冉 嫆 劉毓均 夏 果 江明鋒

（1.西南民族大學(xué)青藏高原研究院，四川成都610041；2.西南民族大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，四川成都610041）

近年來，消化型溶菌酶(digestive lysozyme)是一種從反芻動物胃中分離出的新型溶菌酶。該酶能抵抗胃蛋白酶的降解，可以在酸性條件下發(fā)揮溶菌活性，因此能夠?qū)Ψ雌c動物胃中的微生物進行消化分解，并將分解產(chǎn)物作為營養(yǎng)成分加以吸收[1]。反芻動物前胃和真胃的胃黏膜組織均可分泌，其在皺胃組織中表達水平最高[2-3]。

與傳統(tǒng)溶菌酶相比，為適應(yīng)胃中的蛋白酶及酸性的環(huán)境，反芻動物胃溶菌酶發(fā)生了許多適應(yīng)性進化，表現(xiàn)出具有抗菌、耐酸、耐熱及抗胃蛋白酶等優(yōu)點[4-5]，但在嚴峻的胃環(huán)境下保持其溶菌酶活性的機制尚不十分清楚。由于該酶活性和雞蛋清溶菌酶(egg lysozyme, eLYZ)相當，因此可考慮用反芻動物胃溶菌酶代替?zhèn)鹘y(tǒng)溶菌酶作為飼料添加劑，減少胃蛋白酶和胃酸對其活性的影響，達到更好的飼喂效果。

據(jù)報道，黃牛胃消化溶菌酶2在胃中的高穩(wěn)定性可能與其胃蛋白酶抗性和胃溶菌酶本身的適應(yīng)性變化有關(guān)[6]。目前，研究人員主要對人溶菌酶(human Lysozyme, hLYZ)和eLYZ的重組表達進行研究[7-9]，反芻動物胃溶菌酶異源表達的研究報道較少。Jiang等[10]克隆并表達了牦牛胃中編碼溶菌酶的cDNA。江偉華等[11]克隆了藏綿羊胃溶菌酶基因并對其進行原核表達，其生物活性為400 U/mL。任洪輝等[12]利用畢赤酵母表達系統(tǒng)對牦牛胃溶菌酶基因進行分泌表達，獲得上清液酶學(xué)活性為875.14 U/mg。劉毓均等[13]成功利用畢赤酵母對其進行了分泌表達。從目前的研究結(jié)果看，重組胃溶菌酶的表達量較低。為得到表達水平較高的產(chǎn)反芻動物胃溶菌酶的重組菌株，有必要嘗試利用新的表達系統(tǒng)進行表達。解脂耶氏酵母可用于表達各種異源蛋白質(zhì)，其優(yōu)點是：外源基因易整合到酵母基因組，蛋白表達量高，能進行翻譯后加工，重組菌可進行高密度發(fā)酵以及所表達蛋白質(zhì)的低糖基化等[14]。因此常利用解脂耶氏酵母表達一些難表達或表達量低的異源蛋白。

目前，暫未見利用解脂耶氏酵母表達牦牛等高原反芻動物胃溶菌酶的報道。鑒于此，實驗擬用該表達系統(tǒng)構(gòu)建重組酵母菌株。為rysLYZ 在畜牧、醫(yī)藥衛(wèi)生等領(lǐng)域的應(yīng)用及其規(guī)模化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)，進而推動溶菌酶在生產(chǎn)中的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

ysLYZ 序列參考NCBI 牦牛胃溶菌酶基因序列（GenBank 檢索號：AMR70500.1），解脂耶式酵母菌株（Y. lipolyticaPo1h）及表達載體pINA1297為青藏高原動物遺傳資源保護與利用教育部重點實驗室保存。限制性內(nèi)切酶BglⅠ、BamHⅠ、NotⅠ及Premix Taq?等購自TaKaRa 公司，胃蛋白酶、hLYZ 購自Sigma 公司，eLYZ 購自Biotopped 公司，CM-Sepharose FF 預(yù)裝柱（1 mL）購自GE 公司，膠回收試劑盒購自O(shè)mega 公司，BCA蛋白定量試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 基因序列優(yōu)化與重組表達載體構(gòu)建

ysLYZ 基因序列送上海生工合成，通過網(wǎng)站http://www.jcat.de/Start.jsp、DNAMAN 等進行密碼子優(yōu)化，目的基因兩端分別引入BglⅠ和BamHⅠ限制性酶切位點并連接至pINA1297表達載體信號肽的下游。重組表達載體pINA1297-ysLYZ在大腸桿菌TOP10中進行擴增，并進行雙酶切驗證。

1.2.2 重組菌株的篩選及驗證

用限制性內(nèi)切酶NotⅠ對質(zhì)粒pINA1297-ysLYZ進行酶切并線性化。酶切反應(yīng)液于37 ℃水浴酶切反應(yīng)1 h，酶切產(chǎn)物進行電泳檢測。按膠回收試劑盒（Omega 公司）說明書步驟對線性化目的條帶進行切膠回收?；厥蘸康幕虻拇笃危谑覝叵掳凑赵噭┖校‵rozen-EZ Yeast Transformation II ?）轉(zhuǎn)化至Polh 酵母細胞。轉(zhuǎn)化子在MD 平板上生長4～7 d 后，長出白色的轉(zhuǎn)化子并隨機挑取5 個轉(zhuǎn)化子接種至YPD培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜。提取基因組，用PCR驗證引物對轉(zhuǎn)化子進行驗證（引物序列：ysLYZ-F：5'-CTGGCAAGACCTTCGAGCGATG- 3'/ysLYZ- R：5'- AGCAGGGCGGAACAGGAGAC-3'）。

1.2.3 重組菌株的誘導(dǎo)表達及分離純化

將篩選到的單菌落接種到5 mL的YPD液體培養(yǎng)基中，30 ℃、200 r/min 條件下培養(yǎng)24 h，將初培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接至50 mL 的BMSY 液體培養(yǎng)基中，與上述同樣條件下培養(yǎng)。每24 h 收集1 mL 發(fā)酵上清，經(jīng)TCA 法濃縮后進行SDS-PAGE 電泳檢測重組蛋白表達情況。培養(yǎng)96 h 后，發(fā)酵液10 000 r/min 離心10 min 收集上清液并測定rysLYZ活性。用硫酸銨進行分級沉淀，在35%飽和度收集上清液，硫酸銨飽和度到80%收集沉淀并溶解于透析緩沖液中。將蛋白樣品溶液在4 ℃透析48 h。透析結(jié)束后，蛋白樣品于4 ℃、7 000 r/min條件下離心45 min，收集上清液。將透析后濃縮的蛋白樣品以1 mL/min的流速上樣；用5倍柱體積的平衡液以1 mL/min 的流速平衡層析柱至UV 基線及電導(dǎo)率穩(wěn)定。用洗脫液以1 mL/min 的流速對層析柱進行梯度洗脫，根據(jù)層析圖譜對所有出峰洗脫液進行收集，并保存于4 ℃冰箱。

1.2.4 rysLYZ濃度、活性測定及抗菌機理

采用天根生化科技（北京）有限公司生產(chǎn)的蛋白定量試劑盒（BCA 法）方法測定rysLYZ 蛋白濃度。按照溶菌酶檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所）方法配置相關(guān)試劑；采用溶菌酶檢測試劑盒附錄Ⅱ方法配制反應(yīng)體系（如表1）并測定反芻動物胃溶菌酶活性。

表1 空白對照法測定溶菌酶活性的反應(yīng)體系（mL）

反芻動物胃溶菌酶活性計算公式：

溶菌酶活性(U/mL)=

金黃色葡萄球菌培養(yǎng)至菌密度約108～1010CFU/mL，向其中一份菌液中加入純化的rysLYZ，另一方加入相同體積的無菌水作為對照；37 ℃水浴處理4 h 以上。上述樣品經(jīng)處理后送至成都里來生物科技有限公司進行電鏡檢測。

1.2.5 rysLYZ穩(wěn)定性分析

配制模擬豬胃液，分別用去離子水或10 mmol/L醋酸銨緩沖液調(diào)節(jié)hLYZ、eLYZ 及rysLYZ 濃度為1.0 mg/mL，分別加入100 μL模擬胃液，置于37 ℃水浴處理。按時間梯度0、1、2、3、4 h分別各取一組反應(yīng)液，并用5×上樣緩沖液終止反應(yīng)，樣品置于-20 ℃保存?zhèn)溆?。將各時間點獲得的樣品用SDS-PAGE電泳檢測，觀察溶菌酶在模擬豬胃液中的降解情況。

2 結(jié)果

2.1 重組ysLYZ載體的構(gòu)建及驗證

圖1 重組表達載體pINA1297-ysLYZ的構(gòu)建、驗證

ysLYZ 全長390 bp。將擴增培養(yǎng)后重組質(zhì)粒pINA1297-ysLYZ（圖1A）經(jīng)雙酶切鑒定，酶切條帶約400 bp，大小與理論相符（圖1B泳道2）。重組表達質(zhì)粒pINA1297-ysLYZ經(jīng)NotⅠ酶切，成功獲得線性化條帶（圖1B泳道4）。

2.2 ysLYZ重組解脂耶式酵母菌株的篩選及誘導(dǎo)表達

挑選固體平板中生長快且菌落形態(tài)好的重組酵母菌株進行誘導(dǎo)表達，發(fā)酵上清經(jīng)TCA 濃縮后進行SDS-PAGE 電泳。結(jié)果如圖2 所示，rysLYZ 分子量大小約15 kDa，與理論值相符。上述結(jié)果表明，ysLYZ在解脂耶氏酵母中實現(xiàn)了分泌表達，在控制重組酵母菌種接種量、培養(yǎng)體積及誘導(dǎo)劑濃度等因素不變的條件下，rysLYZ 隨培養(yǎng)時間增加而增加，培養(yǎng)72 h 時表達量最高。

2.3 重組菌株分離純化蛋白的比較結(jié)果

隨著不同硫酸銨濃度的加入，發(fā)酵上清中蛋白逐漸被析出，SDS-PAGE 如圖3A 所示。測得發(fā)酵上清酶活性為578.3 U/mL，折算成上清粗酶活性（按mg）為1 156.6 U/mg。當硫酸銨濃度為80%時，沉淀中含有較多的目的蛋白，而對應(yīng)的上清液中無目的蛋白存在。故將二次沉淀時硫酸濃度設(shè)定為80%。rysLYZ樣品經(jīng)硫酸銨沉淀、透析等步驟初純化，經(jīng)CM-Sepharose FF 層析柱進行梯度洗脫后如圖3B，整個純化過程出現(xiàn)兩個蛋白吸收峰并分別收集蛋白樣品；其中吸收峰1 為CM-Sepharose FF 柱平衡液洗脫峰；吸收峰2為CM-Sepharose FF柱洗脫液洗脫峰。

將經(jīng)各步分離純化所獲得的rysLYZ 樣品進行SDS-PAGE，結(jié)果如圖4 所示。其中經(jīng)CM-Sepharose FF柱洗脫液洗脫收集的rysLYZ樣品顯示為一條蛋白條帶（圖4 泳道6），表明該洗脫樣品已經(jīng)達到電泳純。與標準蛋白質(zhì)分子量（Marker）比較，rysLYZ分子量約為15 kDa。

圖2 陽性克隆發(fā)酵上清SDS-PAGE

圖3 硫酸銨分級沉淀SDS-PAGE電泳、CM-Sepharose FF柱層析

圖4 rysLYZ純化樣品SDS-PAGE電泳

上述CM-Sepharose FF 柱洗脫液洗脫樣品經(jīng)超濾濃縮、透析脫鹽等步驟后，分別檢測rysLYZ 活性及蛋白質(zhì)濃度，并計算其比活力為1 855.42 U/mg。

2.4 rysLYZ的抗菌作用

將經(jīng)過rysLYZ 作用后的金黃色葡萄球菌在掃描電鏡下觀察菌體表面輪廓的變化。電鏡下未經(jīng)rys-LYZ 處理的金黃色葡萄球菌表面光滑，輪廓清晰（圖5A）。而與rysLYZ一起孵育的金黃色葡萄球菌，其細胞表面輪廓模糊，部分菌體凸起，出現(xiàn)孔洞，最終崩解（圖5B和圖5C）。

2.5 rysLYZ抗胃蛋白酶能力檢測

消化性胃溶菌酶需要具有蛋白酶抗性才能維持其在胃中的溶菌酶活性。如圖6 所示，rysLYZ 對胃蛋白酶的抵抗力比人（或雞蛋清）溶菌酶高。在模擬豬胃液中，rysLYZ 在作用4 h 后仍有部分保持完整；而人（或雞蛋清）溶菌酶在作用1 h后已無完整的蛋白結(jié)構(gòu)。

圖5 金黃色葡萄球菌的掃描電鏡分析

圖6 胃蛋白酶處理后樣品SDS-PAGE電泳

3 討論

江偉華[15]提取牦牛、藏黃牛、藏綿羊皺胃黏膜中胃溶菌酶的含量分別為0.126、0.078、0.016 mg/g，與其他溶菌酶相比，反芻動物胃溶菌酶能在其他溶菌酶無活性或活性較低的胃中（含有胃蛋白酶和胃酸）保持較高的溶菌能力以及保持結(jié)構(gòu)穩(wěn)定；具有抗雙乙?；?、抗菌、在酸性環(huán)境下穩(wěn)定發(fā)揮功能以及耐受胃蛋白酶降解等性質(zhì)。本研究中主要看重反芻動物胃溶菌酶能夠在富含蛋白酶和胃酸的環(huán)境中保持生物學(xué)活性[16-18]。近年來，越來越多的研究者關(guān)注通過物理或化學(xué)的相互作用來修飾溶菌酶以提高其對革蘭氏陰性菌株的敏感性[19]。在CM-Sepharose FF 柱層析時，出現(xiàn)兩個吸收峰（圖3B）；其中峰1 為平衡液穿透峰且無重組蛋白，分析可能是樣品中色素穿過CMSepharose FF 層析柱時形成的吸收峰。將純化的rys-LYZ與金黃色葡萄球菌一起孵育，發(fā)現(xiàn)rysLYZ主要通過破壞金黃色葡萄球菌細胞壁而發(fā)揮抑菌作用，該實驗結(jié)果與天然胃溶菌酶相似[20]。重組溶菌酶對金黃色葡萄球菌的抑菌作用為溶菌酶可能參與牦牛胃的消化和抑菌活性提供了強有力的證據(jù)。

胃溶菌酶對胃中環(huán)境的適應(yīng)性進化也引起了人們的興趣[21]，胃溶菌酶基因的編碼區(qū)域以一種協(xié)調(diào)的方式進化，反芻動物胃溶菌酶基因編碼外顯子的協(xié)同進化可能有助于溶菌酶在胃中發(fā)揮新的功能[22]，通過對黃牛、綿羊、鹿、葉猴等胃溶菌酶序列與已知序列的溶菌酶進行比較，發(fā)現(xiàn)有一些共同的物理化學(xué)和催化性質(zhì)，使其適應(yīng)在胃液中的功能[23]。在豬的模擬胃液中，rysLYZ能夠在酸性環(huán)境中穩(wěn)定存在并對胃蛋白酶的消化作用具有明顯的抗性，這一獨特的性質(zhì)可能與其蛋白高級結(jié)構(gòu)的構(gòu)象穩(wěn)定性和Asp-Pro 鍵缺失有關(guān)[24-25]。研究表明胃溶菌酶蛋白結(jié)構(gòu)中含有復(fù)合鹽橋、表面凈電荷較低等因素，與蛋清溶菌酶相比，胃溶菌酶具有更高的構(gòu)象穩(wěn)定性即其結(jié)構(gòu)剛性更大。該結(jié)構(gòu)有效規(guī)避了部分胃蛋白酶水解位點，可以防止胃蛋白酶的消化[26-27]。因此，可利用反芻動物胃溶菌酶抗胃蛋白酶的能力制作飼料添加劑。以利于溶菌酶直達腸道，發(fā)揮消炎功能。

在畜牧養(yǎng)殖業(yè)中，已經(jīng)采用溶菌酶作為抗生素替代品添加在飼料中。例如：徐小波等[28]采用添加溶菌酶的飼料喂養(yǎng)仔豬和仔雞，發(fā)現(xiàn)溶菌酶在抑制家畜腹瀉和預(yù)防腸胃炎癥等方面發(fā)揮明顯作用。溶菌酶可溶性粉劑治療仔豬腹瀉效果優(yōu)于傳統(tǒng)用藥，腹瀉率顯著降低，對引起仔豬腹瀉的埃希氏大腸桿菌和輪狀病毒有較強的抑制作用[29]。這些研究結(jié)果表明溶菌酶可在養(yǎng)殖業(yè)中發(fā)揮廣泛作用。另外，溶菌酶腸溶片在人類腸炎、扁平疣、小兒皰疹性口腔炎等人類疾病上均發(fā)揮了重要作用。但是，eLYZ及hLYZ等普通溶菌酶缺乏抗胃蛋白酶的能力，難以抵抗胃中蛋白酶的降解并到達腸道發(fā)揮抗菌作用。因此，在作為藥物或飼料添加劑時，需通過特殊處理或加量的方法維持其功效。若能解決產(chǎn)量問題，反芻動物胃溶菌酶的新的特性使得其在飼料工業(yè)上應(yīng)用前景更為光明，更具商業(yè)價值。從另一角度看，也可在對反芻動物胃溶菌酶性質(zhì)形成機理充分研究的基礎(chǔ)上，對hLYZ或eLYZ進行改造使之具備抗胃蛋白能力并應(yīng)用于醫(yī)療或工業(yè)生產(chǎn)中。

4 小結(jié)

本文采用解脂耶氏酵母菌株（Polh）利用多整合表達載體（pINA1297）實現(xiàn)了ysLYZ的分泌表達，發(fā)酵上清液經(jīng)CM-Sepharose FF柱層析等純化后獲得了電泳純級rysLYZ，該重組酶可破壞金黃色葡萄球菌的細胞壁并具有抗胃蛋白酶及耐胃酸的能力。