江西3個(gè)地理群體野生鯽肌間骨的比較分析

李福貴 ，程林慧，韓雨晴，張士林，何 坤，孫藝文，吳華東，劉凱月，段曉迪，董傳舉*

（1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，江西南昌 330045；2.河南師范大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，河南新鄉(xiāng) 453007）

【研究意義】肌間骨（intramuscular bone，IB），又名肌間刺或肌間小骨，分布于椎骨兩側(cè)肌間隔中，是由肌膈結(jié)締組織中的間充質(zhì)細(xì)胞不經(jīng)過(guò)軟骨階段直接骨化而成的膜性硬骨，是硬骨魚(yú)類(lèi)特有的結(jié)構(gòu)之一[1-3]。根據(jù)其附著位置分為髓弓小骨（epineuria bone）、脈弓小骨（epipleural bone）和椎體小骨（epicentra?lia bone）3類(lèi)[1]。肌間骨是魚(yú)肉肌肉品質(zhì)的一個(gè)重要指標(biāo)，不同魚(yú)類(lèi)肌間骨的數(shù)量、性狀和分布特征差異顯著，在很大程度上影響其經(jīng)濟(jì)價(jià)值。因此，選育肌間骨數(shù)量少、形態(tài)簡(jiǎn)單的品種具有重要的生產(chǎn)意義與經(jīng)濟(jì)價(jià)值?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】迄今對(duì)肌間骨的研究報(bào)道主要集中在幾個(gè)方面：不同魚(yú)類(lèi)肌間骨解剖和形態(tài)學(xué)分析[4-5]，肌間骨發(fā)育與骨化模式分析[6-13]，肌間骨形成調(diào)控基因或microRNA 鑒定與功能驗(yàn)證[14-21]，通過(guò)雜交、雌核發(fā)育等多種育種手段選育肌間骨少的魚(yú)類(lèi)新品系等[22-26]。研究表明，年齡、游泳方式、進(jìn)化地位、遺傳倍性等均對(duì)魚(yú)類(lèi)肌間骨的數(shù)量、形態(tài)與分布有顯著的影響[1-2,5,22,26-27]。肌間骨的數(shù)量、形態(tài)與分布不僅可以作為魚(yú)類(lèi)分類(lèi)形態(tài)學(xué)指標(biāo)，同時(shí)也是經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi)食用品質(zhì)的重要性狀?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】鯽（Carassius auratus），隸屬于鯉科（Cyprinidae），鯽屬（Carassius），是我國(guó)常見(jiàn)的大宗淡水魚(yú)類(lèi)之一，具有繁殖力強(qiáng)、抗病抗逆能力強(qiáng)、肉質(zhì)鮮美等優(yōu)點(diǎn)，深受消費(fèi)者的歡迎[28-31]。隨著系列優(yōu)良品種的推廣，2018 年全國(guó)鯽總產(chǎn)量達(dá)277 萬(wàn)余噸[31]。然而，在常見(jiàn)的大宗淡水魚(yú)類(lèi)品種中，鯽的肌間骨數(shù)量及類(lèi)型數(shù)量最多[30]。目前有學(xué)者對(duì)洞庭水系二倍體鯽（C.auratus）[26]、異育銀鯽[4]及其選育品系（候選品種）[22]、淇河鯽（Carassius auratusvariety Qihe）[14]、彭澤鯽以及其他改良鯽鯉雜交品種（或品系）[26]的肌間骨的數(shù)量、形狀和分布進(jìn)行了比較研究，但尚未有不同地理群體鯽肌間骨的比較分析報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】因此，本研究對(duì)江西萍鄉(xiāng)（PX）、南昌（NC）、瑞昌（RC）3 個(gè)地理群體野生鯽肌間骨的數(shù)目、形態(tài)和分布進(jìn)行了詳細(xì)的觀察和統(tǒng)計(jì)，以便為鯽肌間骨遺傳改良提供形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2018—2019年在江西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院水產(chǎn)系實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。3個(gè)野生鯽地理群體分別采自江西萍鄉(xiāng)萍水河（PX，113.79°E，27.57°N，海拔85 m）、南昌贛江（NC，116.07°E，28.80°N，海拔17 m）、瑞昌長(zhǎng)河（RC，115.67°E，29.65°N，海拔97 m），地理位置分布見(jiàn)圖1。

圖1 樣品采集點(diǎn)信息Fig.1 Location information of sample collection

圖2 3個(gè)鯽地理群體外形Fig.2 External morphology of crucian carps from 3 geographical populations

為排除個(gè)體大小對(duì)鯽肌間骨數(shù)量的影響，分別采集了體質(zhì)量相近的個(gè)體進(jìn)行分析。采用傳統(tǒng)的方法進(jìn)行試驗(yàn)魚(yú)形態(tài)學(xué)測(cè)量，3個(gè)群體外形圖見(jiàn)圖2，樣品數(shù)和規(guī)格參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 3個(gè)鯽地理群體形態(tài)學(xué)測(cè)量Tab.1 Morphological measurement of crucian carps from 3 geographical populations

1.2 肌間骨的解剖與形態(tài)觀察

肌間骨的解剖、形態(tài)觀察以及分布參照Long 等[32]、李志等[22]和黎玲等[26]描述的方法進(jìn)行。將活魚(yú)麻醉后，擦干魚(yú)體表水分后測(cè)量全長(zhǎng)、體長(zhǎng)、頭長(zhǎng)、體寬、體高、體質(zhì)量、側(cè)線(xiàn)鱗數(shù)等指標(biāo)。用紗布將魚(yú)包裹，于滅菌鍋0.05～0.10 MPa 壓力條件下蒸5 min 至九成熟。待魚(yú)體降溫后剝?nèi)ゼ啿?，于解剖盤(pán)中去除皮膚組織，小心剔除肌肉，從尾至頭依次取出髓弓小骨和脈弓小骨，按其在魚(yú)體中的位置整齊排列，用Canon EOS 70D相機(jī)拍照記錄。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析，數(shù)據(jù)間比較用Duncan法進(jìn)行。柱狀圖采用Sig?maplot12.0軟件繪制，取P＜0.05為顯著性差異，P＜0.01為極顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 3個(gè)地理群體野生鯽總肌間骨數(shù)目比較分析

本研究對(duì)PX、NC與RC 3個(gè)地理群體鯽肌間骨進(jìn)行了解剖觀察，3個(gè)群體均有髓弓小骨和脈弓小骨，均無(wú)椎體小骨。對(duì)3個(gè)群體的左側(cè)、右側(cè)與總肌間骨數(shù)目進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)與比較，結(jié)果見(jiàn)表2。對(duì)3個(gè)群體的髓弓小骨與脈弓小骨數(shù)目進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)與比較，結(jié)果見(jiàn)表3。

表2 3個(gè)鯽地理群體肌間骨數(shù)目Tab.2 Intermuscular bone numbers of crucian carps from 3 geographical populations

表2 結(jié)果表明：PX、NC 與RC 3 個(gè)群體總肌間骨數(shù)目分別為（80.00±3.08），（79.83±8.06）和（83.25±4.99），兩兩之間均無(wú)顯著性差異（P＞0.05）；PX、NC 與RC 3 個(gè)群體右側(cè)肌間骨數(shù)目分別為（39.60±1.82）、（40.83±6.55）和（41.50±4.04），兩兩之間均無(wú)顯著性差異（P＞0.05）；PX、NC 與RC 3 個(gè)群體左側(cè)肌間骨數(shù)目分別為（40.40±2.61）、（39.00±1.55）和（41.75±0.96），PX 與RC 間無(wú)顯著性差異（P＞0.05），但均顯著大于NC群體（P＜0.05）。

表3 3個(gè)鯽地理群體髓弓小骨與脈弓小骨數(shù)目Tab.3 Epineural bone and epipleural bone numbers of crucian carps from 3 geographical populations

表3 結(jié)果表明：PX、NC 與RC 3 個(gè)群體的髓弓小骨數(shù)分別為（54.80±2.39）、（54.80±6.85）和（54.00±3.37），兩兩之間差異均不顯著（P＞0.05）；PX、NC 與RC 3 個(gè)群體的髓弓小骨數(shù)分別為（25.20±3.90）、（25.17±2.32）和（29.25±4.11），兩兩之間差異均不顯著（P＞0.05）。

2.2 3個(gè)地理群體鯽肌間骨形態(tài)與數(shù)量統(tǒng)計(jì)分析

通過(guò)解剖觀察，3 個(gè)群體的肌間骨分為“I”形、“）”、“卜”形、“Y”形、一端多叉形、兩端兩分叉形、樹(shù)枝形和兩端多叉形等8 種類(lèi)型（圖3 和表4）。與已報(bào)道的其他鯉科魚(yú)類(lèi)相比[4]，“）”是特有的肌間骨形態(tài)。PX、RC 群體均包含7 種類(lèi)型，而NC 群體包含8 種類(lèi)型，即多了“兩端多叉型”，且數(shù)量較多（圖3 和表4），呈現(xiàn)了更加復(fù)雜的肌間骨形態(tài)特征。

由表4 可知，3 個(gè)群體所含“I”與“）”形肌間骨數(shù)占比為40%左右，而由此分化的更加復(fù)雜的“卜”與“Y”形肌間骨數(shù)占比為50%左右，其他3種（4種）更加復(fù)雜的肌間骨數(shù)占比為10%左右。

圖3 3個(gè)地理群體鯽肌間骨的比較Fig.3 Comparison of 7（or 8）various types of intermuscular bones among crucian carps from 3 geographical populations

表4 3個(gè)地理群體鯽不同形態(tài)肌間骨數(shù)目Tab.4 Number of intermuscular bones in Crucian carps from 3 geographic populations

由圖4可知，“I”形、“卜”形、“Y”形、“一端多叉”形等4種類(lèi)型肌間骨數(shù)在PX、NC與RC 3個(gè)群體中均沒(méi)有顯著性差異（P＞0.05）；NC 群體“）”形肌間骨極顯著少于PX 與RC 群體（P＜0.01），兩端兩分叉形肌間骨數(shù)量顯著高于RC（P＜0.05）、極顯著高于PX群體（P＜0.01），樹(shù)枝形肌間骨與PX無(wú)顯著差異且兩者均顯著低于RC群體（P＜0.05），兩端多分叉形肌間骨極顯著高于PX與RC群體（P＞0.01）。

圖4 3個(gè)地理群體鯽不同肌間骨的平均數(shù)目Fig.4 The average number of intermuscular bones in crucian carps from 3 geographical populations

2.3 3個(gè)地理群體鯽不同形態(tài)肌間骨分布差異分析

參照其他鯉科魚(yú)類(lèi)肌間骨研究方法，筆者從尾部向頭部逐步解剖，并依次記錄肌間骨的形態(tài)、數(shù)量及分布位置。肌間骨分布從尾部往頭部方向1-9 體節(jié)劃定為尾部，從第10 體節(jié)至27 體節(jié)為軀干部，脊椎往背部方向?yàn)檩S上部，脊椎往腹部方向?yàn)檩S下部（圖5）。3 個(gè)地理群體鯽不同形態(tài)肌間骨分布差異性分析結(jié)果見(jiàn)表5。

圖5 3個(gè)地理群體鯽肌間骨的形態(tài)與分布Fig.5 Morphology and distribution of intermuscular bone in crucian carps from 3 geographical populations

表5 3個(gè)地理群體鯽不同形態(tài)肌間骨分布差異性分析Tab.5 Difference analysis of intermuscular bones distribution in crucian carps from 3 geographic populations

圖5 與表5 可知：PX、NC 與RC 3 個(gè)地理群體鯽左側(cè)、右側(cè)上的軀軸上肌間骨總數(shù)均大于軀軸下肌間骨數(shù)，尾軸上、下肌間骨數(shù)目差異不大；PX、NC 與RC 3 個(gè)群體左側(cè)、右側(cè)的軀軸上肌間骨數(shù)目均顯著大于尾軸上肌間骨數(shù)目（P＜0.05或P＜0.01），軀軸下肌間骨數(shù)均低于尾軸下肌間骨數(shù)目。不同形態(tài)肌間骨在PX、NC、RC 3個(gè)群體中分布特征比較顯示：“I”形在左右軀軸上、下部以及左右尾軸上的分布數(shù)量均無(wú)顯著差異（P＞0.05），但在PX 左尾軸下的分布數(shù)量顯著低于NC、RC（P＜0.05），在RC右尾軸下的分布數(shù)量顯著低于PX、NC；“）”形在NC軀軸與尾軸上、下部分布數(shù)量均低于PX、RC（P＜0.05 或P＜0.01）；“卜”形在NC 軀軸上下部與尾軸上下部分布數(shù)量均低于PX、RC（P＜0.05 或P＜0.01）；“Y”形在NC 軀軸上部分布數(shù)量均低于PX、RC（P＜0.05 或P＜0.01），在NC 尾軸上、下部分布數(shù)量均顯著高于PX、RC（P＜0.05 或P＜0.01）；兩端兩分叉形在NC 軀軸上部分布數(shù)量顯著高于PX、RC（P＜0.05或P＜0.01）；樹(shù)枝形在PX左尾下部分布數(shù)量顯著低于NC、RC（P＜0.05）；兩端兩多叉形僅在NC群體中有分布，左右側(cè)分布數(shù)量無(wú)顯著差異，在尾軸上、下部分布數(shù)量上無(wú)顯著差異，但都顯著低于軀軸上、下的分布數(shù)量。NC軀軸下幾乎無(wú)肌間骨分布，而PX、RC兩個(gè)群體軀軸下均有“）”形、“卜”形肌間骨。上述結(jié)果表明，PX、RC群體軀干部分肌間骨分布數(shù)量均高于NC，而尾部肌間骨分布數(shù)量均低于NC。

3 討論

絕大部分鯉科魚(yú)類(lèi)具有較復(fù)雜的肌間骨且肌肉疏松[4]。因此，有學(xué)者認(rèn)為肌間骨的主要作用可能是肌節(jié)間的力量傳導(dǎo)[32-34]，即在肌肉收縮時(shí)限制肌節(jié)的變形[35-36]。然而，蛋白質(zhì)含量較高的魚(yú)類(lèi)，如鮭形目或鱸形目魚(yú)類(lèi)，肌肉中很少或沒(méi)有肌間骨[1-2,5]，因?yàn)槠淇梢揽考±w維進(jìn)行肌肉力量傳導(dǎo)，較少或不需要借助肌間骨進(jìn)行力量傳遞[1]。李志等[22]推測(cè)魚(yú)類(lèi)肌肉中蛋白質(zhì)含量與肌間骨的數(shù)量相關(guān)，但目前仍缺乏直接的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。鑒于肌間骨對(duì)鮮魚(yú)食用及深加工的不利影響，掌握魚(yú)類(lèi)肌間骨分布特征，并在此基礎(chǔ)上通過(guò)有效的育種方法進(jìn)行遺傳改良，最終獲得更少或沒(méi)有肌間骨的品種，進(jìn)而可為人類(lèi)提供更高品質(zhì)肉類(lèi)產(chǎn)品。

本文發(fā)現(xiàn)PX、NC與RC 3個(gè)群體野生鯽肌間骨分布特征均與已報(bào)道[4]的鯉科魚(yú)類(lèi)相似，表明3個(gè)群體肌間骨分布與進(jìn)化時(shí)空與其他鯉科魚(yú)類(lèi)處于相近階段?？偧￠g骨數(shù)目、右側(cè)肌間骨數(shù)目在PX、NC與RC 3個(gè)群體中兩兩之間均無(wú)顯著性差異（P＞0.05），左側(cè)肌間骨數(shù)目PX與RC群體間無(wú)顯著性差異（P＞0.05），但均顯著大于NC群體（P＜0.05），表明部分鯽的肌間骨并非呈左右對(duì)稱(chēng)分布且不同群體之間會(huì)發(fā)生變化，這種現(xiàn)象在其它鯉科魚(yú)類(lèi)中同樣存在[4-5,9,37]，但與國(guó)內(nèi)早期學(xué)者的研究不一致[38]，導(dǎo)致此現(xiàn)象的原因尚無(wú)明確的定論，但研究報(bào)道表明不同魚(yú)類(lèi)的體型、生態(tài)習(xí)性、游泳速度等均對(duì)其肌間骨數(shù)量有重要影響[9,27,39]。

通過(guò)肌間骨形態(tài)分析發(fā)現(xiàn)，3個(gè)群體的肌間骨共有“I”形、“）”、“卜”形、“Y”形、一端多叉形、兩端兩分叉形、樹(shù)枝形和兩端多叉形8 種類(lèi)型。與已報(bào)道的其他鯉科魚(yú)類(lèi)相比[4]，“）”是特有的肌間骨形態(tài)，與聶春紅等[25]報(bào)道的團(tuán)頭魴特有的“（”肌間骨一致。PX、RC 群體均包含7 種類(lèi)型，而NC 群體包含8 種類(lèi)型，即多了“兩端多叉型”，且數(shù)量較多（圖3 和表4），表明NC 群體的肌間骨形態(tài)特征更加復(fù)雜。圖3 和表4結(jié)果表明，PX、RC群體軀干部分肌間骨分布數(shù)量均高于NC，而尾部肌間骨分布數(shù)量均低于NC?？紤]3個(gè)群體所處河流的水流速度對(duì)肌間骨數(shù)量的影響，本研究中PX 取樣地萍水河是湘江第一支流，流域面積達(dá)584.7 km2，徑流量年均值18.3 m3/s，平均流速約為0.25 m/s（2016 年政府環(huán)評(píng)報(bào)告）；NC 取樣地贛江南昌段流域面積達(dá)83 500 km2，年徑流量約2 130 m3/s，年均流速約為3.3 m/s；RC 取樣地為江西賽湖上游段，平均水深2 m，汛期時(shí)可達(dá)10 m，水域相對(duì)封閉，流速可以忽略不計(jì)。因此，推測(cè)棲息地水流速大是導(dǎo)致NC 群體尾部肌間骨數(shù)量更多且更復(fù)雜的原因。此結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了Danos 和Staab[33]提出的機(jī)械力推動(dòng)了真骨魚(yú)類(lèi)骨骼變異和進(jìn)化的觀點(diǎn)。

本研究觀察到了3個(gè)群體鯽肌間骨數(shù)量及分布特征差異，但原因尚不明確。目前對(duì)于肌間骨形成的主要調(diào)控基因和作用機(jī)制的研究，具有一定進(jìn)展，例如：Lü 等[40]研究發(fā)現(xiàn)MsxC（muscle segment homeobox C）基因可能對(duì)唇?肌間骨的形成有一定影響；Wan 等[20]研究表明團(tuán)頭魴miRNA 可能對(duì)低等真骨魚(yú)類(lèi)肌間骨形成具有調(diào)控作用；張偉卓[16]研究表明團(tuán)頭魴BMP 家族基因在其肌間骨發(fā)生發(fā)育中起到表達(dá)調(diào)控作用；陳宇龍等[17]研究表明團(tuán)頭魴tnmd/xirp2a是其肌腱發(fā)育的重要相關(guān)基因；何蘋(píng)萍等[18]發(fā)掘了與禾花鯉與建鯉肌間骨miRNAs；田雪等[14]、王良炎等[15]、楊敏璇等[30]研究揭示了SOST基因在淇河鯽/鯽肌間骨骨化過(guò)程中起到重要調(diào)控作用。盡管越來(lái)越多報(bào)道顯示相關(guān)基因或miRNA的對(duì)肌間骨形成有重要的調(diào)控作用，但仍無(wú)法解析不同地理群體間肌間骨的差異形成原因。因此，筆者推測(cè)魚(yú)類(lèi)肌間骨的形成可能是由多基因或相關(guān)調(diào)控因子形成的復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)決定，同時(shí)環(huán)境因子（如水流速度）誘發(fā)的表觀遺傳變異共同構(gòu)成了更加多樣的差異。具體作用機(jī)制，仍需進(jìn)一步研究。

鯽魚(yú)味道鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富，但肌間骨較多，鮮肉食用和深加工利用率差，因此迫切需要通過(guò)技術(shù)手段減少其肌間骨數(shù)目。目前，研究人員通過(guò)人工誘導(dǎo)雌核發(fā)育獲得了一尾無(wú)肌間骨的草魚(yú)突變體，且其體型、生長(zhǎng)、脊椎骨和附肢骨發(fā)育均正常[41]；黎玲等[26]通過(guò)遠(yuǎn)緣雜交并結(jié)合人工雌核發(fā)育，并經(jīng)多代選育獲得的改良二倍體紅鯽，以及改良四倍體鯽鯉與改良二倍體紅鯽倍間雜交獲得的改良三倍體鯽鯉“湘云鯽2 號(hào)”的總肌間骨數(shù)目均少于野生二倍體鯽和彭澤鯽；蔣文枰等[23]通過(guò)遠(yuǎn)緣雜交獲得的鲌魴F1和F2肌間骨數(shù)目減少，均表現(xiàn)出比母本翹嘴鲌有利于食用與深加工的優(yōu)勢(shì)，鲌魴F2的總肌間骨數(shù)目略低于鲌魴F1，但每一肌節(jié)平均肌間骨數(shù)目顯著低于鲌魴F1；李志等[22]利用團(tuán)頭魴精子與銀鯽E 系卵子受精后輔以冷休克處理，獲得后代經(jīng)多代雌核雌核發(fā)育得到異育銀鯽F 系，其6 月齡和18 月齡銀鯽F 系軀個(gè)體體軸上肌節(jié)間的復(fù)雜“Y”形髓弓小骨數(shù)目均比相應(yīng)月齡的銀鯽A+系少，而簡(jiǎn)單的“I”形髓弓小骨數(shù)目比相應(yīng)月齡的A+系多，表現(xiàn)出一種有利于食用的優(yōu)勢(shì)。這些結(jié)果表明，通過(guò)遠(yuǎn)緣雜交可以獲得肌間骨較少的優(yōu)良品種。因此，鑒于不同地理群體鯽間肌間骨數(shù)量及形態(tài)特征存在差異，通過(guò)采集親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的鯽地理群體為親本，結(jié)合人工雌核發(fā)育與雜交，可能有助于獲得肌間骨較少的鯽新品種。