王 靜 張秀花 任仲麗 盛春雷 閆世生

山東省菏澤市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院，山東菏澤 274000

養(yǎng)陰清肺丸由地黃、麥冬、玄參、川貝母、白芍、牡丹皮、薄荷、甘草八種中藥組成。作為補(bǔ)益劑，具有養(yǎng)陰潤(rùn)燥，清肺利咽之功效[1-2]，主治陰虛肺燥，咽喉干痛，干咳少痰或痰中帶血[3]。在2019年山東省風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)30 批次樣品檢驗(yàn)過(guò)程中，通過(guò)4個(gè)企業(yè)提供的微生物限度檢查方法適用性試驗(yàn)資料發(fā)現(xiàn)，微生物限度檢查適用性試驗(yàn)均存在方法差異，因此，通過(guò)方法適用性試驗(yàn)來(lái)確定檢驗(yàn)方法的可行性和有效性是十分有必要的[4]。《中國(guó)藥典》2015年版方法較之前發(fā)生了較大變化，所以為了檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確可靠，樣品檢驗(yàn)時(shí)需要重新建立合適的檢驗(yàn)方法[5-6]，并且《中國(guó)藥典》2015年版是目前常用的一種藥品質(zhì)量衛(wèi)生檢驗(yàn)方法[7]，為確保其微生物限度檢查質(zhì)量安全性達(dá)到要求[8]，本研究按《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版四部通則1105、1106[9]，建立養(yǎng)陰清肺丸微生物限度方法適用性試驗(yàn)，確保檢測(cè)方法的可行性及統(tǒng)一性。

1 儀器與試藥

1.1 樣品

北京同仁堂股份有限公司同仁堂制藥廠，批號(hào)為17035288；頸復(fù)康藥業(yè)集團(tuán)赤峰丹龍藥業(yè)有限公司，批號(hào)為1705052；呼倫貝爾松鹿制藥有限公司，批號(hào)為181213；山西華康藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)為2019 0202。

1.2 培養(yǎng)基與稀釋液

胰酪大豆胨瓊脂（TSA）培養(yǎng)基（批號(hào)：190518）、沙氏葡萄糖瓊脂（SDA）培養(yǎng)基（批號(hào)：190625）、胰酪大豆胨液體（TSB）培養(yǎng)基（批號(hào)：190712）、麥康凱瓊脂（MACa）培養(yǎng)基（批號(hào)：170925）[9]、麥康凱液體（MACb）培養(yǎng)基（批號(hào)：171205）、腸道菌增菌液（EE 增菌液）（批號(hào)：180222）、紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào)：180627）、木糖賴(lài)氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂（XLD）培養(yǎng)基（批號(hào)：170804）等均由北京陸橋技術(shù)股份有限公司提供；為了使菌落能更好地生長(zhǎng)，本研究選擇了TSB 培養(yǎng)基作為稀釋液[10]。

1.3 菌種

微生物計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)所用菌種為金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26003]、枯草芽孢桿菌[CMCC（B）63501]、銅綠假單胞菌[CMCC（B）10104]、白色念珠菌[CMCC（F）98001]、黑曲霉[CMCC（F）98003][9]，控制菌檢查方法適用性試驗(yàn)所用菌種為大腸埃希菌[CMCC（B）44102]、乙型副傷寒沙門(mén)氏菌[CMCC（B）50094]，均由廣東環(huán)凱微生物科技有限公司提供，試驗(yàn)所用菌株均為第3 代。

1.4 儀器

高壓蒸汽滅菌器（MLS-3781L-PC，山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司）、電子天平（HZT-A600，精確度：0.01 g，沈陽(yáng)龍騰電子有限公司）、生物安全柜（ClassⅡBSC，山東博科再生醫(yī)學(xué)有限公司）、生化培養(yǎng)箱（SPX-150B，上海博泰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）、電熱恒溫培養(yǎng)箱（DHP-420，蘇州正合測(cè)試設(shè)備有限公司）、細(xì)菌濁度分析儀（GXZ-0101，德國(guó)KEWILL）。

2 方法與結(jié)果

2.1 菌液制備

按2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》 四部通則1105、1106[9]要求進(jìn)行制備。

2.2 供試液制備

取供試品10 g，加TSB 培養(yǎng)基至100 mL，勻漿，制成1∶10 供試液；取上述供試液1 mL 加至9 mL TSB培養(yǎng)基中，制成1∶100 的供試液，依法制成1∶1000 的供試液；取1∶10 供試液2 mL 加至8 mL TSB 培養(yǎng)基中，制成1∶50 供試液。

2.3 需氧菌總數(shù)、霉菌及酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)

2.3.1 常規(guī)法 試驗(yàn)組：取“2.1”項(xiàng)下菌液0.1 mL，加至10 mL 1∶10 供試液中，反復(fù)吹洗，混勻；供試品對(duì)照組：取供試液，以TSB 培養(yǎng)基代替菌液，其他同試驗(yàn)組；菌液對(duì)照組：取TSB 培養(yǎng)基替代供試液，其他與試驗(yàn)組相同。以上每組各取1 mL 注入平皿中，加入15～20 mL 對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)基，每個(gè)菌液平行制備2個(gè)平皿，測(cè)定菌液中的菌落數(shù)。其中，菌液不超過(guò)供試液的1%[11]，下同。2.3.2 增加稀釋液法 試驗(yàn)組：取“2.1”項(xiàng)下菌液0.1 mL，加至10 mL 1∶50或1∶100 供試液中，反復(fù)吹洗，混勻；供試品對(duì)照組：取供試液，以TSB 培養(yǎng)基代替菌液，其他與試驗(yàn)組相同；菌液對(duì)照組：制備同2.3.1 項(xiàng)下菌液組制備方法。以上每組各取1 mL 注入平皿中，加入15～20 mL 對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)基，每個(gè)菌液平行制備2個(gè)平皿，測(cè)定菌液中的菌落數(shù)。

2.4 控制菌檢查

2.4.1 耐膽鹽革蘭氏陰性菌 ①常規(guī)法。供試品組：分別取“2.2”項(xiàng)中1∶10、1∶100、1∶1000 供試液各1 mL 加入10 mL EE 增菌液液體培養(yǎng)基中，平行制備3份；其中兩份加入≤100 cfu 的大腸埃希菌和銅綠假單胞菌，作為陽(yáng)性對(duì)照組，依相應(yīng)控制菌檢查方法檢查；陰性對(duì)照組：以稀釋液代替供試液，其他同供試品組。②增加培養(yǎng)基體積法。供試品組：分別取2.2 中1∶10、1∶100、1∶1000 供試液各1 mL 加入20 mL或50 mL EE 增菌液液體培養(yǎng)基中，平行制備3份；其中兩份加入≤100 cfu的大腸埃希菌和銅綠假單胞菌，作為陽(yáng)性對(duì)照組，依相應(yīng)控制菌檢查方法檢查；陰性對(duì)照組：以稀釋液代替供試液，其他同供試品組。2.4.2 大腸埃希菌 ①常規(guī)法。供試品組：取“2.2”項(xiàng)中1∶10 供試液10 mL，接種至100 mL TSB 培養(yǎng)基中，平行制備2份；其中一份加入≤100 cfu 的大腸埃希菌，作為陽(yáng)性對(duì)照組，依相應(yīng)控制菌檢查方法檢查；陰性對(duì)照組：以稀釋液代替供試液，其他同供試品組。②增加培養(yǎng)基體積法。供試品組：取“2.2”項(xiàng)中1∶10 供試液10 mL，接種至200 mL TSB 培養(yǎng)基中，平行制備2份；其中一份加入≤100 cfu 的大腸埃希菌，作為陽(yáng)性對(duì)照組，依相應(yīng)控制菌檢查方法檢查；陰性對(duì)照組：以稀釋液代替供試液，其他同供試品組。2.4.3 沙門(mén)菌 ①常規(guī)法。供試品組：取供試品10 g，接種至100 mL TSB 培養(yǎng)基中，平行制備2份；其中一份加入≤100 cfu 的乙型副傷寒沙門(mén)菌，作為陽(yáng)性對(duì)照組，依相應(yīng)控制菌檢查方法檢查；陰性對(duì)照組：以稀釋液代替供試液，其他同供試品組。②增加培養(yǎng)基體積法。供試品組：取供試品10 g，接種至200 mL TSB 培養(yǎng)基中，平行制備2份；其中一份加入≤100 cfu 的乙型副傷寒沙門(mén)菌，作為陽(yáng)性對(duì)照組，依相應(yīng)控制菌檢查方法檢查；陰性對(duì)照組：以稀釋液代替供試液，其他同供試品組。

2.5 結(jié)果

2.5.1 企業(yè)微生物限度方法適用性試驗(yàn) 方法適用性試驗(yàn)中需氧菌總數(shù)3個(gè)企業(yè)采用常規(guī)法，1個(gè)企業(yè)采用增加稀釋液法（1∶50）；霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)4個(gè)企業(yè)均采用常規(guī)法；耐膽鹽革蘭陰性菌3個(gè)企業(yè)采用常規(guī)法，1個(gè)企業(yè)采用增加培養(yǎng)基體積法；大腸埃希菌4個(gè)企業(yè)均采用常規(guī)法；沙門(mén)菌3個(gè)企業(yè)采用增加培養(yǎng)基體積法（200 mL），1個(gè)企業(yè)采用常規(guī)法（表1）。2.5.2 微生物限度方法適用性試驗(yàn)結(jié)果 4個(gè)企業(yè)分別采用了常規(guī)法、增加稀釋液法（1∶50、1∶100）兩種稀釋級(jí)進(jìn)行了方法適用性試驗(yàn)，每種試驗(yàn)菌回收比值均在0.5～2.0，但是增加稀釋液法比常規(guī)法回收比值高（表2）。4個(gè)企業(yè)分別采用了常規(guī)法、增加培養(yǎng)基體積法進(jìn)行方法適用性試驗(yàn)，兩種方法均呈陽(yáng)性結(jié)果（表3）。

3 討論

3.1 試驗(yàn)小結(jié)

藥品評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)中微生物限度直接關(guān)系藥品自身質(zhì)量，更是關(guān)系到患者的用藥安全[12]，中成藥組分相對(duì)復(fù)雜，劑型廣泛，微生物檢測(cè)方法的適用性試驗(yàn)就顯得更為重要[13-15]。方法適用性試驗(yàn)的本質(zhì)是建立對(duì)樣品影響更小、操作率更高的方法[16]，但其本身工作量大，而且存在不同實(shí)驗(yàn)室方法欠佳、重復(fù)勞動(dòng)過(guò)多的問(wèn)題[17]，因此同一品種建立統(tǒng)一合理有效的方法適用性試驗(yàn)是重點(diǎn)。

本研究結(jié)果顯示，4個(gè)企業(yè)微生物限度方法適用性試驗(yàn)均存在方法差異。針對(duì)這一問(wèn)題，本研究分別對(duì)4個(gè)企業(yè)養(yǎng)陰清肺丸微生物限度方法適用性試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。本研究結(jié)果顯示，4個(gè)企業(yè)需氧菌總數(shù)3種方法回收比值均在0.5～2.0；霉菌及酵母菌總數(shù)兩種方法回收比值均在0.5～2.0，因此，4個(gè)企業(yè)的養(yǎng)陰清肺丸微生物計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)均可采用常規(guī)法。4個(gè)企業(yè)耐膽鹽革蘭氏陰性菌、大腸埃希菌、沙門(mén)菌的兩種方法均出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果，因此，4個(gè)企業(yè)控制菌檢查均可采用常規(guī)法。

表1 4個(gè)企業(yè)提供的微生物限度檢查方法適用性試驗(yàn)

表2 微生物計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)回收比值

表3 控制菌方法適用性試驗(yàn)結(jié)果

3.2 結(jié)果分析

目前，藥品微生物限度檢查是客觀衡量藥品（主要指中藥及含有動(dòng)植物提取物的品種）質(zhì)量的一項(xiàng)重要指標(biāo)[18]，主要涉及到藥品原材料及輔料的生產(chǎn)工藝步驟、生產(chǎn)環(huán)境等方面。因此，藥品微生物限度檢驗(yàn)非常重要，但在檢驗(yàn)過(guò)程中很容易受到各種因素影響從而發(fā)生誤差，所以，生產(chǎn)企業(yè)需重視人員、物品、環(huán)節(jié)及制度等各方面改善，優(yōu)化質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，針對(duì)性加強(qiáng)防范和控制，確保降低誤差率[19]。

目前，全國(guó)共有48家企業(yè)生產(chǎn)養(yǎng)陰清肺丸，55個(gè)批準(zhǔn)文號(hào)，其中成藥原藥材、功能主治一致，但劑型不同、生產(chǎn)企業(yè)不同，生產(chǎn)工藝與輔料會(huì)有所差異，最終導(dǎo)致抑菌活性的區(qū)別[20]。從表2 可以看出，因原料產(chǎn)地、批次、輔料及生產(chǎn)工藝存在一定差異，不同生產(chǎn)企業(yè)同一品種的微生物限度方法適用性試驗(yàn)結(jié)果存在差異，尤其是微生物計(jì)數(shù)回收比值，盡管常規(guī)法每種試驗(yàn)菌的回收比值低于培養(yǎng)基稀釋法，但均在0.5～2.0，符合試驗(yàn)要求，為方便不同企業(yè)檢驗(yàn)人員操作，可以統(tǒng)一采用常規(guī)法。