張娟利，李 驊，王文軍，黃少杰，馬 陽，丁 一*，文愛東,*

1空軍軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院藥劑科，西安710032；2陜西中醫(yī)藥大學藥學院，咸陽712046

腦卒中(stroke)是一種突然起病的腦血液循環(huán)障礙性疾病，以發(fā)病率、死亡率及致殘率高為特點，嚴重威脅著人類健康及生活質(zhì)量[1]。目前治療方法以早期溶栓恢復血流、實現(xiàn)血管再通為主，但大多數(shù)患者因受治療時間窗或其他禁忌癥的限制不能獲得溶栓治療。而以往針對單一靶點、單一環(huán)節(jié)的治療藥物由于不能完全、有效地阻斷腦卒中的缺血級聯(lián)反應(yīng)，致使其在臨床試驗中屢遭失敗[2]。中藥具有多組分、多靶點及整體調(diào)節(jié)的優(yōu)勢特點，恰可以作用于腦卒中的多個病理環(huán)節(jié)，通過調(diào)整機體的自身修復功能而起到治療作用，是研發(fā)抗腦缺血損傷藥物新的突破點[3]。丹參(Salviae Miltiorrhizae，SM)、丹皮(Cortex Moutan，CM)藥對，源自《施今墨對藥臨床經(jīng)驗集》，其中丹參善于活血化瘀，祛瘀生新，丹皮長于清熱涼血，活血散瘀。兩者相須為用，同氣相求，是活血化瘀的經(jīng)典藥對。臨床研究表明，丹參-丹皮藥對及其組成的多種制劑(雙丹口服液，丹膝顆粒等)在防治腦血管疾病方面發(fā)揮著重要作用，但至今丹參-丹皮治療腦卒中的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機制尚未完全闡明，限制了其臨床推廣和二次開發(fā)。

近年來網(wǎng)絡(luò)藥理學(network pharmacology)在國際上興起，它通過運用各大數(shù)據(jù)庫進行藥物與疾病相關(guān)靶點信息的搜集、預測與篩選，構(gòu)建“藥物-基因-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)，從整體的角度去揭示藥物與疾病的關(guān)聯(lián)性，這與中醫(yī)藥整體觀與辯證論治的原則不謀而合，因而被廣泛應(yīng)用于中藥藥效物質(zhì)篩選和作用機制的研究[4]。分子對接技術(shù)(molecular docking)通過模擬小分子配體與蛋白受體的相互作用方式、結(jié)合能等預測藥物與受體之間結(jié)合的穩(wěn)定性，是藥物虛擬篩選的重要手段[5]?；诖?，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學和分子對接方法探討丹參和丹皮有效成分配伍抗缺血性腦損傷的作用機制，為該藥對的藥效成分篩選和進一步研究提供理論依據(jù)。

1 材料

本研究使用的數(shù)據(jù)庫、分析平臺及軟件相關(guān)信息見表1。

表1 數(shù)據(jù)庫、分析平臺及軟件相關(guān)信息

2 方法

2.1 丹參-丹皮化學成分的構(gòu)建與篩選

登錄中藥系統(tǒng)藥理學分析平臺TCMSP，分別以“丹參”和“牡丹皮”為關(guān)鍵詞檢索其所有的化學成分，在此基礎(chǔ)上，以口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%和類藥性(drug-like，DL)≥0.18作為活性成分的篩選條件，將符合條件的化合物信息錄入Excel表格。此外，《中國藥典》對兩味藥的質(zhì)量控制成分以及明確的生物活性報道的化合物也被作為候選成分納入分析。最后，采用ChemBioDraw Ultra軟件繪制上述候選成分的化學結(jié)構(gòu)，并以mol2格式保存。

2.2 丹參-丹皮相關(guān)靶點收集

將得到的候選成分去除重復后，在TCMSP分析平臺檢索候選成分的相關(guān)靶點，并通過UniProt數(shù)據(jù)庫將候選成分的靶點名稱轉(zhuǎn)換為基因名稱。

2.3 腦卒中靶點獲取

以“stroke”為檢索詞分別在CTD、TTD和GeneCards數(shù)據(jù)庫中檢索疾病相關(guān)靶點，為了篩選高可信度的蛋白作為候選靶點，分別將CTD和GeneCards數(shù)據(jù)庫的篩選條件設(shè)置為inference score≥70和relevance score≥20。合并3個數(shù)據(jù)庫的檢索結(jié)果，去除重復靶點后，最后通過UniProt數(shù)據(jù)庫將腦卒中相關(guān)靶點名稱標準化。

2.4 藥物-疾病共同靶點的篩選與PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將丹參-丹皮成分靶點與腦卒中疾病靶點分別導入在線韋恩圖Venny 2.1，可獲得在線韋恩圖和共有靶點信息。再將共同靶點導入STRING數(shù)據(jù)庫，限定物種為“Homo sapiens”，minimum required interaction score≥0.7。獲取蛋白質(zhì)相互作用(PPI)信息，并導入Cytoscape軟件進行拓撲分析和PPI網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建。

2.5 基因富集分析

為了進一步了解共有靶點的功能以及在信號通路中的作用，利用R語言中的“ClusterProfiler包”對篩選的共有靶點進行GO功能和KEGG通路富集分析(P<0.05)。

2.6 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

準備候選成分及其對應(yīng)靶點的數(shù)據(jù)文件，導入Cytoscape軟件構(gòu)建成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖，以探究丹參-丹皮活性成分的藥理學作用機制；基于KEGG富集的前15條通路，反向篩選得到其對應(yīng)的腦卒中靶點和活性成分，制作“成分-靶點-通路”的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系表，將其導入Cytoscape軟件，構(gòu)建丹參-丹皮治療腦卒中的“成分-靶點-通路”圖，以分析丹參-丹皮藥對治療腦卒中的作用機制。

2.7 分子對接驗證核心成分和靶點

以“成分-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)中度值較大的靶點及靶向成分為研究對象，進行分子對接驗證。對接步驟如下：①從PDB數(shù)據(jù)庫下載核心靶蛋白3D結(jié)構(gòu)，運用PyMoL軟件移除靶蛋白中的配體和非蛋白分子(如水分子)，配體和蛋白均保存為pdb格式文件；②采用AutoDock Vina將靶蛋白、配體和mol2格式的化合物均轉(zhuǎn)換為pdbqt格式文件；③以配體為中心尋找靶蛋白活性位點，記錄設(shè)置Grid Box坐標和盒子大小，采用AutoDock Vina進行分子對接；④選取與靶蛋白對接結(jié)合能最高的成分，采用PyMoL軟件可視化結(jié)果。

3 結(jié)果

3.1 “丹參-丹皮”活性成分的篩選

本實驗共檢索出丹參化學成分202個，牡丹皮化學成分55個，去除3個重復成分(咖啡酸、齊墩果酸和油酸)后，共得到丹參-丹皮相關(guān)成分254個。經(jīng)OB≥30%，DL≥0.18篩選和《中國藥典》檢索質(zhì)控成分，剔除無靶點成分后，總共得到66個丹參-丹皮候選成分，其中59個來自丹參，7個來自丹皮(表2)。

表2 “丹參-丹皮”經(jīng)篩選得到的66個候選成分信息

續(xù)表2(Continued Tab.2)

續(xù)表2(Continued Tab.2)

3.2 “丹參-丹皮”成分靶點的篩選

通過對TCMSP數(shù)據(jù)庫進行檢索，共得到66個候選成分的相關(guān)靶點。其中56個丹參活性成分獲得118個潛在作用靶點，7個丹皮活性成分獲得160個潛在作用靶點，去除兩藥77個共有靶點，共得到“丹參-丹皮”成分靶點201個。最后通過Uniprot數(shù)據(jù)庫將預測出的靶點蛋白名轉(zhuǎn)換為基因名。

3.3 “丹參-丹皮”成分-靶點網(wǎng)絡(luò)分析

如圖1所示，丹參-丹皮藥對成分-靶點網(wǎng)絡(luò)共含有267個節(jié)點(66個候選成分和201個相關(guān)靶點)和921條邊。運用Cytoscape中的NetworkAnalyzer功能進行網(wǎng)絡(luò)拓撲分析，節(jié)點的度值(degree)為描述網(wǎng)絡(luò)節(jié)點的重要指標。每個化合物的平均靶點為13.95個，每個靶點平均與3.05個化合物相互作用。從化合物角度分析，有17個成分的作用靶點≥20個，其中排名前10的分別是槲皮素(MOL000098)、山柰酚(MOL000422)、木犀草素(MOL000006)、丹參酮IIA(MOL007154)、丹皮酚(MOL000874)、隱丹參酮(MOL007088)、4-亞甲丹參新酮(MOL007049)、鼠尾草酚酮(MOL007145)、二氫丹參內(nèi)酯(MOL007100)和異隱丹參酮(MOL007108)。從靶點的角度分析，有24個靶點與10個以上的化合物相互作用，其中排名前10的分別是PTGS2、ADRB2、NCOA1、SCN5A、CHRM1、PTGS1、ACHE、OPRM1、ADRA1A和RXRA。因此，丹參-丹皮藥對存在單個成分與多個靶點相互作用，同時也存在單個靶點與多個成分相互作用的現(xiàn)象，進一步證實了丹參-丹皮藥對具有多組分、多靶點協(xié)同增效的作用。

圖1 “丹參-丹皮”成分-靶點網(wǎng)絡(luò)Fig.1 The component-target network of SM-CM注：圖中紫色節(jié)點為丹參活性成分；黃色節(jié)點為丹參成分靶點；紅色節(jié)點為丹皮活性成分；藍色節(jié)點為丹皮成分靶點；綠色節(jié)點為丹參和丹皮的共有靶點。Note:The purple nodes are the active components of SM;The yellow nodes are the targets of SM;The red nodes are the active components of CM;The blue nodes are the targets of CM;Green nodes are the common targets between SM and CM．

3.4 “丹參-丹皮”治療腦卒中的靶點篩選及PPI網(wǎng)絡(luò)分析

以“stroke”為關(guān)鍵詞檢索腦卒中相關(guān)靶點，從CTD數(shù)據(jù)庫得到靶點152個，從TTD數(shù)據(jù)庫得到靶點29個，從GeneCards數(shù)據(jù)庫得到靶點112個，去除重復靶點后，最終得到腦卒中相關(guān)靶點222個。再將201個丹參-丹皮候選成分的靶點與222個腦卒中相關(guān)靶點取交集，得到67個共有靶點，證實丹參、丹皮可能通過多個潛在作用靶點協(xié)同發(fā)揮抗腦缺血損傷的作用(圖2)。為了進一步探討丹參-丹皮的成分靶點與腦卒中靶點在蛋白水平上的作用機制，將67個共同靶點導入STRING數(shù)據(jù)庫進行PPI網(wǎng)絡(luò)分析，再將分析結(jié)果導入Cytoscape 3.7.2繪制PPI網(wǎng)絡(luò)(圖3)。PPI網(wǎng)絡(luò)圖中共涉及66個節(jié)點(node)，586條邊(edge)，PPI網(wǎng)路圖中，節(jié)點根據(jù)度值從最低點以順時針排列為圓形，節(jié)點越大、顏色越深代表其度值越大。其中，共有29個蛋白度值高于平均值，度值較大的靶點為AKT1、TNF、IL6、MAPK8、MMP9、TP53等，表明這些蛋白在網(wǎng)絡(luò)中與其他蛋白相互作用較多，在PPI網(wǎng)絡(luò)中扮演著重要的角色。

圖2 “丹參-丹皮”靶點與腦卒中靶點Venn圖Fig.2 Venn diagram of targets for SM-CM and stroke

圖3 “丹參-丹皮”共有靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)Fig.3 The PPI network of the common targets between SM and CM注：靶點度值隨圖形大小和顏色深淺變化。Node:The value of target degree changes with the size and color of the figure.

3.5 GO功能和KEGG通路富集分析

GO富集分析中共得到生物學過程(biological process，BP)1891個、分子功能(molecular function，MF)76個、細胞組分(cellular component，CC)31個。根據(jù)校正后P值進行排序，選擇GO富集排名前15的BP條目繪制氣泡圖，見圖4。圖中氣泡大小代表BP條目富集基因數(shù)目的多少，氣泡顏色差異代表靶基因在各BP條目富集程度的高低。富集程度高且富集基因數(shù)目較多的生物學過程主要涉及脂多糖應(yīng)答(response to lipopolysaccharide)，細菌來源的分子反應(yīng)(response to molecule of bacterial origin)，氧化應(yīng)激(response to oxidative stress)和營養(yǎng)水平應(yīng)答(response to nutrient levels)等。此外，KEGG富集分析篩選得到149條(P<0.05)信號通路，主要涉及AGE-RAGE信號通路(AGE-RAGE signaling pathway)、流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化信號通路(Fluid shear stress and atherosclerosis)、IL-17信號通路(IL-17 signaling pathway)和TNF信號通路(TNF signaling pathway)等(表3)。

圖4 “丹參-丹皮”GO富集分析中BP前15個功能Fig.4 TOP 15 function of BP in GO enrichment analysis of SM-CM

表3 KEGG通路富集分析排名前15的通路信息

3.6 丹參-丹皮“成分-靶點-通絡(luò)”網(wǎng)絡(luò)分析

基于KEGG富集分析的前15條通路，反向篩選得到其對應(yīng)的49個腦卒中靶點和56個丹參-丹皮活性成分，制作“成分-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)關(guān)系表，將其導入Cytoscape軟件，構(gòu)建丹參-丹皮治療腦卒中的“成分-靶點-通路”圖(圖5)。其中度值較大的成分為槲皮素、木犀草素、山柰酚、丹參酮IIA、丹皮酚和隱丹參酮等，度值較大的靶點為PTGS2、RELA、TNF和AKT1等，提示這些成分和靶點可能為丹參-丹皮治療腦卒中的關(guān)鍵成分和蛋白，表明丹參-丹皮可通過“多成分-多靶點-多通路”起到抗腦缺血損傷的作用。

圖5 “丹參-丹皮”成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)圖Fig.5 The ingredient-target-pathway network of SM-CM注：圖中紫色梭形節(jié)點為丹參活性成分；紅色梭形節(jié)點為丹皮活性成分；橙色圓形節(jié)點為關(guān)鍵靶蛋白；玫紅色菱形節(jié)點為關(guān)鍵信號通路。Note:Purple fusiform nodes are the active components of SM;The red fusiform nodes are active components of CM;The orange circular nodes are the key target proteins;The rose diamond nodes are the key pathways.

圖6 “丹參-丹皮”核心成分與關(guān)鍵靶點的分子對接示意圖Fig.6 Molecular docking pattern of main ingredients with key targets of SM-CM注：圖6中A-D分別為山奈酚與PTGS2，丹參酮IIA與RELA，隱丹參酮與TNF，木犀草素與AKT1的分子對接圖。Node:A-D in Figure 6 are kaempferol and PTGS2,tanshinone IIA and RELA,cryptotanshinone and TNF,luteolin and AKT1,respectively.

3.7 “丹參-丹皮”關(guān)鍵靶點的分子對接驗證

一般認為配體與受體結(jié)合能越低，結(jié)合的構(gòu)象越穩(wěn)定，≤-4.25 kcal/mol說明兩者有一定的結(jié)合活性，≤-5.0 kcal/mol說明兩者有較好的結(jié)合活性，≤-7.0 kcal/mol說明兩者有強的結(jié)合活性[6]。為驗證本研究網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果的準確性，選取“成分-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)中度值較大的靶點PTGS2、RELA、TNF、AKT1為受體，分別以6個核心成分和4個靶蛋白的原始配體為對象，采用AutoDock Vina進行分子對接驗證。對接結(jié)果如表3所示，丹參-丹皮6個核心成分與關(guān)鍵靶點的結(jié)合能均≤-5 kcal/mol，其中81%的成分與其靶點的結(jié)合能<-7.0 kcal/mol，表明成分與其靶點均具有較強的結(jié)合活性，特別是隱丹參酮和丹參酮IIA與RELA，木犀草素和槲皮素與AKT1比其與原始配體的結(jié)合活性還強。對接結(jié)果也進一步證實了網(wǎng)絡(luò)藥理學分析結(jié)果的可靠性(表4)。最后，我們利用Pymol軟件對核心成分與PTGS2、RELA、TNF和AKT1靶點對接結(jié)合能較高的結(jié)果進行可視化處理，結(jié)果見圖6。

表4 “丹參-丹皮”核心成分與關(guān)鍵靶蛋白的對接結(jié)果

4 討論

腦卒中屬中醫(yī)學“中風”范疇，中醫(yī)認為中風之證有風、火、痰、瘀、虛之別，但瘀阻腦絡(luò)是貫穿中風病始終的病理核心，故常用活血化瘀類中藥治療腦卒中，以消散體內(nèi)瘀血，使新血復生、血脈暢通[7]。丹參、牡丹皮均為臨床常用活血化瘀類藥物，二者配伍具有活血化瘀、通絡(luò)止痛的功效，由其組成的多種方劑在腦血管疾病的治療中取得了較好的療效，但具體藥效物質(zhì)和作用機制仍不清楚。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學和分子對接方法對丹參-丹皮治療腦卒中的藥效物質(zhì)、潛在作用靶點和作用通路進行深入探究。

在“丹參-丹皮”成分-靶點網(wǎng)絡(luò)中，篩選得到了66個候選活性成分，包括44個丹參酮類、13個酚酸類(含4個黃酮類)、3個甾醇類、3個萜類、呋喃香豆素類2個、巴比妥酸類1個，其中靶點較多的成分為丹參酮類(丹參酮IIA、隱丹參酮等)和酚酸類成分(槲皮素、山奈酚、丹皮酚等)，這與文獻報道丹參、丹皮的主要藥效物質(zhì)基礎(chǔ)相一致[8-10]。同時，篩選得到了201個丹參-丹皮成分靶點，其中兩藥的共有靶點77個，涉及多個抗氧化、炎癥、凋亡因子，證實了丹參-丹皮可通過多成分、多靶點發(fā)揮協(xié)同增效作用。

PPI網(wǎng)絡(luò)分析表明，AKT1、TNF、IL6、MAPK8、PTGS2及RELA等炎癥相關(guān)蛋白，均具有較高的度值，處于網(wǎng)絡(luò)的中心位置，可能是丹參-丹皮發(fā)揮抗腦缺血損傷作用的關(guān)鍵靶點。其中，AKT1(絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶)，又稱Protein Kinase B，在控制細胞增殖、存活和凋亡中發(fā)揮至關(guān)重要作用，能被多種上游細胞因子(如血管內(nèi)皮生長因子等)激活，進而對缺血性損傷后的神經(jīng)元發(fā)揮保護作用[11]。TNF(腫瘤壞死因子α)和IL6(白介素6)是兩個非常重要的促炎因子，參與了機體免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)等多種病理過程，其與腦血管疾病的炎癥過程密切相關(guān)，同時也是IL-17和TNF等信號通路的重要信號分子[12]。MAPK8(絲裂原活化蛋白激酶8，又稱JNK1)，屬于MAP激酶和JNK家族成員，激活的JNK信號通路對細胞分化、凋亡、應(yīng)激反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、缺血再灌注損傷等生理病理過程起著至關(guān)重要的調(diào)節(jié)作用[13]。PTGS2(前列素內(nèi)環(huán)氧化物合成酶2)，又稱COX-2，作為重要的炎性介質(zhì)存在于炎癥初期到炎癥形成的全過程，PTGS2的過表達可破壞內(nèi)環(huán)境平衡，參與腦損傷后的炎癥反應(yīng)，并促進腦梗死面積的擴大[14]。RELA(轉(zhuǎn)錄因子p65)是NF-κB的一個亞單位，其翻譯后修飾能夠有效地調(diào)控NF-κB的轉(zhuǎn)錄激活，進而在炎癥反應(yīng)及其相關(guān)疾病的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮重要的作用[15]。

為了進一步說明這些關(guān)鍵作用靶點在基因功能和信號通路中的作用，本研究進行了GO功能和KEGG通路富集分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)丹參-丹皮可能通過參與脂多糖應(yīng)答、炎癥反應(yīng)、抗凋亡及氧化應(yīng)激等生物學過程，在細胞膜、細胞質(zhì)、細胞器部位，發(fā)生蛋白結(jié)合、磷酸化、轉(zhuǎn)錄因子激活等分子反應(yīng)，進而調(diào)控AGE-RAGE信號通路、流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化信號通路、IL-17和TNF信號通路等發(fā)揮抗腦缺血損傷的作用。其中，IL-17和TNF均是重要的促炎癥細胞因子，二者所介導的信號通路與腦卒中后的炎癥反應(yīng)密切相關(guān)[16]。而炎癥反應(yīng)在腦卒中的發(fā)生、發(fā)展以及后期恢復中均扮演著重要的角色，參與腦卒中病理損傷的全過程；同時，PTGS2、RELA、TNF、IL6、AKT1等關(guān)鍵靶點，大部分也顯著富集在TNF信號通路和IL-17信號通路上，充分表明丹參-丹皮具有多靶點、多通路協(xié)同增效作用。

基于成分-靶點-通絡(luò)網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)槲皮素、木犀草素、山柰酚、丹參酮IIA、丹皮酚和隱丹參酮等可能通過PTGS2、RELA、TNF和AKT1等關(guān)鍵靶點發(fā)揮抗腦缺血損傷的作用。研究表明槲皮素、山柰酚可通過抗腦缺血、抗自由基氧化、抑制炎癥反應(yīng)和細胞凋亡等對腦卒中患者起到神經(jīng)保護作用[17,18]。丹參酮IIA和隱丹參酮對缺血再灌注腦損傷也具有保護作用，其機制可能與減輕缺血再灌注損傷炎癥反應(yīng)，減輕氧化性損傷和改善血腦屏障有關(guān)[19,20]。Liao等[21]研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠MCAO模型中，丹皮酚表現(xiàn)出保護缺血腦組織的作用，其機理可能與抗自由基損傷有關(guān)。為了進一步驗證網(wǎng)絡(luò)藥理學結(jié)果的可靠性，我們利用分子對接考察了核心成分和關(guān)鍵靶點的結(jié)合活性。結(jié)果表明篩選的6個核心成分與關(guān)鍵靶點PTGS2、RELA、TNF和AKT1的結(jié)合能均<-5 kcal/mol，表明它們具有較好的結(jié)合活性。其中槲皮素、山奈酚與PTGS2，隱丹參酮、丹參酮IIA與RELA，隱丹參酮與TNF-α，木犀草素、槲皮素與AKT1的結(jié)合能均<-7 kcal/mol，部分核心成分與靶蛋白甚至比其與原始配體的結(jié)合活性還強，表明這些成分與其對應(yīng)靶點具有強的結(jié)合活性。

綜上所述，本研究運用網(wǎng)絡(luò)藥理學和分子對接技術(shù)揭示了丹參-丹皮抗腦缺血損傷的藥效物質(zhì)、關(guān)鍵靶點及作用通路，并通過分子對接技術(shù)對篩選出的關(guān)鍵靶點進行了驗證。發(fā)現(xiàn)丹參-丹皮可能通過槲皮素、木犀草素、山柰酚、丹參酮IIA、丹皮酚和隱丹參酮等活性成分，作用于PTGS2、RELA、TNF、IL6、AKT1等關(guān)鍵靶點，調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、凋亡及氧化應(yīng)激等生物學過程，進而調(diào)控IL-17和TNF等信號通路發(fā)揮抗腦缺血損傷的作用。研究結(jié)果不僅可為下一步研究丹參-丹皮藥對抗腦缺血損傷的作用機制提供依據(jù)，也可為該藥對及其組成方劑的臨床應(yīng)用與開發(fā)提供技術(shù)支撐。