王夢(mèng)杰，李玉林，劉嘉華，張龍飛，阿孝蓉，周佳俊，吳 華*，柴沙駝

1青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院；2中國(guó)科學(xué)院西北高原生物研究所；3青海大學(xué)畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，西寧 810000

肝臟是人體內(nèi)最主要的代謝器官之一，具有合成分泌型蛋白質(zhì)、去氧化和儲(chǔ)存肝糖等功能。肝癌是全球第六大常見癌癥。與其他實(shí)體癌相比，過去十多年來，世界范圍內(nèi)肝癌的發(fā)病率和死亡率都呈現(xiàn)增長(zhǎng)趨勢(shì)[1]。在各類癌癥的發(fā)病率和死亡率中，肝癌的發(fā)病率和死亡率均位于前十位(發(fā)展中國(guó)家中發(fā)病率85%，居不同癌種第一)，中國(guó)作為最大的發(fā)展中國(guó)家，肝癌發(fā)病總數(shù)占全球肝癌病人總數(shù)的50%[2]，肝癌已經(jīng)成為國(guó)民健康的主要威脅者之一。在多種導(dǎo)致肝癌的因素中，人類飲食習(xí)慣和生活習(xí)慣的失調(diào)是重要原因之一。在人們崇尚綠色天然生活觀念的影響下，利用天然食品中的抑癌因子來有效預(yù)防和干預(yù)癌癥的發(fā)生發(fā)展已獲得人們的重點(diǎn)關(guān)注。

黑果枸杞(LyciumruthenicumMurray)是茄科枸杞屬植物，漿果呈現(xiàn)為球形，果實(shí)成熟后顏色呈紫黑色，果實(shí)無毒且具有甜味，是一種尚待開發(fā)的野生植物資源[3]。黑果枸杞主要分布于我國(guó)西北地區(qū)，因其富含花青素而被譽(yù)為“沙漠黑珍珠”和“花青素之王”[4]。花青素(anthocyanidin，又稱花色素)，屬類黃酮化合物，具有抗腫瘤、抗炎、降血糖血脂、護(hù)肝以及很強(qiáng)的抗氧化能力等多種生理功能[4-6]。在食品開發(fā)和醫(yī)學(xué)研究方面具有較高的研究?jī)r(jià)值?；诨ㄇ嗨氐纳砘钚院捅＝∽饔?，黑果枸杞儼然已經(jīng)成為青海省的特色經(jīng)濟(jì)植物，并在醫(yī)療保健領(lǐng)域獲得了廣泛關(guān)注。然而，目前對(duì)黑果枸杞花青素的研究還停留在黃酮、多糖等成分的抗氧化活性上，尚未見黑果枸杞花青素對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞自噬作用影響機(jī)制的相關(guān)報(bào)道?；诖?，本試驗(yàn)主要針對(duì)黑果枸杞花青素對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞免疫活性的影響展開相關(guān)研究，為青藏高原黑果枸杞的深度開發(fā)利用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)材料

細(xì)胞系：人肝癌細(xì)HepG2細(xì)胞由中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)提供。

黑果枸杞花青素：購(gòu)自青海金麥杞生物科技有限公司(花青素：64.4%；灰分：0.6%；蛋白質(zhì)：6%；糖類：1.32%；氨基酸：3.56%)。

1.1.2 主要試劑配制

PBS：將PBS干粉倒入容量瓶，向容量瓶中加入1 L超純水，并用超純水反復(fù)沖洗粘在袋壁上的粉末并移至容量瓶，充分?jǐn)嚢柚罰BS干粉完全溶解后將其定容至2 L，調(diào)節(jié)PBS溶液的酸堿度為7.2～7.4。而后將PBS溶液轉(zhuǎn)移至玻璃容器中進(jìn)行高壓蒸汽滅菌，待溶液冷卻至室溫后，用封口膜密封并放至4 ℃冰箱低溫保存待用。

DMEM培養(yǎng)基：將DMEM粉末溶于超純水和FBS，用超純水定容至1 L，控制FBS的終濃度為10%。加入適量的碳酸氫鈉，調(diào)節(jié)pH值為7.2～7.4，濾菌后用封口膜密封并放至4 ℃冰箱低溫保存。

花青素溶液：稱取2 mg花青素溶于10 mL DMEM培養(yǎng)基中，配制得到花青素濃度為200 μg/mL的溶液，濾菌后用封口膜密封并避光低溫條件下保存。

3-MA(3-methyladenine)自噬抑制劑配制：精確稱量20 mg 3-MA，加入3.36 mL PBS緩沖液配制成濃度為20 mM的溶液，濾菌后用封口膜密封置于-20 ℃冰箱保存。

1.1.3 試劑與設(shè)備

DEPC(西安赫特)；DMEM、胰酶、雙抗(Gibco公司)；DMSO(山東德彥化工有限公司)；EDTA(Solarbio公司)；FBS、PBS、Promega反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green I熒光染料、SDS、無水乙醇、氯仿、異丙醇(西寧寶信生物科技有限公司)；EdU試劑盒(廣州瑞博生物科技有限公司)；超純水、Aglient1260高效液相色譜儀(Aglient公司)；X500R ESI-Q-TOF質(zhì)譜儀(SCIEX公司)；乙腈、色譜純、凈化工作臺(tái)(江蘇通凈凈化設(shè)備有限公司)；CO2恒溫培養(yǎng)箱(美國(guó)NUAIRE公司)；水平離心機(jī)(英國(guó)Dynamica公司)；酶標(biāo)儀(無錫華衛(wèi)德朗儀器有限公司)；熒光顯微鏡(日本O-lympus公司)；熒光定量PCR儀器、蛋白印記檢測(cè)系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司)；Western blot轉(zhuǎn)膜儀、電泳儀、電源(購(gòu)自北京六一生物科技公司)；搖床(美國(guó)Scilogex公司)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 黑果枸杞花青素提取物液質(zhì)分析條件

色譜條件：Phenomenex Luna-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相A(1 000 mL超純水，0.1%甲酸)，流動(dòng)相B(乙腈)。梯度梯度洗脫程序(0～10 min，流動(dòng)相B：15%；10～30 min，流動(dòng)相B：15%→40%，流速1.0 mL/min；柱溫25 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm)。

質(zhì)譜條件：采用TurbolonSpray離子源，氣簾氣30 psi，離子源載氣150 psi，離子源載氣260 psi，離子源溫度550 ℃；IDA正離子模式，噴霧電壓5 500 V；CAD載氣7 psi，一級(jí)TOF-MS質(zhì)量掃描范圍50～1 500 Da，誘導(dǎo)碰撞電壓10 V；二級(jí)TOF-MS質(zhì)量掃描范圍50～1 500 Da，誘導(dǎo)碰撞電壓45 V。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)

1.2.2.1 細(xì)胞的常規(guī)培養(yǎng)

人肝癌HepG2細(xì)胞培養(yǎng)24 h，棄去舊的培養(yǎng)基，加入5 mL新的DMEM培養(yǎng)液十字混勻后放入5% CO2，37 ℃的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.2.2 細(xì)胞計(jì)數(shù)

向血球計(jì)數(shù)板中滴加10 μL預(yù)先混好的人肝癌HepG2細(xì)胞懸液，在培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)3 min后在顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)，根據(jù)觀察得到的細(xì)胞數(shù)統(tǒng)計(jì)計(jì)數(shù)板中四大格細(xì)胞的總數(shù)為A，計(jì)算細(xì)胞數(shù)：實(shí)際細(xì)胞數(shù)=A/4×10×1 000×稀釋倍數(shù)。

1.2.3 CCK-8法檢測(cè)黑枸杞花青素對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞活率的影響

將人肝癌HepG2細(xì)胞以1×106個(gè)/mL的密度接種于96孔板中(每孔100 μL)，細(xì)胞培養(yǎng)貼壁24 h后用黑果枸杞花青素誘導(dǎo)細(xì)胞，控制黑果枸杞花青素的終濃分別為0、12.5、25、50、100 μg/mL，并分別作用于人肝癌HepG2細(xì)胞12、24、36、48 h。在各時(shí)間點(diǎn)前的3 h，每孔加10 μL CCK-8溶液，繼續(xù)孵育3 h，用酶標(biāo)儀測(cè)定其450 nm處的OD值，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)。計(jì)算公式：細(xì)胞活力=(OD實(shí)驗(yàn)組-OD對(duì)照組)/(OD對(duì)照組-OD空白組)×100%。

1.2.4 EdU熒光標(biāo)記法檢測(cè)黑枸杞花青素對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞增殖的影響

將人肝癌HepG2細(xì)胞以1×106個(gè)/mL的密度接種于96孔板中(每孔100 μL)，細(xì)胞培養(yǎng)24 h。設(shè)花青素刺激組濃度分別為0 μg/mL和25 μg/mL。0 μg/mL組中加入DMEM培養(yǎng)基正常培養(yǎng)人肝癌HepG2細(xì)胞；黑果枸杞花青素刺激組中加DMEM培養(yǎng)基并用控制終濃度為25 μg/mL的花青素誘導(dǎo)人肝癌HepG2細(xì)胞。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，每孔終體積為300 μL，培養(yǎng)24 h。

首先制備出適量的濃度為50 μM的EdU培養(yǎng)基；每孔中均加入100 μL EdU培養(yǎng)基，在培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)2 h后棄去培養(yǎng)基。用PBS清洗未貼壁的細(xì)胞；每孔加50 μL細(xì)胞固定液，恒溫培養(yǎng)30 min后棄去固定液；加50 μL 2 mg/mL甘氨酸，脫色搖床溫育5 min后棄去甘氨酸溶液；加入100 μL PBS，脫色搖床溫育5 min后PBS清洗5 min；最后加入100 μL的滲透劑，溫育10 min后用PBS清洗5 min。加100 μL Apollo染液，避光室溫孵育30 min后棄去染液；加100 μL滲透劑，脫色搖床清洗2次，每次10 min，而后倒掉滲透劑；加100 μL甲醇，清洗2次，每次5 min，再用PBS清洗5 min。加100 μL的DAPI反應(yīng)液，在避光、室溫條件下孵育30 min后倒掉染色液；加100 μL PBS清洗細(xì)胞；觀察人肝癌HepG2細(xì)胞的染色情況。

1.2.5 細(xì)胞劃痕試驗(yàn)測(cè)定測(cè)黑果枸杞花青素對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞遷移的影響

每隔0.5 cm在6孔板背后劃一道橫線，每孔接種1×106個(gè)細(xì)胞并且至少穿過5條線。培養(yǎng)24 h后用槍頭沿著橫線在細(xì)胞層上進(jìn)行劃痕。用PBS清洗細(xì)胞3次，洗去未貼壁和劃線是脫落的細(xì)胞?？刂坪诠坭交ㄇ嗨卮碳そM加入終濃度分別為0、25 μg/mL，培養(yǎng)24 h后在顯微鏡下觀察細(xì)胞。

1.2.6 Western blot檢測(cè)增殖和自噬相關(guān)基因的蛋白表達(dá)

細(xì)胞分組設(shè)為對(duì)照組(0 μg/mL)、花青素組(25 μg/mL)、3-MA(5mM)組和花青素(25 μg/mL)+ 3-MA(5 mM)組。細(xì)胞5% CO2，37 ℃培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞。

用蛋白裂解液提取細(xì)胞總蛋白；BCA法測(cè)定蛋白濃度，調(diào)整蛋白濃度，加入適量2×SDS上樣緩沖液，煮沸5 min，-20 ℃保存?zhèn)溆?。配?2% SDS-PAGE分離膠和5% SDS-PAGE濃縮膠，100 V，電泳2 h。根據(jù)蛋白Marker，4 ℃，200 mA轉(zhuǎn)移2～2.5 h，將目的條帶轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用5%脫脂牛奶室溫封閉2 h或4 ℃過夜。TBST 溶液漂洗膜3次，8 min/次，一抗孵育2 h。TBST溶液漂洗膜3次，8 min/次，二抗孵育1 h。最后用Bio-Rad Chemi Doc XRS+曝光系統(tǒng)檢測(cè)目的蛋白。

1.2.7 RT-PCR檢測(cè)Hippo通路和自噬相關(guān)基因表達(dá)

細(xì)胞分組設(shè)為對(duì)照組(0 μg/mL)和花青素(25 μg/mL)組，細(xì)胞培養(yǎng)24 h后分別用TRIZOL法和紫外線分光光度計(jì)提取總RNA和測(cè)定RNA濃度。每組各取1 500 ng總RNA，按照Promega試劑盒的說明書mRNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄為cDNA。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系為20 μL，5×Prime Script Buffer 2(for Real Time)4 μL，Total RNA 2 μL，RNase Free ddH2O 14 μL，將體系置于PCR儀中42 ℃ 15 min；95 ℃ 3 min后獲得cDNA轉(zhuǎn)至-20 ℃長(zhǎng)期保存。采用SYBRGreenl法以cDNA為模板對(duì)PCR進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)，反應(yīng)體系為20 μL，SYBR Premix Ex Taqll 10 μL，PCR Forward Primer 0.8 μL，PCR Reverse Primer 0.8 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 6.4 μL，95 ℃預(yù)變性15 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s(40次循環(huán))。試驗(yàn)每組均重復(fù)3次，根據(jù)公式2-ΔΔCt計(jì)算所測(cè)基因的相對(duì)表達(dá)量。

使用上海生物工程有限公司設(shè)計(jì)合成引物如下：

1.3 數(shù)據(jù)分析

每組試驗(yàn)均重復(fù)3次，用SPSS19.0采用單因素方差分析和多重比較對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑果枸杞花青素成分分析

經(jīng)HPLC-Q-TOF-MS分析，從黑果枸杞花青素中確認(rèn)出五種花青素化合物，總含量為64.4%。其中，C49H50O28，矮牽牛素-3-O-蕓香糖(反式對(duì)香豆酸-7-O-葡萄糖苷)-5-O-葡萄糖苷，其分子量為1 095.983，出峰時(shí)間為5.225，含量為4.2%；C43H49O23，矮牽牛素-3-O-蕓香糖(反式對(duì)香豆酸)-5-O-葡萄糖苷，其分子量為933.842，出峰時(shí)間為16.952，含量為2.6%；C44H51O24，矮牽牛素-3-O-蕓香糖(阿魏酰)-5-O-葡萄糖苷，其分子量為963.868，出峰時(shí)間為17.872，含量為47.6%；C43H49O24，矮牽牛素-3-O-蕓香糖(咖啡酰)-5-O-葡萄糖苷，其分子量為949.841，出峰時(shí)間為18.390，含量為6.4%；C44H51O23，錦葵素-3-O-蕓香糖(反式對(duì)香豆酸)-5-O-葡萄糖苷，其分子量為847.864，出峰時(shí)間為18.945，含量為3.6%(見表2)。

續(xù)表2(Continued Tab.2)

2.2 黑果枸杞花青素對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞的增殖和遷移作用的影響

2.2.1 黑果枸杞花青素對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞增殖作用的影響

與0 μg/mL濃度組相比，濃度為12.5、25和50 μg/mL的黑枸杞花青素作用于人肝癌HepG2細(xì)胞12 h后，人肝癌HepG2細(xì)胞的活力均顯著降低(P<0.05)，濃度為25 μg/mL的黑枸杞花青素在作用于人肝癌HepG2細(xì)胞24 h后，人肝癌HepG2細(xì)胞的活力極顯著降低(P<0.01)；此外，濃度為50 μg/mL的黑枸杞花青素刺激人肝癌HepG2細(xì)胞24 h后，人肝癌HepG2細(xì)胞的活力也呈顯著降低趨勢(shì)(P<0.01)。

圖1 黑果枸杞花青素對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞活率的影響Fig.1 The effect of L.ruthenicum anthocyanidin on HepG2 cells viability注：相同字母表示差異不顯著P>0.05，不同字母表示差異顯著，其中小寫字母表示P<0.05，大寫字母表示P<0.01。Note:The same letter indicates no significant difference P > 0.05,but different letters mean significant difference,in which the lower case letter means P < 0.05,and the capital letters means P < 0.01.

圖2 黑果枸杞花青素對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞增殖的影響Fig.2 The effect of L.ruthenicum anthocyanidin on HepG2 cells proliferation

與25 μg/mL濃度組相比，濃度為12.5 μg/mL的黑枸杞花青素作用24 h時(shí)對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞活力的抑制作用極顯著降低(P<0.01)；濃度為50 μg/mL的黑枸杞花青素作用24 h和36 h時(shí)對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞活力的抑制作用均顯著降低(P<0.05)；此外，濃度為100 μg/mL的黑枸杞花青素作用24 h和36 h時(shí)對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞活力的抑制作用極顯著降低(P<0.01)，濃度為100 μg/mL的黑枸杞花青素作用12 h時(shí)對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞活力的抑制作用也顯著降低(P<0.05)(圖1)。其中，以濃度為25 μg/mL的黑枸杞花青素作用24 h時(shí)對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞活力的抑制作用最為顯著，因此篩選出黑枸杞花青素的最佳作用濃度和最佳作用時(shí)間分別為25 μg/mL，24 h。25 μg/mL黑枸杞花青素刺激人肝癌HepG2細(xì)胞24 h后，EdU熒光染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，活細(xì)胞數(shù)減少(圖2中藍(lán)色熒光)，新增殖的細(xì)胞數(shù)也明顯減少(圖2中紅色熒光)，人肝癌HepG2細(xì)胞的總數(shù)也減少(圖2結(jié)合藍(lán)色和紅色熒光)。

2.2.2 黑果枸杞花青素對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞遷移作用的影響

細(xì)胞劃痕的結(jié)果表示，黑果枸杞花青素處理24 h后，0 μg/mL濃度組細(xì)胞連接緊密，成團(tuán)生長(zhǎng)，又重新鋪滿劃痕區(qū)；25 μg/mL濃度組的細(xì)胞在劃痕區(qū)新增細(xì)胞相對(duì)較少，細(xì)胞的增殖、貼壁和遷移能力被顯著抑制(見圖3)。

圖3 黑果枸杞花青素對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞遷移的影響Fig.3 The effect of L.ruthenicum anthocyanidin on migration in HepG2 cells

2.2.3 黑果枸杞花青素對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞關(guān)鍵增殖因子在mRNA和蛋白水平表達(dá)的影響

與對(duì)照組相比，增殖關(guān)鍵因子LATS1和MOB1在黑果枸杞花青素組細(xì)胞中的mRNA水平的表達(dá)極顯著升高(P<0.01)，LATS2在mRNA水平的表達(dá)顯著升高(P<0.05)，YAP在mRNA水平的表達(dá)顯著降低(P<0.05)(圖4)?；ㄇ嗨亟MCDK4的蛋白表達(dá)極顯著低于對(duì)照組(圖5，P<0.01)。

圖4 黑果枸杞花青素調(diào)控人肝癌HepG2細(xì)胞增殖因子LATS1、LATS2、MOB1和YAP在mRNA水平的表達(dá)Fig.1 L.ruthenicum anthocyanidin regulates the expression of the proliferation factors LATS1,LATS2,MOB1 and YAP at mRNA level in HepG2 cells注：與對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01。Note:Compared with control,*P<0.05,**P<0.01.

圖5 黑果枸杞花青素調(diào)控人肝癌HepG2細(xì)胞CDK4在蛋白水平的表達(dá)Fig.5 L.ruthenicum anthocyanidin regulates the expression of CDK4 at protein level in HepG2 cells注：與對(duì)照組比較，**P<0.01。Note:Compared with control, **P<0.01.

2.3 黑果枸杞花青素對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞自噬作用的影響

與對(duì)照組相比，黑果枸杞花青素組極顯著升高Beclin-1、LC3-Ⅱ和AMPK的mRNA水平表達(dá)(P<0.01，圖6)。與對(duì)照組相比，25 μg/mL花青素可極顯著顯著下調(diào)p-mTOR(P<0.01)，并極顯著上調(diào)LC3-Ⅱ和p-AMPK的蛋白表達(dá)(P<0.01)；3-MA組極顯著上調(diào) p-mTOR (P<0.01)，并極顯著下調(diào)p-AMPK和LC3-Ⅱ的蛋白表達(dá)(P<0.01)；花青素+3-MA組可極顯著上調(diào)p-mTOR(P<0.01)，并極顯著上調(diào)p-AMPK和LC3-Ⅱ的蛋白表達(dá)(P<0.01)。與花青素組相比，3-MA組可極顯著上調(diào)p-mTOR(P<0.01)，并極顯著下調(diào)LC3-Ⅱ和p-AMPK的蛋白表達(dá)(P<0.01)；花青素+3-MA組可極顯著下調(diào)p-mTOR(P<0.01)，并顯著上調(diào)LC3-Ⅱ 和p-AMPK(P<0.05)的蛋白表達(dá)(見圖7)。

圖6 黑果枸杞花青素對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞自噬因子Beclin-1、LC3-II和AMPK在mRNA水平表達(dá)的影響Fig.6 The effect of L.ruthenicum anthocyanidin on autophagy factors Beclin-1,LC3-II and AMPK expression at mRNA level in HepG2 cells注：與對(duì)照組比較，**P<0.01。Note:Compared with control,**P<0.01.

圖7 黑果枸杞花青素和3-MA對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞自噬相關(guān)因子p-mTOR、LC3-II和p-AMPK在蛋白水平表達(dá)的影響Fig.7 The effect of L.ruthenicum anthocyanidin and 3-MA on protein expression level of autophagy factors p-mTOR,LC3-II and p-AMPK in HepG2 cells注：a為對(duì)照組(0 μg/mL)；b為花青素組(25 μg/mL)；c為3-MA組(5 mM)；d為花青素(25 μg/mL)+3-MA組(5 mM)。A.p-mTOR、LC3-II和p-AMPK Western blot電泳圖；B.p-mTOR蛋白相對(duì)表達(dá)量；C.LC3-II 蛋白相對(duì)表達(dá)量；D.p-AMPK蛋白相對(duì)表達(dá)量。與對(duì)照組(0 μg/mL)相比，*P<0.05，**P<0.01；與花青素組(25 μg/mL)相比，# P<0.05，##P<0.01。Note:a indicates the control group (0 μg/mL);b indicates the group induced with L.ruthenicum anthocyanidin (25 μg/mL);c indicates the group induced with 3-MA (5 mM);d indicates the group induced with L.ruthenicum anthocyanidin (25 μg/mL)+3-MA (5 mM).A.p-mTOR,LC3-II and p-AMPK Western blot figure;B.Relative expression of p-mTOR;C.Relative expression of LC3-II;D.Relative expression of p-AMPK.Compared with control,*P<0.05,**P<0.01;Compared with L.ruthenicum anthocyanidin group (25 μg/mL),#P<0.05,##P<0.01.

3 討論

3.1 黑果枸杞花青素成分分析

常見的花青素主要有6種，分別為天竺葵色素、矢車菊色素、飛燕草色素、芍藥色素、矮牽牛色素和錦葵色素[7]。而花青素在自然界中主要以糖苷化和?；男问酱嬖?，以不同的結(jié)合方式形成了不同種類的花色苷，因此，通過分析花色苷來確定花青素成分是一種有效的分析方法[8]。目前，采用花青素含量的測(cè)定較為普遍的方法為高效液相色譜法以及紫外分光光度計(jì)法[7,8]。本試驗(yàn)利用HPLC-ESIQ-TOF法，流動(dòng)相采用水相(0.5%甲酸)和乙腈相梯度洗脫可獲得較好的分離效果和質(zhì)譜響應(yīng)峰值。根據(jù)高分辨質(zhì)譜對(duì)分子量和同位素峰型匹配的精確性，可以確定物質(zhì)的分子式，再結(jié)合二級(jí)質(zhì)譜碎片信息和黑果枸杞化學(xué)成分的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，從黑果枸杞花青素的提取物中確認(rèn)出5種衍生自矮牽牛色素和錦葵色素的花色苷，分別為矮牽牛素-3-O-蕓香糖(反式對(duì)香豆酸-7-O-葡萄糖苷)-5-O-葡萄糖苷、矮牽牛素-3-O-蕓香糖(反式對(duì)香豆酸)-5-O-葡萄糖苷、矮牽牛素-3-O-蕓香糖(阿魏酰)-5-O-葡萄糖苷、矮牽牛素-3-O-蕓香糖(咖啡酰)-5-O-葡萄糖苷和錦葵素-3-O-蕓香糖(反式對(duì)香豆酸)-5-O-葡萄糖苷，且其總含量為64.4%，說明HPLC-ESIQ-TOF分析實(shí)現(xiàn)了復(fù)雜中藥成分快速分離分析，為黑果枸杞微量成分分析提供了一種有效分析方法，其他化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)則還需進(jìn)一步研究。

3.2 黑果枸杞花青素對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞增殖作用的影響

花青素具有抗腫瘤的生物特性，可抑制癌細(xì)胞的體外增殖、遷移和侵襲[9,10]。研究發(fā)現(xiàn)，從多種植物中提取的花青素在一定的時(shí)間和劑量范圍內(nèi)均可抑制人肝癌HepG2細(xì)胞的增殖[11,12]。本試驗(yàn)CCK-8結(jié)果顯示，濃度為25 μg/mL的黑果枸杞花青素作用于人肝癌HepG2細(xì)胞12、24和36 h時(shí)均可有效抑制人肝癌HepG2細(xì)胞的活力；濃度為50 μg/mL的黑枸杞花青素刺激人肝癌HepG2細(xì)胞24 h后，人肝癌HepG2細(xì)胞的活力也顯著降低；黑枸杞花青素作用24 h和36 h時(shí)，25 μg/mL黑果枸杞花青素較其他濃度組對(duì)人肝癌細(xì)胞的抑制作用更佳，其中，黑枸杞花青素作用24 h時(shí)，25 μg/mL黑果枸杞花青素對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞的抑制作用最為顯著，因此篩選出黑枸杞花青素最佳作用濃度和最佳作用時(shí)間分別為25 μg/mL和24 h。此外，EdU和細(xì)胞劃痕結(jié)果顯示，25 μg/mL黑果枸杞花青素誘導(dǎo)24 h后，可有效抑制人肝癌HepG2細(xì)胞增殖和遷移。

MOB1蛋白大型抑癌基因1/2(LATS1/2)激酶的關(guān)鍵調(diào)控因子，哺乳動(dòng)物MST1-MOB 1復(fù)合物已被證明能抑制Yes相關(guān)蛋白(Yes-associated protein，YAP)的致癌活性，并參與多種腫瘤的發(fā)生[13]。YAP表達(dá)失調(diào)在人類癌癥中較為常見，YAP活性的降低可有效抑制癌細(xì)胞增殖和肝的過度生長(zhǎng)[14]。LATS是公認(rèn)的抑癌基因，在抑制癌細(xì)胞增殖的過程中可參與多條信號(hào)通路[15]。有研究表明，LATS缺失會(huì)引起惡性外周神經(jīng)鞘膜瘤細(xì)胞的過度增殖[16]。LATS基因表達(dá)上調(diào)除可以抑制細(xì)胞的增殖外，還可有效抑制細(xì)胞的遷移[17]。研究發(fā)現(xiàn)哺乳動(dòng)物L(fēng)ATS1和LATS2通過負(fù)調(diào)控不同的細(xì)胞周期檢查點(diǎn)來控制細(xì)胞的增殖，LATS2異位表達(dá)可使細(xì)胞停滯在G1/S期[18]，而細(xì)胞在G1-S期的轉(zhuǎn)換主要由周期蛋白依賴性激酶4(CDK4)進(jìn)行調(diào)控[19]。本研究結(jié)果顯示，用25 μg/mL的黑果枸杞花青素誘導(dǎo)人肝癌HepG2細(xì)胞24 h，增殖關(guān)鍵因子LATS1、LATS2和MOB1的mRNA表達(dá)被顯著上調(diào)，YAP的mRNA表達(dá)和CDK4的蛋白表達(dá)均被顯著下調(diào)。說明黑果枸杞花青素可通過抑制CDK4的表達(dá)使人肝癌HepG2細(xì)胞周期停滯在G1/S期并通過上調(diào)LATS1、LATS2、MOB1和下調(diào)YAP的mRNA表達(dá)來抑制人肝癌HepG2細(xì)胞的增殖。

3.3 黑果枸杞花青素對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞自噬作用的影響

近年來，細(xì)胞自噬在治療人類疾病方面的作用逐漸引起重視。當(dāng)自噬發(fā)生時(shí)，Beclin-1被激活，進(jìn)而活化LC3基因(包括LC3-I和LC3-II兩種亞型)中的LC3-I，而后LC3-I被修飾成LC3-II并通過融合蛋白轉(zhuǎn)位至自噬體膜，從而促進(jìn)自噬體的成熟[20]。已有研究證實(shí)LC3-II的含量與自噬泡數(shù)量成正比，因此自噬程度與LC3-II 的表達(dá)水平呈正相關(guān)[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，濃度為25 μg/mL 的黑果枸杞花青素人肝癌HepG2細(xì)胞24 h后可有效上調(diào)Beclin-1在mRNA水平的表達(dá)，并有效上調(diào)LC3-II在mRNA和蛋白水平的表達(dá)，說明黑果枸杞花青素可通過上調(diào)Beclin-1和LC3-II的表達(dá)進(jìn)而誘導(dǎo)人肝癌HepG2細(xì)胞自噬。

研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞自噬對(duì)肝癌的抑制作用可受到許多信號(hào)通路的調(diào)控，其中AMPK信號(hào)通路在激活細(xì)胞自噬的過程中起著重要作用[22]。Huang等[23]發(fā)現(xiàn)，增強(qiáng)肝癌細(xì)胞中的酮分解水平可有效抑制AMPK信號(hào)通路來抑制肝癌細(xì)胞發(fā)生過度自噬，從而促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖。本研究發(fā)現(xiàn)，濃度為25 μg/mL的黑果枸杞花青素作用24 h可明顯上調(diào)AMPK的mRNA表達(dá)和p-AMPK的蛋白表達(dá)，說明黑果枸杞花青素可能通過激活A(yù)MPK信號(hào)通路來誘導(dǎo)人肝癌HepG2細(xì)胞發(fā)生自噬進(jìn)而抑制肝癌細(xì)胞的增殖，與Huang等研究結(jié)果一致。此外，mTOR信號(hào)通路在細(xì)胞自噬的過程中也扮演著重要的角色。Wang[24]和Jia等[25]發(fā)現(xiàn)，硫化氫和組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶P300/CBP相關(guān)因子(P300/CBP-associa-ted factor，PCAF)均可通過抑制mTOR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生自噬，進(jìn)而抑制人肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞的增殖與遷移。本研究發(fā)現(xiàn)，濃度為25 μg/mL的黑果枸杞花青素作用24 h可有效下調(diào)p-mTOR的蛋白表達(dá)，說明黑果枸杞花青素可能通過抑制mTOR信號(hào)通路來促進(jìn)人肝癌HepG2細(xì)胞發(fā)生自噬進(jìn)而抑制人肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞的增殖與遷移，與Wang和Jia等研究結(jié)果一致。

4 結(jié)論

綜上所述，通過HPLC-ESIQ-TOF分析從黑果枸杞花青素提取物中確認(rèn)出5種花色苷，實(shí)現(xiàn)了復(fù)雜中藥成分快速分離分析，為黑果枸杞微量成分分析提供了一種有效分析方法。此外，結(jié)果發(fā)現(xiàn)25 μg/mL黑果枸杞花青素誘導(dǎo)24 h時(shí)可有效抑制人肝癌HepG2細(xì)胞的增殖和遷移，促進(jìn)人肝癌HepG2細(xì)胞自噬，為黑果枸杞花青素的深度開發(fā)奠定了一定的理論基礎(chǔ)。