張澤鑫，李 攀，馬曉瑞，謝 芳，魏洪帥，朱艷娟，冀蘆沙

(1.聊城大學 藥學院,山東 聊城250059；2.銀川市疾病預防控制中心，寧夏 銀川750000)

0 引言

根據(jù)影像學和病理學分類，肺癌分為小細胞肺癌和非小細胞肺癌，其中非小細胞肺癌又可以分為肉瘤樣癌、腺癌、鱗狀細胞癌和大細胞未分化癌等，其發(fā)生概率占總肺癌患者的80%-85%[1]?，F(xiàn)階段對于非小細胞肺癌的治療主要以西醫(yī)為主，其中I，II，III A期治療以手術切除為主，如果沒有發(fā)生轉移，那么切除后就不考慮術后輔助治療；如果發(fā)生轉移，則會采取術后輔助治療，比如化療輔助。對于高危的III B期和IV期，主要采取全身治療，目的是為了減輕患者痛苦，提高其生活質量，延長其生存期[2]。近年來，隨著中醫(yī)的發(fā)展，越來越多的患者傾向于采取中西醫(yī)結合治療的策略。患者手術后會通過服用一些補氣益血的中醫(yī)藥來恢復機體正氣，增加機體免疫力，減少術后癌細胞轉移的風險。患者在進行放療、化療或者分子間靶向治療以及免疫療法時，也可以服用一些中醫(yī)藥。一是，可以減輕其毒副作用對機體的傷害；二是,一些中醫(yī)藥有增強敏感性作用，能夠提高治療效果。對于一些肺癌晚期患者，手術治療和輔助治療已經(jīng)沒有意義，此時也可以采取中醫(yī)藥治療。一是減輕患者疼痛感；二是提高患者生存質量；三是延長患者生命[3]。肺癌是一種常見性的惡性腫瘤，其發(fā)病率和致死率呈現(xiàn)逐年上升趨勢。根據(jù)預測，到2025年，我國每年將會有100萬新發(fā)肺癌患者，每年高達90萬人會死于肺癌，那時我國將成為肺癌大國[4]。因此，尋找治療肺癌的有效方法顯得格外重要。本研究中，我們通過從“聊紅椿”中提取有效成分，作用于非小細胞肺癌A459細胞系和肺癌腫瘤模型小鼠，發(fā)現(xiàn)其對非小細胞肺癌具有顯著活性，這為將來對非小細胞肺癌的治療提供了新思路。

1 材料

1.1 藥物

“聊紅椿”提取物由本實驗室通過有機溶劑萃取法提取，并通過旋轉蒸發(fā)儀蒸干濃縮，再用常規(guī)水煎，濃縮至0.20 mg/mL，分裝到EP管中，置于4 ℃冰箱保存，用于后續(xù)研究。非小細胞肺癌治療藥物順鉑(Cisplatin，DDP)，購買于齊魯制藥有限公司，產(chǎn)品批號為：411016CE，含量為20 mg/瓶，用細胞等滲濃度生理鹽水稀釋為0.367 mg/mL。

1.2 動物

選取60只SPF級雄性小鼠，鼠齡6-8 w，重量20 ± 2 g，購買于江蘇省常州卡文斯實驗動物有限公司，合格證號為：SCXK(蘇)2011-0003，飼養(yǎng)于聊城大學藥學院實驗室動物房，室溫控制在25 ℃，空氣濕度保持為70%，采用國家標準飼料喂養(yǎng)，實驗過程中小鼠采取自由飲食和飲水。

1.3 細胞株

人肺腺癌細胞系A549 購自美國ATCC公司，編號 CCL-185，培養(yǎng)于含有100mL/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置于溫度設定為37 ℃，CO2含量為50 mL/L的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.4 試劑

臭椿酮，購買于上海喬羽生物科技有限公司，分析純；MTT(四甲基偶氮唑鹽)，購買于上海Sigma公司；胎牛血清和DMEM培養(yǎng)基均購買于Gibco公司；RNA提取液Trizol，cDNA反轉錄試劑盒以及熒光定量PCR試劑盒均購買于大連TaKaRa公司；細胞凋亡檢測試劑盒Annexin V-FITC購買于江蘇碧云天公司；β-actin、 Bax、Bcl-2、caspase-3、cleaved PARP基因引物由上海生工公司合成；裂解 DNA 修復酶(cleaved PARP)購買于美國Abcam公司；兔抗人β肌動蛋白 (β-actin) 抗體、兔抗人 Bcl-2 抗體、兔抗人裂解型caspase-3 (cleaved-caspase-3) 抗體和兔抗人 Bax 抗體均購買于萬類生物科技公司；甲醇、甲酸等有機試劑購買于國藥集團化學試劑有限公司。

1.5 儀器

液相色譜LC-20A購買于日本島津；熒光定量PCR Prism 7300購買于美國ABI公司；CO2恒溫細胞培養(yǎng)箱FormaSeries和酶標儀Multiskan FC均購買于美國Thermo Fisher Scientific公司；倒置顯微鏡CKX-41購買于日本Olympus公司；流式細胞儀FACS CaliburTMFlow Cytometer REF 34295購買于美國BD公司；低溫高速離心機Eppendorf Centrifuge5810R購買于德國Eppendorf公司；電泳儀及轉膜儀Mini PROTEAN 3 Cell購買于美國Bio-Rad公司；凝膠成像系統(tǒng)Tanon NIM2045購買于中國Tanon公司。

2 方法

2.1 “聊紅椿”有效成分提取

(1) 稱取新鮮“聊紅椿”和野生型臭椿翅果150 g；(2) 液氮冷凍后研磨成粉末，加入少許無水乙醇使其充分溶解；(3) 加入200 ml蒸餾水，超聲處理20 min；(4) 將其轉移到旋轉蒸發(fā)儀中，旋轉蒸發(fā)濃縮成粉末狀;(5) 稱取0.1 g粉末將其置于1.5 mL EP管中，加入1 mL 75%乙醇，室溫下旋轉震蕩抽提12 h；(6) 室溫，12000 rpm，離心10 min，將上清液轉移到新的EP管中；(7) 用0.22 μm 微孔濾膜過濾，將其轉移到HPLC上樣小瓶中，制備成待測樣品，用于后續(xù)HPLC檢測。

2.2 HPLC檢測

色譜儀為島津LC-20A儀器；色譜柱為XTerra (2.1 X 150 mm，C18)；流動相 A相為乙腈，B相為0.1%甲酸水溶液；流速：1.0 mL/min；檢測波長：240-600 nm；柱溫：常溫；進樣量：20 μL；洗脫梯度：0 min A相 10%，B相 90%；20 min A相65%，B相 35%；22 min A相10%，B相 90%；35 min 停止。

2.3 細胞培養(yǎng)

A549細胞株系用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，放置于5% CO2的培養(yǎng)箱中,37 ℃靜置培養(yǎng)。取A549對數(shù)生長期的細胞，采用0.25 %胰蛋白酶消化后進行相關細胞實驗。

2.4 MTT檢測

將上述培養(yǎng)和處理后的細胞接種到96孔板中，每孔100 μL，細胞密度保持5000個左右。將不同濃度的“聊紅椿”提取物加入到96孔板中，培養(yǎng)不同時間，設置3個重復。每孔中加入10 μL 5 g·L-1的MTT溶液(PBS緩沖液配制)，孵育4 h，倒掉上清液。每孔中加入100 μL DMSO，震蕩反應10 min。測定其吸光度，檢測波長為490 nm，計算并統(tǒng)計A549細胞增殖抑制率。

2.5 流式細胞儀檢測細胞凋亡

選取對數(shù)生長期的A549細胞，將不同濃度的“聊紅椿”提取物加入到96孔板中，培養(yǎng)24 h，每個濃度設置3個重復。具體步驟按照Annexin V-FITC細胞凋亡檢測說明書進行操作[5]。

2.6 Real-Time PCR檢測相關基因表達

(1) 總RNA提?。翰捎糜袡C試劑Trizol萃取法，具體步驟參考Trizol提取試劑盒；(2) cDNA反轉錄：具體步驟參考TaKaRa反轉錄試劑盒；(3) Real-Time PCR：具體步驟參考TaKaRa 熒光定量PCR試劑盒。

2.7 Western blot檢測相關蛋白表達

選取對數(shù)生長期的A549細胞，將不同濃度的“聊紅椿”提取物加入到96孔板中，培養(yǎng)24 h，每個濃度設置3個重復。提取各組細胞總蛋白后，按照相關方法和步驟檢測相關蛋白的表達。

2.8 肺癌裸小鼠皮下移植瘤模型建立

選取對數(shù)生長期的A549細胞，將0.25 %胰蛋白酶消化后，將其制成1×108/mL的細胞懸浮液。將其通過注射方式接種0.2 mL到裸小鼠右側頸背交界處皮下，待裸小鼠皮下腫瘤長成即為模型構建成功[6]。

2.9 分組及給藥

裸小鼠模型構建過程中，選取60只小鼠，將其分為6組，每組10只，模型對照組(MC group)，裸小鼠腹腔注射0.9%氯化鈉注射液0.5 mL；陽性藥物治療組(DDP組)，裸小鼠注射0.5 mL DDP稀釋液；低劑量提取物組(L group)，注射1.0 mg/kg的“聊紅椿”提取物；中劑量提取物組(M group)，注射2.0 mg/kg的“聊紅椿”提取物；高劑量提取物組(H group)，注射4.0 mg/kg的“聊紅椿”提取物；聯(lián)合組(LC group)，注射0.5 mL DDP稀釋液和2.0 mg/kg的“聊紅椿”提取物。注射方式為腹腔注射，每3天注射1次，共注射14次，總計實驗進行6 w。6 w后，處死腫瘤小鼠，摘下腫瘤，測量小鼠體質量和腫瘤直徑。

表1 “聊紅椿”提取物對A549細胞增殖的抑制影響

2.10 統(tǒng)計學分析

本研究中所有實驗數(shù)據(jù)均需要通過SPSS19.0統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計學處理，數(shù)據(jù)呈現(xiàn)方式為平均數(shù)±標準差(x±s)。各組數(shù)據(jù)之間采用t檢驗，當P< 0.05時，表示差異顯著，有統(tǒng)計學意義[7]。

3 結果

3.1 “聊紅椿”有效成分HPLC檢測

結果如圖1所示，與野生型相比，“聊紅椿”中有效成分臭椿酮含量顯著高于野生型。鑒于之前的報道，臭椿酮具有很好的抗癌活性。接下來的研究中，我們重點將“聊紅椿”提取物作用于非小細胞肺癌，研究其作用效果和分子機制。

圖1 “聊紅椿”有效成分HPLC檢測

3.2 “聊紅椿”提取物對A549細胞增殖的抑制影響

結果如表1所示，不同劑量“聊紅椿”提取物組作用A549細胞株系后，A549細胞生長受到非常顯著的抑制，且作用時間越長，劑量越高，其抑制效果越好。

3.3 “聊紅椿”提取物對A549細胞凋亡的影響

結果如圖2和表2所示，與對照組相比，不同劑量“聊紅椿”提取物作用A549細胞株系后，A549細胞凋亡率明顯增加，且具有顯著的劑量依賴性。

圖2 “聊紅椿”提取物對A549細胞凋亡的影響

表2 “聊紅椿”提取物對A549細胞凋亡的影響

3.4 “聊紅椿”提取物對A549細胞中相關基因表達的影響

結果如圖3所示，與對照組相比，“聊紅椿”提取物處理后，A549中細胞凋亡因子Caspase-3，Bax，cleaved PARP的mRNA含量顯著下降，抗凋亡因子Bcl-2 mRNA含量顯著增加。

圖3 “聊紅椿”提取物對A549細胞中相關基因表達的影響

3.5 “聊紅椿”提取物對A549細胞中相關蛋白表達的影響

結果如圖4所示，“聊紅椿”提取物對A549細胞中細胞凋亡因子蛋白水平表達的影響與mRNA水平一致。與對照組相比，Caspase-3，Bax，cleaved PARP的蛋白水平顯著下降，抗凋亡因子Bcl-2的蛋白水平顯著增加。

圖4 “聊紅椿”提取物對A549細胞中相關蛋白表達的影響

3.6 “聊紅椿”提取物對裸小鼠體質量及腫瘤直徑的影響

結果如表3所示，“聊紅椿”提取物對各組小鼠體質量影響不顯著，但是顯著影響裸小鼠腫瘤直徑，且具有劑量依賴性。

表3 “聊紅椿”提取物對裸小鼠體質量及腫瘤直徑的影響

4 討論

臭椿Ailanthus altissima(Mill.)Swingle，屬于落葉喬木，也叫椿樹或木礱樹。因其葉基部有腺點，易發(fā)散出臭味而得“臭”字。中醫(yī)研究表明，臭椿樹皮、根皮和莢果等都是中藥材，具有止瀉、止血、清熱燥濕等功效[8]?！傲募t椿”從聊城大學農(nóng)學院臭椿培養(yǎng)基地中發(fā)現(xiàn)的一株穩(wěn)定遺傳的臭椿株系，其莢果呈現(xiàn)紅色。臭椿酮(Ailanthone)是從臭椿中提取分離出來的一種苦味素類化合物，研究發(fā)現(xiàn)其有多種生物活性，如抗過敏、抗HIV、抗炎癥、抗瘧疾、抗微生物和抗?jié)兊萚9]?，F(xiàn)代藥理學研究發(fā)現(xiàn)，臭椿酮還具有抗癌癥、抗病毒和抗結核病等生物活性[10]。近年來關于臭椿酮抗癌活性的報道越來越多，如Zhou Z等研究發(fā)現(xiàn)，臭椿酮可以通過抑制細胞周期蛋白和CDKs的表達，誘導p21和p27的上調表達，進而使得肝癌細胞處于G0/G1期阻滯，最終促進細胞凋亡發(fā)生[11]。He Y等研究發(fā)現(xiàn)，臭椿酮還具有克服藥物治療前列腺癌所產(chǎn)生的耐藥性，同時還具有抑制前列腺癌腫瘤細胞的增殖，其作用機制主要是通過直接結合p23，進而抑制AR(雄激素受體)與HSP90(熱休克蛋白90)的互作，使得AR蛋白發(fā)生不可逆降解，抑制下游基因的表達，從而達到治療前列腺癌的目的[12]。本研究中，我們通過有機試劑萃取法，HPLC分析發(fā)現(xiàn)“聊紅椿”中主要有效成分為臭椿酮，且其含量遠高于野生型臭椿，這個結果說明“聊紅椿”提取物可能比野生型臭椿株系中醫(yī)藥活性更好。

研究發(fā)現(xiàn)臭椿酮及其衍生物還具有很好的抗肺癌功效，其在細胞水平和動物水平抗肺癌主要是通過泛素-蛋白酶體途徑(ubiquitin-proteasome pathway，UPP)，抑制下游相關基因表達[13]。當UPP生物學行為發(fā)生異常時，會造成惡性腫瘤的發(fā)生，這主要是由于當UPP蛋白異常時，會造成細胞內(nèi)與UPP相關的重要功能蛋白發(fā)生降解，進而造成細胞內(nèi)代謝紊亂[14]。Ni Z等研究發(fā)現(xiàn)，臭椿酮可以在體外抑制非小細胞肺癌細胞的生長，體內(nèi)抑制皮下移植瘤的生長，能夠顯著延長荷瘤小鼠的生存質量和生存期。對其機制進行研究，發(fā)現(xiàn)臭椿酮主要是通過下調RPA1(復制蛋白A1)的蛋白表達，抑制DNA復制的發(fā)生，進而抑制非小細胞肺癌細胞的生長[15]。本研究中，我們將“聊紅椿”提取物作用于非小細胞肺癌細胞，發(fā)現(xiàn)“聊紅椿”提取物能夠顯著抑制A549細胞增殖和促進細胞凋亡發(fā)生，具有劑量依賴性。熒光定量PCR和Western blot實驗發(fā)現(xiàn)，“聊紅椿”提取物能夠降低細胞凋亡因子Caspase-3，Bax，cleaved PARP的mRNA和蛋白水平的表達，增加抗凋亡因子Bcl-2 mRNA和蛋白表達，具有劑量依賴性。體外成瘤實驗顯示，“聊紅椿”提取物能夠明顯降低腫瘤細胞直徑，抑制效果與濃度呈正比。

總之，本研究從一個新的突變株系“聊紅椿”中提取出有效成分，發(fā)現(xiàn)其中有高含量的臭椿酮，且對非小細胞肺癌具有抑制細胞增殖和促進細胞凋亡作用。對其機制研究發(fā)現(xiàn)，其通過細胞凋亡因子起作用。但是本研究仍有不足之處，如“聊紅椿”中提取物如何起作用，后續(xù)仍需要大量研究去確定。