楊利峰 趙德明

(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)，北京 100193)

疾病動(dòng)物模型是在生物醫(yī)學(xué)科學(xué)研究中所建立的具有人類(lèi)或動(dòng)物疾病模擬性表現(xiàn)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物疾病模型是生命科學(xué)研究進(jìn)行的基礎(chǔ)。然而，模型是否構(gòu)建成功，需從行為表現(xiàn)、臨床癥狀、體征指標(biāo)、血液、生化指標(biāo)、病理學(xué)指標(biāo)等多方面進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。其中，出現(xiàn)明顯的特征性病理學(xué)變化是重要的評(píng)價(jià)指標(biāo)之一。病理學(xué)是關(guān)于疾病的一門(mén)醫(yī)學(xué)學(xué)科和專(zhuān)業(yè)實(shí)踐學(xué)科，主要研究疾病的本質(zhì)、發(fā)病原因和發(fā)展過(guò)程中結(jié)構(gòu)和功能的變化。病理學(xué)評(píng)價(jià)能夠提供準(zhǔn)確、客觀及全面的反應(yīng)造模條件引起實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的病理變化，對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的開(kāi)發(fā)、相關(guān)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、藥效、藥物安全性評(píng)價(jià)等至關(guān)重要。

1 人類(lèi)疾病實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的分類(lèi)

人類(lèi)疾病實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，即為生物學(xué)、醫(yī)學(xué)及藥學(xué)研究而建立的具有人類(lèi)疾病模擬表現(xiàn)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)對(duì)象。根據(jù)產(chǎn)生原因，可將人類(lèi)疾病實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型分為以下4類(lèi)。(1)自發(fā)性動(dòng)物模型：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物未經(jīng)任何有意識(shí)的人工處置，在自然情況下發(fā)生疾病。一般通過(guò)培育近交系和發(fā)現(xiàn)突變系來(lái)獲得。自發(fā)性動(dòng)物模型以腫瘤和遺傳疾病居多，如無(wú)胸腺裸鼠、自發(fā)性高血壓大鼠、青光眼兔等[1]；(2)誘發(fā)性動(dòng)物模型：通過(guò)物理、化學(xué)、生物致病因素或復(fù)合致病因素人工誘發(fā)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。例如，溫度、放射線(xiàn)照射、噪音刺激等物理因素引起實(shí)驗(yàn)動(dòng)物發(fā)生疾?。唤o易感動(dòng)物接種細(xì)菌、病毒等生物致病因素以誘發(fā)傳染??；化學(xué)致癌劑誘發(fā)腫瘤等[2]；(3)遺傳修飾動(dòng)物模型：使用基因組編輯技術(shù)，人為地修飾、改變或干預(yù)生物原有基因組的遺傳組成，并能產(chǎn)生穩(wěn)定有效遺傳的新品系實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。根據(jù)基因修飾的方式可分為轉(zhuǎn)基因模型、基因敲除模型、基因敲入模型、基因敲減模型等[3-4]。例如，Bao等[5]和Jiang等[6]報(bào)道，hACE2轉(zhuǎn)基因小鼠能夠表達(dá)人血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2(hACE2)，使得SARS-CoV-2能夠以其作為受體進(jìn)入小鼠細(xì)胞，為新型冠狀肺炎(COVID-19)致病機(jī)理、治療方法的研究及疫苗的開(kāi)發(fā)提供模型基礎(chǔ)；APP/tau雙轉(zhuǎn)基因小鼠模型及APP/tau/PS1三轉(zhuǎn)基因模型，能夠較好的復(fù)制阿爾茲海默癥的病理特征[7]；根據(jù)Kersten[8]報(bào)道，已有數(shù)百種基因修飾腫瘤模型應(yīng)用于人類(lèi)腫瘤發(fā)病機(jī)制研究及藥物研發(fā)；(4)特色動(dòng)物模型：具有某些異于其他動(dòng)物特征的動(dòng)物品系或品種。例如，東方田鼠具有抵抗血吸蟲(chóng)的特性，可將其用于血吸蟲(chóng)病發(fā)病機(jī)制的研究[9]。裸鼴鼠不患癌癥的特征使其可以用于抗癌機(jī)制的深入研究[10]。長(zhǎng)爪沙鼠具有腦血管變異缺失的解剖學(xué)特性，是腦缺血研究良好的模型動(dòng)物，且對(duì)多種病原易感，相比于其他嚙齒類(lèi)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，長(zhǎng)爪沙鼠受某些病原感染可表現(xiàn)出與人類(lèi)更相似的病理學(xué)特征和臨床癥狀[11]。

在構(gòu)建實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型時(shí)需遵循相似性、可重復(fù)性、可靠性、適用性、可控性、易行性和經(jīng)濟(jì)性原則，謹(jǐn)慎且精準(zhǔn)地進(jìn)行設(shè)計(jì)及操作，以確保獲得理想的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。

2 人類(lèi)疾病實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型評(píng)價(jià)體系的構(gòu)成和缺陷

在科學(xué)研究中，研究成果的質(zhì)量及可重復(fù)性備受科研人員的關(guān)注。由于之前臨床前動(dòng)物研究在投入臨床后，并未復(fù)制出理想的結(jié)果，導(dǎo)致臨床前和臨床結(jié)果之間缺乏一致性，所以近幾年科研人員開(kāi)始重視從臨床前動(dòng)物模型中所獲得數(shù)據(jù)的可重復(fù)性和質(zhì)量[12-13]。因此，動(dòng)物模型的成功構(gòu)建至關(guān)重要。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型評(píng)價(jià)體系是依據(jù)動(dòng)物模型構(gòu)建的信度和效度(表觀效度、預(yù)測(cè)效度以及結(jié)構(gòu)效度)，基于模型制作原理和方法，結(jié)合不同品系動(dòng)物的特點(diǎn)，對(duì)動(dòng)物模型從整體、組織、細(xì)胞和分子水平進(jìn)行鑒定和評(píng)價(jià)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型評(píng)價(jià)體系的制定與實(shí)施，是我國(guó)醫(yī)藥衛(wèi)生健康產(chǎn)業(yè)穩(wěn)定發(fā)展的重要保障。然而，目前動(dòng)物模型的評(píng)價(jià)體系還很不完善，直接影響模型的嚴(yán)謹(jǐn)性、可重復(fù)性等，而病理學(xué)在建模過(guò)程中，可以對(duì)動(dòng)物的表型鑒定、成模條件等給予重要建議甚至是決定性的結(jié)論，因此成為動(dòng)物模型評(píng)價(jià)的關(guān)鍵指標(biāo)。

如CRISPR和類(lèi)似的基因編輯技術(shù)被認(rèn)為是多種疾病潛在的治療方法，這些疾病包括單基因疾病(如囊性纖維化)、代謝性疾病(如2型糖尿病)、癌癥(如黑色素瘤)、感染性疾病、感染性休克、神經(jīng)退行性疾病(如阿爾茨海默病)等。然而，在這項(xiàng)技術(shù)的快速發(fā)展和應(yīng)用中，人們對(duì)脫靶效應(yīng)、安全性、在使用這些工具時(shí)選擇適當(dāng)?shù)目刂拼胧┑葐?wèn)題尤為關(guān)注。雖然基因編輯工具通常被描述為對(duì)其目標(biāo)“特異”，但不少研究報(bào)道了提高特異性的新方法，這也提出了關(guān)于如何徹底評(píng)估脫靶效應(yīng)的問(wèn)題。病理學(xué)在評(píng)估基因編輯的安全性、目標(biāo)特異性、篩選脫靶效應(yīng)等方面可提供有效的指導(dǎo)[14]。突如其來(lái)的COVID-19疫情給人類(lèi)帶來(lái)了全球性的災(zāi)難，其強(qiáng)大的傳播能力和致命的不良后果，給醫(yī)學(xué)科技帶來(lái)了巨大的考驗(yàn)與挑戰(zhàn)。如何能夠在短時(shí)間內(nèi)篩選出安全、有效的藥物和疫苗，及時(shí)挽救人類(lèi)生命，防控疾病流行，COVID-19的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型則在其中扮演“關(guān)鍵角色”及擔(dān)當(dāng)“重要使命”。然而，造模的動(dòng)物可否表現(xiàn)與人類(lèi)相近的呼吸窘迫癥；是否能表現(xiàn)間質(zhì)性肺炎的特征性病理變化；感染后病毒的定位及分布情況；除肺臟以外，是否發(fā)生其他臟器的損傷。以上問(wèn)題，只有通過(guò)病理學(xué)技術(shù)才能直觀且明確的解釋。病理學(xué)技術(shù)為揭示疾病的致病機(jī)制，評(píng)價(jià)疫苗及藥物的安全性、有效性等提供必備基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和重要技術(shù)保障。

因此，需從臨床癥狀及體征指標(biāo)、血液、生化指標(biāo)、病理學(xué)指標(biāo)等多方面對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型進(jìn)行評(píng)價(jià)，同時(shí)需對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物年齡、性別、品系、基因型等，以及飼養(yǎng)環(huán)境、飲食、健康狀況、微生物學(xué)等環(huán)境因素做出明確要求，以作為規(guī)范化模型的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)[15]。其中，出現(xiàn)明顯的特征性病理學(xué)變化是重要的評(píng)價(jià)指標(biāo)之一。病理學(xué)技術(shù)能夠提供準(zhǔn)確、客觀且全面的評(píng)價(jià)，對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的開(kāi)發(fā)、相關(guān)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、藥效及藥物安全性評(píng)價(jià)至關(guān)重要。

3 病理學(xué)評(píng)價(jià)在人類(lèi)疾病實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型中的作用及意義

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型是生物醫(yī)學(xué)研究中極其重要的“工具”與“載體”。在多種人類(lèi)疾病模型的研究中，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型能夠闡明人類(lèi)疾病的發(fā)病機(jī)制以及用于藥物篩選、疫苗研發(fā)等，加深人類(lèi)對(duì)疾病的理解，促進(jìn)新療法和新診斷技術(shù)的發(fā)展，最終保護(hù)人類(lèi)和動(dòng)物的健康。因此，對(duì)每一種模型的優(yōu)勢(shì)和局限性進(jìn)行深入的探究和描述，以最大限度地發(fā)揮其優(yōu)勢(shì)[15]。病理學(xué)分析能夠提供形態(tài)、分子、生化等數(shù)據(jù)，對(duì)于動(dòng)物模型研究是必不可少的[16]。同時(shí)，還能夠?qū)⑿螒B(tài)學(xué)與發(fā)病機(jī)制聯(lián)系起來(lái)，有助于對(duì)疾病的理解。組織病理學(xué)是動(dòng)物研究，尤其是疾病動(dòng)物模型研究的“轉(zhuǎn)化終點(diǎn)金標(biāo)準(zhǔn)”[13]。

3.1 協(xié)助動(dòng)物造模設(shè)計(jì)

動(dòng)物模型是將潛在療法用于人體臨床試驗(yàn)時(shí)輔助決策的重要工具。近來(lái)，也有不少報(bào)道顯示，臨床前動(dòng)物實(shí)驗(yàn)與隨后的人類(lèi)臨床試驗(yàn)結(jié)果的一致性較差。臨床前動(dòng)物研究的評(píng)估非常重要，科研人員必須重視此類(lèi)研究的計(jì)劃、實(shí)施、分析和報(bào)告的嚴(yán)謹(jǐn)性和質(zhì)量。在此研究過(guò)程中，病理學(xué)是提高數(shù)據(jù)質(zhì)量和實(shí)驗(yàn)可重復(fù)性的重要方式。在造模條件的優(yōu)化、研究過(guò)程的實(shí)施、組織取材的計(jì)劃、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的分析等，病理學(xué)在其中發(fā)揮極其重要的作用[13]。因此，建議病理師應(yīng)盡早的參與到動(dòng)物模型構(gòu)建的研究中，不僅能夠顯著提高造模的成功率，更能有效保障實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷目芍貜?fù)性與科學(xué)性。

3.2 評(píng)價(jià)動(dòng)物模型特征性病變

目前，造模技術(shù)日新月異，包括基因編輯、生物誘導(dǎo)、物理干預(yù)、化學(xué)誘發(fā)等在內(nèi)的多種技術(shù)和方法不斷發(fā)展及創(chuàng)新，但每種技術(shù)的使用，都可能對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物產(chǎn)生不同程度的病理學(xué)改變。不同的造模方法、造模劑量、造模時(shí)間等均可能導(dǎo)致組織器官出現(xiàn)不同的病理表現(xiàn)，不同的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物品系、年齡、性別等也會(huì)影響動(dòng)物的造模設(shè)計(jì)。只有通過(guò)病理學(xué)技術(shù)，才能明確造模引起的組織病變的位置、類(lèi)型、特點(diǎn)及程度，才能夠快速、有效的構(gòu)建出理想的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型用于后續(xù)研究[17]。此外，病理學(xué)技術(shù)在多種類(lèi)基因編輯小鼠模型新表型的篩選與確證中也發(fā)揮著關(guān)鍵作用[18]。通過(guò)病理學(xué)評(píng)價(jià)，能夠最大化從單個(gè)動(dòng)物獲得的數(shù)據(jù)，減少完全評(píng)估某種模型或表型所需的動(dòng)物數(shù)量，改進(jìn)實(shí)驗(yàn)以將對(duì)動(dòng)物的影響降至最低，符合動(dòng)物福利3R原則[19-20]。

病理學(xué)參與到實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型構(gòu)建，可以進(jìn)行如下特征性病變的評(píng)價(jià)：①能夠明確病變發(fā)生的位置。例如，通過(guò)組織病理學(xué)可以觀察到飼喂高果糖的NAFLD模型和飼喂10%豬油的NAFLD模型肝細(xì)胞脂肪變性發(fā)生位置不同，前者主要發(fā)生在匯管區(qū)周?chē)?，后者病變則集中于中央靜脈周?chē)鶾21]；②能夠判斷病變發(fā)生類(lèi)型。例如，在進(jìn)行腫瘤評(píng)估時(shí)，利用病理學(xué)技術(shù)能夠觀察到腫瘤發(fā)生的具體位置、細(xì)胞類(lèi)型、細(xì)胞排列方式、浸潤(rùn)程度等，進(jìn)而確定腫瘤的類(lèi)型及分期；③能夠輔助確定疾病的發(fā)病階段，且能夠直觀地顯示組織及細(xì)胞病變的損傷程度，并進(jìn)一步對(duì)病變損傷程度進(jìn)行分級(jí)。在腫瘤和癌變動(dòng)物模型的評(píng)估中，可以通過(guò)組織學(xué)和細(xì)胞學(xué)分級(jí)方案來(lái)評(píng)估各種器官系統(tǒng)模型的生物學(xué)潛力。例如，上皮癌變的基因編輯小鼠往往表現(xiàn)出從癌前病變到惡變的多階段進(jìn)展。這種多階段的進(jìn)展在胰腺、前列腺、乳腺、雌性生殖系統(tǒng)管狀器官、腎臟、胃腸道、肺、肝臟和皮膚中都可以觀察到。對(duì)病變損傷進(jìn)行分級(jí)，有利于后續(xù)利用數(shù)字評(píng)分系統(tǒng)對(duì)特定疾病的治療效果和結(jié)果進(jìn)行衡量[16]；④病理特殊染色技術(shù)、免疫組織化學(xué)技術(shù)及免疫熒光技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用在病變的定位、定性及定量分析中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，是評(píng)價(jià)動(dòng)物模型是否發(fā)生特征性病變的重要手段。

3.3 發(fā)現(xiàn)造?？赡馨榘l(fā)的病變

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型只能在一定程度上還原疾病相關(guān)的一些特征，并不能完全模擬人類(lèi)的疾病。因此，在造模過(guò)程中勢(shì)必會(huì)出現(xiàn)一些非特征性病變或由于人為因素所造成的背景病變。通過(guò)病理學(xué)技術(shù)，能夠發(fā)現(xiàn)與理想模型無(wú)關(guān)的非特異性病變及背景病變，并盡可能排除其對(duì)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蜆?gòu)建及應(yīng)用造成的干擾。

3.4 分析病理變化與疾病機(jī)理的相關(guān)性

每一種疾病模型的構(gòu)建會(huì)涉及多種造模方法，在通過(guò)這些方法初步構(gòu)建出疾病相關(guān)動(dòng)物模型后，通過(guò)病理學(xué)技術(shù)，能夠進(jìn)一步分析模型與所研究疾病的相關(guān)程度，以篩選出最適宜的動(dòng)物模型。此外，病理學(xué)評(píng)價(jià)還有助于解釋研究中其他生物學(xué)發(fā)現(xiàn)，并結(jié)合研究目的、實(shí)驗(yàn)背景等進(jìn)行綜合分析與驗(yàn)證[22-23]。近幾年來(lái)，多種新發(fā)傳染病的流行，危害著人類(lèi)健康，特別是2019年爆發(fā)的COVID-19，對(duì)人類(lèi)生命健康造成重大威脅，對(duì)該疾病防控和治療，迫切需要篩選或制備對(duì)COVID-19易感的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型用于機(jī)制研究、藥物治療及疫苗篩選。Cleary等[24]報(bào)道，已成功制備了可以感染COVID-19的模型，如基因編輯的hACE2小鼠、金黃地鼠、水貂等，該類(lèi)模型出現(xiàn)與人相似的呼吸窘迫臨床表現(xiàn)，應(yīng)用病理學(xué)技術(shù)也能夠觀察到與臨床癥狀相呼應(yīng)的較典型的間質(zhì)性肺炎及伴發(fā)的病變。

總之，動(dòng)物病理學(xué)作為疾病診斷的“終結(jié)者”，可以從病理學(xué)變化，明確評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物造模是否成功，也可充分體現(xiàn)動(dòng)物模型與造模條件的相關(guān)性、疾病模型的階段性、藥物或疫苗的有效性、安全性等，在使用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的相關(guān)研究中發(fā)揮著不可替代的作用。在進(jìn)行病理學(xué)評(píng)價(jià)的過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)包括造模方法設(shè)計(jì)缺陷、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選取或飼養(yǎng)不當(dāng)、實(shí)驗(yàn)分組設(shè)計(jì)不合理、取材不規(guī)范等一系列問(wèn)題，要想獲得較為準(zhǔn)確的病理學(xué)評(píng)價(jià)結(jié)果，必須要提供實(shí)驗(yàn)動(dòng)物品系、年齡、性別、基因型、飼養(yǎng)管理?xiàng)l件等基礎(chǔ)信息，還應(yīng)提供造模所用方法以及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組情況，以確保病理學(xué)家能夠具體情況具體分析，得出更為精準(zhǔn)的病理學(xué)評(píng)價(jià)結(jié)果。

4 病理學(xué)在人類(lèi)疾病實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型應(yīng)用中的展望

人類(lèi)疾病動(dòng)物模型的成功構(gòu)建，使得人類(lèi)疾病致病因素解析、發(fā)病機(jī)制探討、藥物新靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)、臨床前藥物篩選、藥效評(píng)價(jià)等研究能夠準(zhǔn)確順利進(jìn)行，是生物醫(yī)學(xué)研究和生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展不可或缺的支撐條件[1]。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型作為我國(guó)科學(xué)研究、生物醫(yī)藥和健康產(chǎn)品研發(fā)不可替代的核心生物資源，其成功構(gòu)建在提高我國(guó)自主創(chuàng)新能力、維系國(guó)家安全、發(fā)展醫(yī)藥衛(wèi)生健康產(chǎn)業(yè)等方面具有重要的現(xiàn)實(shí)意義和廣闊的市場(chǎng)前景。

一直以來(lái)，組織病理學(xué)評(píng)價(jià)作為制藥業(yè)安全性研究中有價(jià)值的“終點(diǎn)”，只有經(jīng)過(guò)組織病理學(xué)評(píng)價(jià)，新藥才有機(jī)會(huì)進(jìn)入人體臨床試驗(yàn)階段[19]。由于標(biāo)準(zhǔn)化病理學(xué)評(píng)價(jià)方案的缺乏、實(shí)驗(yàn)病理學(xué)及比較病理學(xué)人才的缺失以及病理學(xué)評(píng)價(jià)全過(guò)程的成本問(wèn)題，病理學(xué)評(píng)價(jià)并未在制藥行業(yè)以外的動(dòng)物研究中普及。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物相關(guān)從業(yè)人員已經(jīng)逐步認(rèn)識(shí)到病理學(xué)的重要性，因?yàn)椴±韺W(xué)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)能夠規(guī)范實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的構(gòu)建與使用，提高實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的相似性、可重復(fù)性、可靠性、適用性及可控性。有經(jīng)驗(yàn)的病理學(xué)家除了擁有豐富的病理生物學(xué)相關(guān)知識(shí)，能夠?qū)?shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行準(zhǔn)確的形態(tài)學(xué)觀察與診斷外，還可以提供動(dòng)物模型構(gòu)建、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、最佳模型樣本收集和處理、數(shù)據(jù)解釋和報(bào)告等方面的專(zhuān)業(yè)知識(shí)[16, 25]。為了拓寬病理學(xué)評(píng)價(jià)的應(yīng)用范圍，推動(dòng)病理學(xué)評(píng)價(jià)體系的構(gòu)建，需要進(jìn)一步加強(qiáng)實(shí)驗(yàn)病理學(xué)及比較病理學(xué)人才的培養(yǎng)，加快標(biāo)準(zhǔn)化的病理學(xué)評(píng)價(jià)方案的制定，加速實(shí)驗(yàn)動(dòng)物病理學(xué)及比較病理學(xué)相關(guān)圖譜的編撰修訂，同時(shí)輔以對(duì)病理人才培養(yǎng)、病理相關(guān)政策制定及病理技術(shù)革新的資金支持，以期將病理學(xué)評(píng)價(jià)全方位、多層次和寬領(lǐng)域的應(yīng)用于未來(lái)的生物醫(yī)學(xué)研究中。