葛孟清 劉眾杰 朱旭東 盧素文 管 樂 房經貴

(南京農業(yè)大學園藝學院,江蘇 南京 210095)

光在植物生長發(fā)育過程起著重要的作用,它不僅參與植物各個階段的生長發(fā)育,還為光合作用提供能量。光參與的發(fā)育過程包括芽、莖、葉和根的生長發(fā)育,向光性、葉綠素的合成、分枝以及花的誘導等。光作為一種外部信號,與植物體內激素網絡協調,影響植物生長和發(fā)育[1]。植物中的幾種蛋白質因其在光調節(jié)發(fā)育中的重要作用而被鑒定出來[2-3],其中包括響應光信號的重要轉錄因子BBX基因家族[4]。BBX蛋白(B-box-type protein)在植物和動物中參與細胞生長、細胞分化和轉錄調控等活動,在植物光形態(tài)建成、花發(fā)育及對逆境響應等過程中發(fā)揮重要作用[5],是控制生長發(fā)育調控網絡中的關鍵因素。

BBX蛋白是鋅指結構蛋白家族的一個亞家族,BBX基因家族特征是在N末端具有一個或兩個B-box結構域,有時還在C末端具有一個CCT結構域[6]。目前已在水稻[7]、擬南芥[8]、番茄[9]、蘋果[10]及梨[11]等多種植物中鑒定出BBX基因家族,但對葡萄中的BBX家族還未進行系統(tǒng)的研究。模式植物中對BBX基因功能的研究較多,例如,擬南芥中的AtBBX1/CO是較早發(fā)現的BBX蛋白,其與SPA1互作增強FT基因表達,可以促進長日照下的植株開花[12];擬南芥AtBBX24和AtBBX25通過調控HYH蛋白間接地對hy5產生負調控,對幼苗的光形態(tài)發(fā)生進行微調[13];擬南芥AtBBX21在避蔭條件下下調生長素、油菜素類固醇和乙烯信號通路成分的基因表達,過表達AtBX21可以改善植物的形態(tài)和生理特性,并提高光合速率[14];在高劑量的UV-B輻射下,擬南芥AtBBX31促進紫外線保護物類黃酮和酚類化合物的積累[15]。近年來,BBX基因在其他植物中的研究也在不斷增加,水稻中OsBBX14基因對抽穗期有調節(jié)功能,對水稻的光形態(tài)發(fā)生有積極的調節(jié)作用[16];PpBBX16在梨皮中的短暫過度表達增加了花青素的積累,而病毒誘導的PpBBX16基因沉默減少了花青素的積累[17]。有試驗證明SlBBX20是番茄類胡蘿卜素積累的正向調控因子,與野生型相比,SlBBX20過度表達會導致果實和樹葉綠色更深以及更高水平的類胡蘿卜素合成[18]。

BBX基因家族廣泛參與了植物生長發(fā)育的各個階段以及對逆境的響應過程,有望作為植物的潛在遺傳標記,特別是在功能分析和確定其在多變量脅迫下的作用方面。故本研究通過對葡萄BBX基因家族的鑒定和表達分析,以期了解葡萄VvBBX基因對光信號的響應機制,為葡萄果實營養(yǎng)品質的改良提供方法。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試葡萄品種為1年生陽光玫瑰盆栽苗,購自山東志昌葡萄研究所,種植于南京農業(yè)大學白馬教學科技基地。分別置于自然光、黑暗、紅光、藍光、遠紅光條件下照射24 h,取植株的幼嫩葉片,液氮速凍后存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗方法

1.2.1 葡萄BBX基因家族成員的鑒定 在Pfam(http://pfam.xfam.org)網站下載基于動植物B-box保守結構域的隱馬爾可夫模型文件(Pfam00643),然后利用hmmer 3.0 windows程序對葡萄全基因組蛋白序列進行搜索,得到候選的葡萄BBX蛋白序列。將所有的候選蛋白序列去重復之后,將每一條候選序列分別提交到SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)數據庫和Inter Pro(http://www.ebi.ac.uk/interpro/)數據庫,驗證這些候選蛋是否含有B-box結構域。具有Bbox結構域的候選蛋白即為葡萄中的BBX蛋白,將編碼這些蛋白質的基因定為VvBBX基因。將得到的VvBBXs蛋白序列提交至ExPASY(http://web.expasy.org/protparam/)在線分析網站,預測其分子量(molecular weight,Mw)和等電點(pI)。利用WoLF PSORT(http://www.genscript.com/wolf-psort.html)在線網站進行亞細胞定位分析。

1.2.2 葡萄BBX基因在染色體上的分布 根據VvBBX基因的基因號,在CRIBI(genomes.cribi.unipd.it/grape/)網站上搜索,將VvBBX的定位數據找到,利用MapChart軟件作出VvBBX在染色體上的分布圖。

1.2.3 葡萄BBX基因結構和保守結構域分析 從葡萄基因組中提取VvBBXs基因結構信息,利用在線軟件GSDS繪制基因結構圖。將葡萄BBX蛋白序列提交到MEME(http://meme.nbcr.net/meme)網站鑒定葡萄BBX蛋白的保守基序,參數設置為基序數量10個,使用TBtools軟件將蛋白保守序列的結果做成可視化圖。利用MEGA 6.0軟件構建系統(tǒng)進化樹,進化樹生成算法為NJ(Neighbor-Joining),校驗參數Bootsrtrap重復1 000次。

1.2.4 葡萄BBX基因系統(tǒng)發(fā)育樹的構建 在葡萄全基因組數據庫Grape Genome(http://genomes.cribi.unipd.it/grape)和Phytozom (https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)下載葡萄、擬南芥和水稻全基因組數據,獲取擬南芥、水稻BBX基因家族的蛋白序列,利用MEGA 6.0軟件對3種植物的87個BBX蛋白序列進行系統(tǒng)發(fā)育分析。

1.2.5 葡萄BBX基因家族的同源性分析 利用TBtools軟件對VvBBXS進行葡萄全基因組,葡萄和擬南芥基因組的同源性分析。

1.2.6 葡萄BBX基因啟動子序列分析 獲取BBX基因家族成員起始密碼子ATG上游2 000 bp的序列提交到Plantcare(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)網站上,對所有家族成員的啟動子序列上的作用元件進行分析比較。

1.2.7 葡萄BBX基因的表達模式分析 葡萄芯片數據來源于NCBI的GEO數據庫,芯片編號為GSE36128,葡萄芯片數據包括53個葡萄樣品,覆蓋了葡萄生長過程不同階段的不同器官。利用TBtools軟件繪制熱圖。

1.2.8 不同光質照射下葡萄BBX基因的實時熒光定量PCR 將葡萄植株分別置于自然光、黑暗、藍光、紅光、遠紅光的條件下照射,以自然光照下生長的葡萄植株作 對 照,對BBX2、BBX6、BBX7、BBX8、BBX9、BBX11、BBX13、BBX17、BBX21、BBX24這10個基因進行實時熒光定量PCR。對VvBBXs基因家族的編碼序列進行引物設計(表1)。cDNA合成用HifairII?1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR反轉錄試劑盒。反轉錄產物-20℃保存?zhèn)溆谩崟r熒光定量PCR應用Kubotech Quantagene q225儀(北京酷搏科技有限公司)進行擴增,以葡萄Actin基因為內參,擴增總體系為10μL體系,上下游引物各0.4μL、200 ng·μL-1cDNA 1μL、qPCR SYBR Green Master Mix 5μL、ddH2O 3.2μL。反應程序為95℃預變性300 s;95℃變性10 s,58℃退火30 s,共40個循環(huán)。試驗設3次重復,數據使用OriginPro 8.0軟件分析。

總RNA的提取采用FastPure Plant Total RNA Isolation Kit試劑盒(南京諾維贊生物科技有限公司),反轉錄HifairII?1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR試劑盒、熒光定量染料SYBR GreenI均購自于上海翊圣生物科技有限公司。所用引物由通用生物系統(tǒng)(安徽)有限公司合成(表1)。

表1 VvBBX基因實時熒光定量PCR引物Table1 VvBBX gene fluorescence quantitative real-time PCR primers

2 結果與分析

2.1 葡萄BBX基因家族的鑒定與分析

對葡萄基因組的蛋白序列進行搜索,共得到51條候選序列,最終在葡萄基因組中共鑒定得到25條非冗余葡萄BBX蛋白的編碼基因,根據它們在染色體上的分布,命名為VvBBX1～25(表2)。所有成員的編碼區(qū)序列長度介于384～1 425 bp之間,蛋白長度介于127～474 aa之間,其中VvBBX3的蛋白長度最長,為474 aa,蛋白長度最短的是VvBBX13,為127 aa。所有蛋白等電點介于4.29～9.01,其中等電點大于7的只有4個,分別是VvBBX4、VvBBX10、VvBBX12、VvBBX13。將所有蛋白序列上傳至TargetP 2.0網站,發(fā)現有4個成員定位到分泌途徑上,分別是VvBBX2、VvBBX5、VvBBX7、VvBBX20,有2個成員定位到葉綠體上,分別是VvBBX23、VvBBX24,還有1個成員VvBBX11定位到線粒體上。通過SMART網站對所有成員進行蛋白結構預測,結果可以分為4類,第一類包括4個成員,特點是C端有2個B-box結構域,N端有一個CCT結構;與第一類相比,第二類N端不具有CCT結構,包括13個成員;第三類包括3個成員,特征是C端具有一個B-box結構,N端有一個CCT序列;最后一類是只在C端有一個B-box結構,包括5個成員。基于25個VvBBXs家族基因在染色體上的位置信息,比較分析葡萄的25個VvBBX蛋白序列。使用Mapchart軟件繪制出BBX家族基因在染色體上的分布圖(圖1)。結果表明,22個成員主要分布在11條染色體上(chr1、chr3、chr4、chr5、chr7、chr9、chr11、chr12、chr14、chr18、chr19),其中chr11染色體上分布基因成員最少,只有VvBBX11基因,最多的是chr12,有4個成員,分別是VvBBX12、VvBBX13、VvBBX14、VvBBX15。此 外,VvBBX23、VvBBX24、VvBBX25這3個家族成員未能定位到具體染色體上。此外,所有成員大都分布在染色體的上端、中上端和下端,位于染色體中端的成員僅有5個,分別是VvBBX12、VvBBX13、VvBBX14、VvBBX15和VvBBX18,且VvBBX12、VvBBX13、VvBBX14形成1個基因簇,可見BBX基因家族主要以分散復制和片段復制的方式來完成擴增。

2.2 葡萄BBX家族基因結構的分析

使用MEGA 6.0、GSDS 2.0、TBtools軟件進行分析,得到葡萄BBX基因家族的基因結構和蛋白Motif分布(圖2、圖3)。葡萄25個BBX基因家族成員被分到3個類別,每一類都包含2個亞類、8個成員,且第一類成員中含有的Motif數量要高于其他類,第二類有6個成員,其余11個成員是第三類。由圖2可知,同一類的成員之間所含Motif種類基本相同,且所有基因都含有Motif1和Motif4。除VvBBX19基因外,其他所有基因都至少含有一個UTR區(qū),UTR區(qū)域長度大小不一。所有葡萄BBX基因成員中只有BBX10、BBX16和BBX17基因不含內含子。

2.3 葡萄BBX家族的系統(tǒng)發(fā)育分析

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由圖4可知,所有BBX蛋白分成了A、B、C、D、E共5個分支。其中,25個葡萄BBX蛋白家族成員分布在A、B、C、D這4個分支中,E分支中沒有葡萄BBX蛋白成員。葡萄BBX蛋白家族成員在A分支中存在最多,為8個;在B分支中存在最少,僅有3個,其余2個分支各有7個成員。

2.4 葡萄BBX基因家族的同源分析

基因家族是來源于同一個祖先,由一個基因通過基因重復構成的一組基因,通常它們在結構和功能上具有明顯的相似性,編碼相似的蛋白質產物[19-21]。同一家族的基因可以緊密排列在一起,形成一個基因簇,但多數時候,它們是分散在同一染色體的不同位置,或者存在于不同的染色體上[22]?；驈椭茖蚣易宓漠a生作用很大,基因重復為新基因提供原材料,促進新功能的產生[23]?；虻膹椭浦饕ɑ蚪M復制/片段復制、串聯復制以及基因和染色體水平的重排。串聯復制和片段復制在基因家族的進化和擴展中經常發(fā)生[24]。串聯重復通常會引起基因簇,片段性重復可能導致家族成員的分散。由圖5可知,葡萄BBX基因家族中在12號染色體上存在一個由VvBBX12、VvBBX13、VvBBX14形成的基因簇,在葡萄基因組中鑒定出4對片段重復形成的基因對(VvBBX21/VvBBX14、VvBBX24/VvBBX14、VvBBX4/VvBBX18、VvBBX7/VvBBX18),表明在葡萄BBX基因家族的擴增中,片段復制事件可能比串聯復制更重要。

2.5 葡萄BBX基因家族啟動子序列分析

在NCBI上獲取VvBBX1～25基因起始密碼子上游2 000 bp的啟動子序列,利用Plantcare進行分析,共發(fā)現31種作用元件,不包括CAAT-box、TATA-box,共發(fā)現了8類作用元件(表3)。其中光響應元件有ACE、AE-box、Box-4、G-box、I-box、MRE、Sp1、LAMP等21種,響應激素類的作用元件分為8種,參與茉莉酸甲酯反應的有CGTCA-motif、TGACG-motif,參與赤霉素反應的有GARE-motif、TATC-motif、P-box,與脫落酸、生長素、水楊酸相關的順式作用元件均只有1種,分別是ABRE、TGA-element、TCA-element。此外,還發(fā)現了響應低溫的作用元件LTR,與防御功能相關的元件TC-rich repeats,與傷口反應相關的WUN-motif,還有參與晝夜節(jié)律控制的作用元件circadian以及厭氧誘導所必需的作用元件ARE。還有一些出現次數很少的作用元件分別是與分生組織表達相關的元件CATbox、參與胚乳表達的作用元件GCN4-motif、與柵欄葉肉細胞分化相關的作用元件HD-Zip1、響應干旱脅迫的元件MBS,以及與玉米醇溶蛋白代謝調節(jié)相關的元件O2-site。

由圖6可知,每個成員中都含有大量的啟動子核心作用元件CAAT-box、TATA-box,除核心作用元件之外,每個成員都含有較多的光響應元件和激素響應元件,其中有14個成員(BBX3～6、BBX8、BBX12～14、BBX16、BBX18～21、BBX24)含有與厭氧誘導相關的元件,6個成員(BBX1、BBX5、BBX6、BBX9、BBX12、BBX14)含有與晝夜節(jié)律相關的元件,6個成員(BBX12、BBX16、BBX18、BBX21、BBX22、BBX25)含有響應低溫的順式作用元件。

2.6 葡萄BBX基因家族表達分析

通過對葡萄基因芯片數據的分析,得到25個葡萄BBX基因家族成員在53個葡萄組織中的基因表達譜。利用TBtools軟件繪制基因表達圖譜(圖7),在圖中用紅色和藍色表示基因表達的強度,紅色表示信號強度較強,藍色表示信號強度較弱。結果顯示,BBX家族大部分基因表達強度較強,不同基因在葡萄不同器官、不同時期的表達存在差異。在進化樹中處于同一分支的基因表達情況相似,例如,VvBBX12和VvBBX22基因在葡萄發(fā)育的不同時期表達量都很低;VvBBX6和VvBBX11基因在葡萄的整個生長發(fā)育期都處于高表達狀態(tài)。同樣在整個發(fā)育期都呈較高表達的還有VvBBX5、VvBBX7、VvBBX8、VvBBX9、VvBBX15、VvBBX23、VvBBX24、VvBBX25。此外,VvBBX24和VvBBX25基因在葡萄果實的果皮和果肉中都呈現高表達。

2.7 不同光質下葡萄BBX基因的表達

為探究BBX家族基因在光形態(tài)建成及光合作用方面的作用,對葡萄植株進行不同的光處理。由圖8可知,黑暗處理下,VvBBX2、VvBBX6、VvBBX7、VvBBX13、VvBBX17、VvBBX21、VvBBX24基因表達量升高,其中VvBBX24基因的表達水平升高了5倍;藍光照射下,VvBBX8、VvBBX13、VvBBX24基因表達量上調,其余基因與對照組相比,都表現不同程度的下調,其中VvBBX21基因在藍光下表達量極低,相對表達量接近于0;遠紅光照射下,除VvBBX17外,其他基因均表現為下調;紅光照射下,VvBBX2、VvBBX6、VvBBX9、VvBBX11、VvBBX21基因相對表達量與對照組相比表現為下調,其中VvBBX21基因相對表達量最低。BBX家族基因在不同光質照射下變化明顯,說明BBX家族基因在光調節(jié)反應中有著重要的作用。

表3 葡萄BBX蛋白家族成員啟動子順式作用元件的分析Table3 Analysis of cis-acting elements in promoters of BBX protein family in grape

3 討論

本研究利用生物信息學技術鑒定出25個葡萄BBX基因家族成員,這25個VvBBXs基因均存在Bbox結構域,部分成員在C端存在CCT結構。所有成員在染色體上所處的位置具有一定的差異,多數分布在染色體的兩端,只有VvBBX12、VvBBX13、VvBBX14三個成員形成基因簇分布在12號染色體的中部。所有成員的理化性質存在一定的差異,25個成員中有4個成員的等電點大于7,為堿性氨基酸。通過基因家族多序列對比發(fā)現,它與擬南芥、水稻的BBX蛋白距離較近,在葡萄、擬南芥、水稻3個物種構建的進化樹中,25個VvBBXs分別聚類到A、B、C、D四個分支中,聚類到同一分支中的基因功能可能存在相似性。對擬南芥和葡萄的基因共線性分析發(fā)現,葡萄基因組內一共存在4個基因對,葡萄與擬南芥基因組間有24個基因對,表明葡萄BBX蛋白在進化過程中,在染色體之間發(fā)生片段復制的概率更高,且在不同物種間BBX蛋白具有高度保守性。此外,本研究結果表明,葡萄BBX基因家族成員在葡萄的不同發(fā)育時期、不同組織的表達存在差異,例如VvBBX24、VvBBX25在芽、果實中的表達量較高,VvBBX8則在葉片中表達量較高;不同的家族成員在葡萄植株的整個發(fā)育期的表達量差異較大,BBX12、BBX19和BBX22在整個生長期表達量都在較低的水平。Bai等[25]研究指出,在蘋果中BBX基因與MYB存在互作,促進了蘋果果皮中花青素的積累。本研究發(fā)現了ACE、AE-box、Box-4等21種光響應元件,P-box、ABRE、TGA-element等8種激素類響應元件,還發(fā)現了低溫響應元件LTR以及與晝夜節(jié)律控制相關的作用元件等。同時也發(fā)現了MYB結合位點,這表明葡萄BBX基因與果實的著色相關,其功能還有待進一步研究。

BBX蛋白參與植物的光形態(tài)建成過程,為了探究葡萄VvBBX基因在光形態(tài)建成中的作用,本研究對葡萄植株進行不同光照條件處理,對隨機挑選的10個來自不同組的BBX基因進行表達量分析,結果顯示,不同的光照條件下,10個基因都發(fā)生了明顯的變化。在黑暗處理中,有7個基因表達量升高,這些基因很有可能參與到葡萄植株晝夜節(jié)律的調控;在藍光、紅光以及遠紅光照射下,基因都呈現不同程度的變化。紅光和藍光照射下BBX21基因幾乎不表達,而BBX8基因在藍光和紅光照射下表達量增高,這些變化說明BBX基因家族在光調節(jié)途徑中存在復雜的調控機制,還需進一步驗證。光質對果樹形態(tài)建成、生長發(fā)育及果實品質具有重要的調控作用,且對種子萌發(fā),根、莖、葉的生長,葉片的衰老,基因表達以及次生代謝等產生影響[26-29]。研究表明,紅光促進植物葉片伸展和胚軸伸長,提高凈光合速率,影響同化產物向營養(yǎng)器官的分配,促進植株的生長等;藍光抑制胚軸伸長,增加莖粗,提高生物量,增加類胡蘿卜素含量,提前開花[30]。對在不同光質下的葡萄BBX基因表達進行深入研究將有助于在葡萄生產上實現提質增效的目標。

4 結論

基于葡萄全基因組數據,本研究在葡萄中共鑒定出25個BBX家族基因,將其命名為VvBBX1～VvBBX25。對所有成員進行生物信息學分析發(fā)現,25個成員分布在11條染色體上,其中包括4個分泌通路信號肽、2個葉綠體轉運肽和1個線粒體靶向肽;BBX基因家族的進化分析表明其具有很強的保守性;不同成員在葡萄不同組織中表達存在差異,在不同發(fā)育時期不同家族成員的表達也存在差異;葡萄BBX基因家族啟動子區(qū)域具有豐富的光響應元件和激素類響應元件,表明BBX基因家族是光調節(jié)反應和植物生長發(fā)育的重要因子。本研究結果將為葡萄著色機理、葡萄的光調節(jié)反應以及葡萄的生長發(fā)育研究提供新的思路、新的方向。