熊 娟 王 標 楊紅軍 胡玲玲 文玲梅 高 堅

（1.山川生物科技（武漢）有限公司，湖北武漢430074；2.華中農業(yè)大學，湖北武漢430070；3.咸寧市農業(yè)科學院，湖北咸寧437100）

在水產養(yǎng)殖過程中，飼料成本占養(yǎng)殖成本的70%以上，而水產飼料價格的高低極大程度上取決于飼料中蛋白原料的價格。而魚粉由于其適口性好、蛋白含量高、氨基酸比例平衡、富含高度不飽和脂肪酸和維生素，是特種水產飼料中主要的蛋白源[1]。近年來，隨著水產養(yǎng)殖規(guī)模的擴大，飼料需求的增加及由于過度捕撈帶來的魚粉產量的遞減，導致魚粉難以滿足飼料對蛋白的需要[2]。同時，由于2020年新冠疫情導致國外進口魚粉無法進入國內，引起魚粉價格飛漲。這就迫切需要尋找新的高性價比的蛋白源替代魚粉。雞腸膜蛋白粉（Dried Chicken Solubles, DCS）是以新鮮的雞腸為單一來源，經一系列復合蛋白酶酶解處理后通過噴霧干燥等過程制造出來的新型功能性動物蛋白原料。由于雞腸膜蛋白經過體外酶解后含有大量的小肽和游離氨基酸，可應用于多種動物及同種動物不同生長發(fā)育階段的飼料。在豬上有大量的研究表明，添加適宜比例的腸膜蛋白替代進口魚粉不僅可以提高仔豬采食量和日增重，還可以促進仔豬腸道絨毛發(fā)育，減少斷奶應激和降低料肉比[3-7]。豬腸膜蛋白在水產飼料中僅見零星報道，研究發(fā)現用腸膜蛋白替代部分魚粉可以改善大鱗副泥鰍的生長性能以及提高肝臟抗氧化能力[8]。但是關于雞腸膜蛋白對水生動物生長性能以及腸道健康的影響還未見報道。

大口黑鱸又名加州鱸，原產于北美洲，是一種世界性的游釣魚類。20 世紀70 年代引入我國，目前在廣東、江浙、四川等地大量養(yǎng)殖，而且都取得較好的經濟效益。為此，本試驗選擇加州鱸作為試驗對象，使用3%的雞腸膜蛋白等比例替代進口魚粉（替代比例參考之前在烏鱧上梯度替代的結果），研究腸膜蛋白對加州鱸生長性能、肝臟和腸道健康的影響，旨在探索雞腸膜蛋白促進水產動物生長的機制，為雞腸膜蛋白應用于加州鱸等水生動物養(yǎng)殖和開發(fā)魚粉替代物提供理論依據。

1 材料與方法

試驗魚購自湖北省武漢市鄂州市。試驗魚進入循環(huán)水系統(tǒng)前先進行系統(tǒng)的整體消毒。試驗魚進入循環(huán)水系統(tǒng)后，先暫養(yǎng)一周，以適應循環(huán)水系統(tǒng)的水環(huán)境。暫養(yǎng)期間投喂加州鱸商品飼料，每天兩次，及時清理受傷死亡的魚。本試驗所用飼料在華中農業(yè)大學水產學院營養(yǎng)與生理實驗室制備。魚油和大豆油為脂肪源。豆粕、進口超級蒸汽魚粉、雞腸膜蛋白[山川生物科技（武漢）有限公司提供]及大豆分離蛋白為蛋白源，小麥粉作為黏合劑。其他飼料原料包括：磷酸二氫鈣、氯化膽堿、礦物質混合物、維生素混合物、維生素C、纖維素。纖維素作為調和劑。飼料配方及營養(yǎng)水平見表1。

試驗設置1 個對照組和1 個試驗組，試驗組是在對照組基礎上每噸飼料中用30 kg的腸膜蛋白等比例替代進口魚粉，每組3 個重復。隨機選取300 尾健康的（初始體重3.5 g 左右）加州鱸，隨機分配到6 個網箱，每個網箱50尾魚。采用飽食投喂的方式（初始投喂量占體重4%），精確稱量、記錄投喂量。同時，每天記錄死魚情況，定期清潔殘余餌料和糞便，保持循環(huán)水系統(tǒng)穩(wěn)定，試驗期間水溫(28±0.5) ℃，溶解氧(6±0.5) mg/L，pH值7.6±0.1。試驗期8周。

2 樣品采集與檢測

養(yǎng)殖試驗結束后（8周），停食24 h，統(tǒng)計每缸魚的數量并用吸水紙擦干后稱重，統(tǒng)計存活率、增重率、餌料系數、特定增長率等生長性能。

每缸隨機取3 尾魚用濃度為100 mg/L 的魚安樂（MS-222）麻醉，用無菌注射器采血。采集的樣品放在離心管中，冰上放置1～2 h，3 500 r/min離心10 min，吸取上層血清并分裝離心管中，放置于-20 ℃冰箱，用來測定血清生化指標；每缸隨機各選取4尾試驗魚解剖，解剖后觀察內臟脂肪沉積情況，拍照，分離內臟團、肝臟、脾臟、腸道，將肝臟和腸道的附屬物剔除，用生理鹽水清洗干凈，用濾紙吸干表面的水分，稱重，放入凍存管，-20 ℃保存，準備進行肝臟生化指標測定；腸道取出食糜，液氮速凍，保存于-80 ℃冰箱，準備測消化相關酶活力（胰蛋白酶、糜蛋白酶、脂肪酶）；最后每缸隨機選擇3尾魚，解剖取肝臟組織保存在多聚甲醛中，進行組織切片觀察（HE染色和油紅O染色）。

表1 試驗飼料組成及營養(yǎng)水平（風干基礎，%）

2.1 抗氧化指標測定

血漿甘油三酯（TG）、膽固醇（TC）、總抗氧化能力（T-AOC）、過氧化氫酶（CAT）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（Gpx）、谷草轉氨酶(AST)和谷丙轉氨酶(ALT)活力，肝臟總抗氧化能力（T-AOC）、過氧化氫酶（CAT）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）活力及糜蛋白酶、胰蛋白酶、脂肪酶活力采用南京建成生物工程研究所（南京，中國）提供的試劑盒進行測定。

2.2 組織石蠟切片以及HE染色

將肝臟組織在多聚甲醛中固定24 h后取出，經酒精梯度脫水、二甲苯透明、石蠟包埋（58～60 ℃）、石蠟切片機（Leica RM2135）切片（厚度為5 μm）、攤片、烤片和HE 染色。染色的過程為：切片經二甲苯脫蠟→100%～50%酒精逐級復水→蘇木精染色→流水沖洗氨水返藍→50%～95%酒精逐級脫水→伊紅染色→二甲苯透明→中性樹膠封片→顯微鏡下觀察拍照。

2.3 組織油紅染色

將肝臟組織在多聚甲醛中固定24 h后取出，大致流程如下，肝臟冰凍樣品在冷凍切片機上切片（厚度為6～8 μm）→室溫干燥→10%甲醛緩沖液4 ℃固定120 min→蒸餾水漂洗→60%的異丙醇中漂洗→油紅染液（0.3 g油紅、60 mL異丙醇、40 mL蒸餾水）→60%的異丙醇漂洗→蒸餾水洗→蘇木精中染色→甘油凝膠封片→Nikon 顯微鏡下觀察拍照。

2.4 肝臟脂肪含量測定

在冰箱中取出完整的肝臟組織，稱重m0，室溫化凍后測定脂肪含量：

第一步：將肝臟組織放在EP管內加鋼珠，管中加入1 mL 甲醇∶三氯甲烷（1∶1）溶液，勻漿機勻漿至無組織塊；第二步：每管補充0.5 mL 超純水，充分混勻后低速離心，3 000 r/min 離心5 min，用注射器吸取下層有機相轉入新的EP 管（稱量重量m1），重復2 次；第三步：將EP 管內脂肪用氮吹儀吹干，稱量重量m2；第四步：計算肝臟組織脂肪含量（%）=(m2-m1)/m0×100。

3 數據處理與分析

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件將數據進行單因素方差分析(One-way ANOVA)，P＜0.05 表示具有顯著性差異，數據用“平均值±標準差”表示。

4 試驗結果與分析

4.1 腸膜蛋白對加州鱸生長性能的影響(見表2)

表2 腸膜蛋白對加州鱸生長性能的影響

表2 結果顯示，和對照組相比，3%的腸膜等比例替代進口魚粉，可以提高加州鱸末重、增重率和特定生長率，降低餌料系數（P＞0.05）。

4.2 腸膜蛋白對加州鱸消化吸收能力的影響(見表3)

表3 腸膜蛋白對加州鱸腸道消化酶活力的影響

表3 可見，和對照組相比，腸膜蛋白替代進口魚粉可以顯著提高加州鱸腸道糜蛋白酶、胰蛋白酶和脂肪酶活力（P＜0.05）。

4.3 腸膜蛋白對加州鱸血液指標的影響(見表4)

圖1 腸膜蛋白對加州鱸肝臟和腸道發(fā)育的影響

表4 結果顯示，和對照組相比，腸膜組可以顯著降低加州鱸血液中膽固醇（TC）、谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）和丙二醛（MDA）含量（P＜0.05）。與對照組相比，腸膜組可以顯著提高加州鱸血液中總抗氧化能力（T-AOC）、過氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽過氧化物酶（Gpx）含量（P＜0.05）。

表4 腸膜蛋白對加州鱸血液指標的影響

4.4 腸膜蛋白對加州鱸肝臟和腸道健康的影響(見圖1～圖2)

圖2 腸膜蛋白對加州鱸肝臟脂肪含量的影響

肝臟和腸道生長發(fā)育的結果顯示，腸膜蛋白可以顯著增加加州鱸肝體比（P＜0.05），說明腸膜蛋白可以促進加州鱸肝臟的生長發(fā)育，但是對于腸道的發(fā)育，雞腸膜蛋白有增加腸體比的趨勢，但是和對照組相比差異不顯著（P＞0.05）。肝臟脂肪含量的結果顯示，和對照組相比，腸膜組可以顯著降低加州鱸肝臟脂肪含量（P＜0.05），這與肝臟油紅染色和HE染色結果一致（見圖3～圖4）。同時，腸道切片結果顯示（見圖5～圖6），腸膜組可以增加腸道絨毛高度，促進腸道絨毛發(fā)育。

4.5 腸膜蛋白對加州鱸肝臟抗氧化能力的影響(見表5)

表5 結果顯示，和對照組相比，腸膜組可以顯著提高加州鱸肝臟Gpx 以及CAT 活性，顯著降低MDA含量（P＜0.05）。

5 討論

5.1 腸膜蛋白對加州鱸生長性能的影響

圖3 肝臟HE染色

圖4 肝臟油紅染色

前期在烏鱧上，通過添加3%、6%和9%的雞腸膜蛋白等比例替代進口魚粉，以腸膜蛋白添加量和烏鱧增重率之間的折線模型分析得出雞腸膜蛋白替代魚粉最佳比例為3.31%（如圖7）。為此，本試驗選取3%的雞腸膜蛋白等比例替代進口魚粉。本試驗的結果顯示，3%的腸膜蛋白等比例替代進口魚粉可以提高加州鱸的增重率以及特定生長率。這與陳建在斑點叉尾鮰上的研究得到相似的結論[9]。腸膜蛋白對加州鱸生長的促進作用一方面與雞腸膜中富含大量的小肽有關（小肽含量45%）。傳統(tǒng)營養(yǎng)理論認為，蛋白質經動物采食后在蛋白酶及胰消化酶等作用下分解成一部分肽和大部分游離氨基酸，肽在肽消化酶的作用下再分解成游離氨基酸，然后才直接被動物消化吸收[10]。研究表明，肽在動物體內有著獨立氨基酸的代謝途徑和機制，肽可被動物胃腸道完整的吸收轉運，被動物組織所利用[11]。Gilbert 等[10]研究發(fā)現小腸上的肽載體吸收能力高于各種氨基酸載體吸收能力的總和。其次可能與腸膜蛋白加州鱸提高飼料效率有關。本研究結果表明，腸膜蛋白替代魚粉后提高了加州鱸飼料效率。腸道是魚類消化吸收的主要場所，而魚類的消化吸收能力與消化吸收酶的活性密切相關[12]。胰蛋白酶和糜蛋白酶是由膜腺細胞分泌的進入魚類腸道進行專一性水解蛋白質的蛋白酶類[13]。脂肪酶能將長鏈三酰甘油水解生成脂肪酸和甘油單酯。本研究表明，飼料中添加腸膜蛋白可以顯著提高加州鱸腸道胰蛋白酶、糜蛋白酶和脂肪酶的活力，說明適宜水平的腸膜蛋白能夠提高加州鱸的消化能力。此結果與大鱗副泥鰍上的結果相似[8]。消化吸收酶的活力的提高與腸道和肝胰臟結構健康有關。為此，研究了腸膜蛋白對加州鱸肝臟和腸道健康的影響。

表5 腸膜蛋白對加州鱸肝臟抗氧化能力的影響

圖6 腸道油紅染色

圖7 雞腸膜蛋白添加量與烏鱧增重率之間的折線模型分析

5.2 腸膜蛋白對加州鱸腸道和肝臟健康的影響

魚類肝胰臟和腸道的生長發(fā)育與其消化吸收能力有關[14]。本研究表明，雞腸膜蛋白替代魚粉后，可以提高加州鱸腸體比和肝體比，說明腸膜蛋白可以通過促進消化吸收器官的生長發(fā)育，促進加州鱸的生長。為了進一步探索腸膜蛋白促進腸道和肝臟發(fā)育機制，我們通過肝臟和腸道切片，分析其微觀結構的變化。本試驗的結果顯示，雞腸膜蛋白替代魚粉后可以提高絨毛高度，促進腸道絨毛發(fā)育。這可能與雞腸膜蛋白中含有大量谷氨酸和天冬氨酸有關（雞腸膜蛋白中谷氨酸和天冬氨酸合計16%以上）。在仔豬上的研究發(fā)現，天冬氨酸和谷氨酸是小腸黏膜的主要能量來源，添加這兩種氨基酸可以促進仔豬腸道絨毛的發(fā)育[15]。李晉南[16]在松浦鏡鯉上的研究也發(fā)現，谷氨酸可以改善鯉魚腸道健康。腸道的主要功能是消化和吸收營養(yǎng)物質，肝臟的主要功能被認為是物質代謝和解毒。近年來，研究發(fā)現腸道和肝臟不是兩個相互獨立的器官，而在生物學功能上密切相關，相互影響，機體腸道與肝臟間的交互作用形成腸-肝軸[17]。為此，我們接下來分析了腸膜蛋白對加州鱸肝臟結構的影響。試驗結果顯示，雞腸膜蛋替代魚粉后可以降低肝臟脂肪的沉積，說明腸膜白蛋白可以改善肝臟健康。腸道和肝臟的健康很大程度上與其細胞結構完整性有關[18]。而在魚類組織中含有大量的不飽和脂肪酸，極易受氧自由基攻擊而形成脂質過氧化等，改變細胞膜的通透性和流動性，導致機體的結構和細胞發(fā)生氧化損傷[19]。

5.3 腸膜蛋白對加州鱸機體抗氧化能力的影響

機體的抗氧化能力對魚類尤為重要，而血清的抗氧化指標能夠反映機體的總體抗氧化狀態(tài)，對于評估其抗氧化能力尤為重要[20]。在魚上，丙二醛（MDA）是反映機體脂質過氧化的敏感指標[21]。本試驗的研究結果顯示腸膜蛋白可以顯著降低血液中MDA 含量，說明腸膜蛋白可以通過降低氧化損傷保護機體結果完整性。一般而言，為了抵御外界的氧化應激，機體會產生酶性抗氧化系統(tǒng)來抵御氧自由基誘導的損傷[22]。本試驗的結果顯示，添加腸膜蛋白可以顯著提高血液中SOD、CAT 和Gpx 的活力，而且與MDA 呈現相反的趨勢，說明腸膜蛋白通過提高酶性抗氧化活性降低脂質過氧化，保證其結構完整性。這與本試驗在肝臟中的測定結果一致，說明腸膜蛋白也可以通過提高肝臟抗氧化酶活力降低肝臟中脂肪氧化，從而保證肝臟結構完整性。腸膜蛋白提升機體抗氧化酶活力，可能與雞腸膜中富含功能性小肽有關。蘇玥寧等在草魚上的研究發(fā)現，飼料中添加功能性小肽可以通過激活機體Nrf2-Keap1系統(tǒng)調節(jié)抗氧化酶基因表達，從而調節(jié)機體抗氧化系統(tǒng)[18]。同時，我們也測定了血液中谷草轉氨酶（AST）和谷丙轉氨酶（ALT）活力。而血液中AST和ALT的活力可以反映肝臟健康的關鍵指標，當血液中AST 和ALT 活力升高，說明肝臟結構存在損傷，導致肝臟中這2 種酶進入血液[23]。我們的結果顯示，與對照組先比，腸膜組血液中AST 和ALT 活性顯著降低，說明腸膜蛋白可以降低魚粉中氧化的脂肪誘導的肝臟損傷。

6 結論

試驗結果表明，在飼料中用3%腸膜蛋白等比例替代進口超級蒸汽魚粉可通過提高腸道消化酶活力、腸道絨毛發(fā)育、血清和肝臟抗氧化酶活力，改善肝臟健康，從而促進加州鱸生長。