片，進(jìn)行相應(yīng)生理指標(biāo)的測定。

1.3 生理指標(biāo)的測定

1.3.1 超氧化物歧化酶活性 參照裴斌[23]的方法進(jìn)行測定。反應(yīng)體系為 3 mL，依次加入0.05 moL·L-1的磷酸緩沖液(pH=7.8)1.5 mL、 0.13 moL·L-1的甲硫氨酸(Met)溶液0.3 mL、 0.75 mmoL·L-1的氮藍(lán)四唑(NBT)溶液0.3 mL、0.1 mmoL·L-1的乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-2Na)溶液0.3 mL、0.02 mmoL·L-1的核黃素0.3 mL、0.05 mL的酶液、0.25 mL 的蒸餾水，混合后將一支對照管置暗處，其余各管于4 000 lx日光下反應(yīng)20 min，測定OD560，每個(gè)測定液重復(fù)3次，以抑制50%的酶活性為1個(gè)酶活單位(U)，結(jié)果表示為 U·g-1。

1.3.2 過氧化物酶活性 參照李合生[24]的方法進(jìn)行測定。反應(yīng)體系為 3 mL，向比色杯中加入0.10 mL的待測液(酶液)、φ=0.3%愈創(chuàng)木酚溶液2.6 mL，將比色杯放入比色槽，加φ=0.6% H2O2溶液，立即計(jì)時(shí)，啟動(dòng)反應(yīng)，計(jì)時(shí)2 min后，測定OD470，每30 s測定1次，共測量4次，以O(shè)D470增加1為1個(gè)酶活單位(U)，結(jié)果表示為 U·g-1。

1.3.3 過氧化氫酶活性 參照陳利鋒等[25]的方法進(jìn)行測定。反應(yīng)體系為 3 mL，配制H2O2溶液，用蒸餾水調(diào)零，向比色杯中加入0.2 mL的待測液(酶液)，將比色杯放入比色槽，加 0.067 moL·L-1H2O2溶液2.8 mL，立即計(jì)時(shí)，啟動(dòng)反應(yīng)，計(jì)時(shí)2 min后，測定OD240，每1 min測定1次，共測量2次，以每分鐘的OD240下降1為1個(gè)酶活單位(U)，結(jié)果表示為 U·g-1。

1.3.4 游離脯氨酸含量 參照王三根[26]的方法進(jìn)行測定。吸取2 mL提取液移入帶塞的玻璃試管中，加入2 mL冰醋酸及2 mL φ=2.5%酸性茚三酮溶液，在沸水浴中加熱10 min，冷卻后加入4 mL甲苯，搖蕩30 s，靜置片刻，取上層液至10 mL離心管中，在3 000 r·min-1離心5 min，吸取上層脯氨酸紅色甲苯溶液于比色杯中，測定OD520，含量單位為μg·g-1。

1.3.5 丙二醛含量 參照高俊鳳[27]的方法進(jìn)行測定。取大麥葉片0.5 g，加入φ=10%三氯乙酸溶液(含1% PVP，pH 7.0)4 mL充分研磨，于 4 ℃以3 000 r·min-1離心10 min。取上清液 2 mL加入等體積φ=0.6%硫代巴比妥溶液，沸水水浴15 min，冷卻后以3 000 r·min-1離心10 min，利用紫外分光光度計(jì)(U-5100UV/VIS)超微量光度計(jì)測定各處理在OD532、OD600和OD450，計(jì)算丙二醛(MDA)含量。

1.3.6 葉綠素相對含量 利用葉綠素儀(SPAD-502PLUS，KONICA MINOLTA)測定葉片葉綠素相對含量[28]。分別選擇生長一致的大麥5株，對每一株大麥葉片取相同部位進(jìn)行葉綠素相對含量的測定，最后取均值，得出總體葉綠素相對含量(SPAD)。

1.4 發(fā)病統(tǒng)計(jì)和數(shù)據(jù)分析

幼苗成長至三葉期后，分別在第3天、第6天、第9天、第12天對大麥品種Alexis進(jìn)行病情調(diào)查，調(diào)查20 株，每株按0、1、2、3、4、5等級(jí)進(jìn)行分級(jí)統(tǒng)計(jì)[29]，并計(jì)算病情指數(shù)。

調(diào)查分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)為：0級(jí)，不發(fā)??；1級(jí)，植株上有零星病斑；2級(jí)，整株的發(fā)病率為小于15.00%；3級(jí)，整株的發(fā)病率為15.00%～30.00%；4級(jí)，整株的發(fā)病率為30.00%～50.00%；5級(jí)，整株的發(fā)病率為50.00%以上。

病情指數(shù)(Disease index,DI)計(jì)算公式為：

DI=∑(發(fā)病級(jí)別×各級(jí)病葉數(shù))/(調(diào)查總?cè)~數(shù)×最高病級(jí)值)×100

2 結(jié)果與分析

2.1 感病品種Alexis的發(fā)病情況

經(jīng)過對不同時(shí)間大麥條紋病發(fā)生情況的調(diào)查結(jié)果表明(表1)，感病品種Alexis接菌之后，病株率和病情指數(shù)隨著條紋病病菌株QWC侵染時(shí)間的延長而逐漸增加，且大麥條紋病病情指數(shù)為 5.00～19.72，發(fā)病率為15.00%～70.00%，表明種子帶菌是大麥條紋病的主要初侵染源。在第3天(三葉期)時(shí)病株率和病情指數(shù)最低，分別為 15.00%、5.00；到第12天時(shí)，病株率和病情指數(shù)達(dá)到最大值，分別為70.00%、19.72。

表1 大麥品種Alexis接種大麥條紋病病菌菌株QWC后不同時(shí)間的發(fā)病結(jié)果

圖1可以看出，將浸菌后培養(yǎng)20 d(22 ℃，黑暗)的大麥種子(圖1-A)移栽到盆中，在第3天時(shí)(三葉期)，葉片上剛出現(xiàn)淺黃色斑點(diǎn)或短小的條紋，隨著接菌時(shí)間的延長，從葉片基部到葉尖形成平行于葉脈的細(xì)長條斑，而后轉(zhuǎn)為深褐色條斑，且病斑周圍也會(huì)褪綠變黃(圖1-B)。

2.2 條紋病病菌侵染對大麥葉片酶活性的影響

隨著接種后時(shí)間的延長，對照組Alexis品種葉片SOD活性變化不明顯，整體呈上升趨勢，接菌處理后，大麥品種Alexis葉片SOD活性顯著升高，呈先上升后下降的趨勢，分別較各自對照顯著增加7.86%、49.67%、41.17%和11.63%，平均增幅為27.58%。接菌第3天～第6天時(shí)，大麥品種Alexis葉片SOD活性迅速增加，第6天～第9天時(shí)上升緩慢，在第9天時(shí)達(dá)到峰值，且差異顯著(圖2-A)。雖然對照組Alexis品種葉片POD活性在第9天時(shí)略微下降，但整體變化不明顯，接菌處理后，大麥品種Alexis葉片POD活性較對照的均有所增加，呈先下降后上升的趨勢，平均增幅為39.38%(P<0.05)。接菌第6天時(shí)，POD活性略微下降，而在第9天、第12天時(shí)，POD活性分別較各自對照差異顯著(圖2-B)。對照組Alexis品種葉片CAT活性變化不明顯，接菌處理第3天～第9天時(shí)，CAT活性分別較各自對照有明顯的升高趨勢，平均增幅為32.71%。在第9天時(shí)增幅達(dá)到最高，為77.43%，且與對照組差異顯著，而在第12天時(shí)CAT活性與對照的差異不顯著(圖2-C)。

2.3 大麥條紋病病菌侵染對大麥葉片的脯氨酸和丙二醛含量的影響

隨著接種后時(shí)間的延長，對照組Alexis品種葉片脯氨酸含量呈先上升后下降的趨勢，接菌處理后，大麥品種Alexis葉片脯氨酸含量與對照組差異顯著(P<0.05)，整體呈先上升后下降的趨勢，分別較各自對照增加40.90%、44.22%、 114.88%和82.21%，平均增幅為70.55%。在第3天～第9天時(shí)脯氨酸含量持續(xù)上升，且在第9天時(shí)達(dá)到最大，增幅為 114.88%，隨后逐漸降低(圖3-A)。接菌處理后，大麥品種Alexis葉片MDA含量分別較各自對照下降 17.90%、14.93%、9.24%和2.76%，平均降幅為11.21%。在第3天MDA含量降幅最大，且與對照組差異顯著 (P<0.05)，而第12天MDA含量與對照組無差異顯著，其原因可能是MDA對大麥條紋病病菌起負(fù)調(diào)控的作用(圖3-B)。

2.4 大麥條紋病病菌侵染對大麥葉片葉綠素相對含量的影響

隨著接種后時(shí)間的延長，對照組Alexis品種葉片中葉綠素相對含量無明顯變化，接菌處理后，SPAD值與對照組差異顯著，分別較各自對照下降12.31%、36.82%、52.09%和84.34%(P< 0.05)，平均降幅為46.39%。第3天時(shí)，SPAD值下降不明顯，第6天～第12天下降顯著，至第12天時(shí)SPAD值降至最低，相比對照組低 84.34%(圖4)。

3 討 論

當(dāng)外界病原物侵染植株后，植物體為防御因毒害造成的氧化脅迫，其自身有一套完整的清除酶系統(tǒng)。在植物體受到逆境脅迫時(shí)ROS會(huì)迅速富集，同時(shí)也會(huì)對植物造成毒害，且發(fā)生不同程度的變化。其中SOD、POD和CAT等能夠作為防御酶系統(tǒng)來保護(hù)自身的損傷，且這幾類酶對保護(hù)機(jī)體免受活性氧和氧自由基的傷害起著至關(guān)重要的作用[30]。趙欣等[31]通過解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)菌株HRH317處理玉米植株后再接種串珠鐮孢(Fusariummonilifome)，發(fā)現(xiàn)玉米體內(nèi)與抗逆相關(guān)的酶CAT、POD和SOD活性升高。連玲麗等[32]通過短小芽孢桿菌(B.pumilus)菌株EN16誘導(dǎo)番茄葉片，發(fā)現(xiàn)菌株EN16能增強(qiáng)番茄植株中SOD、POD和CAT等防御酶的活性。向妙蓮等[33]研究表明茉莉酸甲酯(MeJA)能誘導(dǎo)水稻幼苗對白葉枯病的抗性，且誘導(dǎo)抗性的產(chǎn)生與 MeJA 提高水稻相關(guān)防御酶的活性有關(guān)。陳亮等[34]研究表明西瓜枯萎病病菌(F.oxysporumf.sp.niveum)接種處理后，3個(gè)西瓜品種葉片的SOD、POD、PPO、PAL、CAT 活性較未接種對照的均顯著提高。本試驗(yàn)中，大麥感病品種Alexis受到大麥條紋病病菌侵染后，相比對照而言，SOD、POD和CAT活性從第3天開始均呈增加趨勢，整體而言，SOD和POD活性都呈先上升后下降的趨勢。另外，隨著病菌侵染時(shí)間的增加，SOD和POD活性均有一段下降趨勢，可能由于當(dāng)SOD防御系統(tǒng)不能滿足植物體需要時(shí)，POD同時(shí)也進(jìn)行防御，這與徐品三等[35]對百合無癥病毒對其酶活性的影響研究結(jié)果相一致。房保海等[36]在研究煙草接種低頭黑病病菌毒素后也得到相似的結(jié)論。CAT活性呈先上升后下降的趨勢，且在第9天時(shí)達(dá)到最大，表明大麥感病品種Alexis在感病后，起初體內(nèi)CAT的活性增強(qiáng)，這種變化可能無法清除持續(xù)產(chǎn)生的過氧化氫(H2O2)，從而使得H2O2逐漸地累積，引起植株體內(nèi)H2O2代謝失衡，CAT活性不斷下降，這與吳秋楨等[37]對文心蘭接種軟腐病菌后其體內(nèi)防御酶活性的變化相 一致。

植物在受到逆境脅迫時(shí)，首先受害的是細(xì)胞膜系統(tǒng)，該過程主要是過氧化作用的主要產(chǎn)物MDA含量明顯增加，質(zhì)膜透性(Plasma permeability，PMP)增大，導(dǎo)致離子外滲。對于這種非生物脅迫的應(yīng)答機(jī)制，植物體自身通過一系列的代謝反應(yīng)大量地積累一些有機(jī)小分子化合物和多肽類物質(zhì)(如脯氨酸)來降低原生質(zhì)水勢，調(diào)節(jié)細(xì)胞膜兩側(cè)滲透勢的平衡，從而有效地調(diào)節(jié)植物體內(nèi)生理代謝的紊亂[38]。在植物受到逆境脅迫時(shí)，往往會(huì)發(fā)生膜脂過氧化作用，MDA就是其產(chǎn)物之一，其含量的高低可作為逆境脅迫的重要指標(biāo)之一。另外，在植物體內(nèi)，脯氨酸是組成蛋白質(zhì)的成分之一。脯氨酸、可溶性糖這些滲透性物質(zhì)在植物受到非生物脅迫時(shí)能夠發(fā)揮作用以保證細(xì)胞正常的生理功能[39]。王彩霞等[40]研究表明腐爛病病菌侵染對蘋果愈傷組織后，感病品種MDA含量上升速度快，但均低于對照。董麗紅等[41]研究表明枯草芽孢桿菌(B.subtilis)菌株 NCD-2侵染棉花品種‘冀棉11’后，L-脯氨酸可以顯著提高菌株生物膜形成能力。本試驗(yàn)中，大麥感病品種 Alexis受到大麥條紋病病菌侵染后，MDA含量較對照均呈下降趨勢，這可能是大麥條紋病病菌侵染植株后使得細(xì)胞膜體系遭到破壞，從而紊亂植物細(xì)胞的生化平衡，但隨著侵染時(shí)間的增加，MDA含量逐漸增加，是由于活性氧自由基的積累超過過氧化物酶系統(tǒng)的清除能力，從而導(dǎo)致過氧化物酶系統(tǒng)的傷害，繼而導(dǎo)致膜脂過氧化作用的進(jìn)一步加強(qiáng)，MDA含量也隨之增加，病害加重，這與孟璐璐等[42]通過對蘋果接種灰霉病病菌(Botrytiscinerea)后MDA變化的結(jié)果相一致。接菌后，脯氨酸含量較對照都呈上升的趨勢，隨著時(shí)間的延長，整體呈先上升后下降的趨勢，這與周麗等[43]的研究結(jié)果相似。

植物葉綠素含量的高低是評估其光合作用的指標(biāo)之一，當(dāng)植株受到逆境脅迫時(shí)，主要表現(xiàn)為光合作用的降低，使得葉綠素含量降低[44]。本試驗(yàn)中，隨著接菌時(shí)間的增加，大麥感病品種Alexis的葉綠素含量逐漸降低，并且時(shí)間越長，其降幅越大，這主要是在接菌后嚴(yán)重阻礙了大麥葉片的延伸，使得光合器官的生理功能被破壞，這與尹啟琳等[45]通過PEG脅迫處理小麥品種后其體內(nèi)葉綠素相對含量的變化結(jié)果相一致。

綜上所述，大麥感病品種Alexis受到大麥條紋病病菌侵染后，葉片細(xì)胞膜系統(tǒng)受到不同程度的損壞，導(dǎo)致葉片內(nèi)MDA和Pro含量上升。此外，細(xì)胞結(jié)構(gòu)被破壞，光合作用受到抑制，體內(nèi)葉綠素分解酶的活性逐漸升高，使葉綠素轉(zhuǎn)變成葉綠素醇和葉綠素脂，從而使得葉綠素相對含量降低。植株體內(nèi)的抗氧化防御酶也發(fā)生了變化，SOD、POD和CAT活性顯著升高，并且都呈先上升后下降的趨勢。大麥接種大麥條紋病病菌后防御酶活性發(fā)生變化，這些防御酶的基因表達(dá)量的變化是否與酶活性的變化相一致有待于進(jìn)一步研究。此外，在條紋病脅迫下大麥葉片在生理生化指標(biāo)上表現(xiàn)為多方面的綜合防御，各因素之間如何協(xié)同有待深入研究。