蘇麗燕·賽力木江，依木然·馬瑞士，叢媛媛，阿依江·哈拜克，帕麗達(dá)·阿不力孜

新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，烏魯木齊 830011

阿爾茨海默病(AD)是一種以認(rèn)知功能障礙、記憶和判斷喪失、推理和情緒穩(wěn)定性中斷等癥狀作為主要表現(xiàn)的慢性進(jìn)展性中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病[1]。目前AD發(fā)病機(jī)制尚不明確，一般認(rèn)為AD是一種多病因疾病，其發(fā)病受年齡、環(huán)境、免疫因素、神經(jīng)突觸功能等因素的影響[2]。Aβ沉積導(dǎo)致老年斑的形成是AD的主要病理標(biāo)志物之一。過量的活性氧(ROS)主要來源于功能紊亂的線粒體(線粒體復(fù)合物IV)，引起核酸、脂質(zhì)和蛋白等物質(zhì)的過氧化損傷[3,4]損傷正常生理機(jī)能，因此，ROS的過量產(chǎn)生被看作神經(jīng)退行性疾病病理過程的推動(dòng)者之一。

NF-E2相關(guān)因子2(Nrf2)是細(xì)胞氧化后應(yīng)激反應(yīng)中的關(guān)鍵因子，Nrf2轉(zhuǎn)錄因子普遍存在于各種器官和組織中[5]，在穩(wěn)態(tài)條件下，Nrf2轉(zhuǎn)錄受其負(fù)調(diào)節(jié)物Keapl的抑制。當(dāng)機(jī)體暴露于ROS時(shí)，Nrf2從胞質(zhì)Keapl游離出來并轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中，結(jié)合編碼抗氧化酶的基因的啟動(dòng)子區(qū)域中的ARE，從而誘導(dǎo)內(nèi)源性抗氧化酶如NOQl、HO-1、GSH等的產(chǎn)生[6]。由于Nrf2/ARE通路的激活可以增強(qiáng)緩沖自由基生成的能力，因此它為治療神經(jīng)退行性疾病(nurodegenerative diseases，NDD)提供了有價(jià)值的治療靶點(diǎn)[7,8]。

阿里紅(FomesofficinalisAmes)為多孔菌科藥用層孔菌的干燥子實(shí)體，是新疆地區(qū)的道地藥材[11]，相關(guān)研究報(bào)道阿里紅多糖具有清除氧自由基、抗衰老、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、平喘祛痰等生物活性作用[12]。本課題組前期研究結(jié)果證明，阿里紅多糖對Aβ神經(jīng)元損傷具有一定的保護(hù)作用[13,14]，提示阿里紅多糖在神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值，本研究從氧化損傷通路入手，通過雙側(cè)腦室注射Aβ建立大鼠AD模型，通過測定Nrf2、Keap1、HO-1、NQO1的mRNA轉(zhuǎn)錄水平及蛋白表達(dá)水平，探討阿里紅多糖對Nrf2/ARE信號通路的調(diào)控，了解其抗氧化機(jī)制。

1 材料

1.1 動(dòng)物

3月齡80只健康雄性SD大鼠，體重250±50 g，由新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供，質(zhì)量合格證編號：(SCXK(新)2019-0008)，實(shí)驗(yàn)對象在SPF級實(shí)驗(yàn)室正常飼養(yǎng)，保持充足的光照和通風(fēng)，籠飼養(yǎng)(3～4只/籠)自由飲水和進(jìn)食。

1.2 藥物及試劑

阿里紅粗多糖課題組自制[12]。鹽酸多奈哌齊片[衛(wèi)材(中國)藥業(yè)有限公司，批號1707094]；Aβ1-42(大連美侖生物技術(shù)有限公司，批號MB3894)；熒光定量試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本TaKaRa公司，批號分別為RR047A、RR820A)；Total RNA提取試劑盒(上海玉博生物科技有限公司，批號229009)；賽默飛PageRuler預(yù)染蛋白marker(美國賽默飛世爾科技公司，批號26619)；BCA蛋白濃度測定試劑盒、高效RIPA組織/細(xì)胞裂解液、4×蛋白上樣緩沖液、抗體稀釋液、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、10×TBST緩沖液(北京索萊寶科技有限公司，批號分別為PC0020、R0010、P1016、A1800、P1200-1/P1200-2、D1060)；兔抗大鼠多克隆抗體Nrf2、兔抗大鼠單克隆抗體[EPR3309]NQO1(美國Abcam公司，批號分別為Ab929464、Ab80588)；兔抗大鼠多克隆抗體keap1(D6B12)、兔抗大鼠多克隆抗體HO-1(E3F4S)(美國Cell Signaling公司，批號分別為8047、43966)；β-actin(Affinity Biosciences，批號AF7018)；Goat anti rabbit IgG-HRP標(biāo)記二抗(北京博奧森生物技術(shù)有限公司，批號bs-0295G-HRP)；三羥甲基氨基甲烷(Tris)、十二烷基硫酸鈉(SDS)、甘氨酸(Glycine)、脫脂奶粉(德國Biofroxx公司，批號分別為 1115GR500、3250GR500、1275GR500、1172GR100)。

1.3 儀器

腦立體定位儀(TSE Systems JAPAN)；Morris水迷宮視頻跟蹤分析系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司)；全波長酶標(biāo)儀、實(shí)時(shí)熒光定量 PCR儀、核酸蛋白定量儀(美國賽默飛世爾科技公司)；化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)(美國ProteinSimple公司)。

2 方法

2.1 動(dòng)物模型的建立及干預(yù)

實(shí)驗(yàn)前先將所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行第一次行為學(xué)測試，剔除先天愚鈍的大鼠，選取72只作為實(shí)驗(yàn)用。無菌條件下，將1 mg Aβ1-42溶于50%的DMSO中，再用無菌生理鹽水將其溶解稀釋成2 μg/μL，37 ℃恒溫箱孵育7天，使其變?yōu)榫奂瘧B(tài)的Aβ1-42。1%戊巴比妥鈉(45 mg/kg)腹腔麻醉后，固定大鼠立體定位，使用微量注射器緩慢注射凝聚態(tài)Aβ1-42各5 μL于雙側(cè)海馬內(nèi)以誘導(dǎo)AD模型。根據(jù)大鼠腦立體定位圖定位注射部位，前囟后3 mm，矢狀縫左右旁開2.5 mm，硬膜下3 mm。注射完畢后縫合皮膚，肌肉注射8萬單位青霉素防感染。72只健康雄性SD大鼠稱體質(zhì)量并按隨機(jī)原則分為空白組、模型組、鹽酸多奈哌齊組(0.5 mg/kg)，阿里紅多糖高、中、低劑量組(100、50、25 mg/kg)，每組12只。各組大鼠Aβ1-42注射三天后進(jìn)行灌胃給藥(1.0 mL/100g)，每日一次，連續(xù)30天。正常對照組和模型組大鼠給予蒸餾水灌胃；陽性對照組給予鹽酸多奈哌齊溶液進(jìn)行灌胃；阿里紅高，中，低劑量組使用不同濃度阿里紅灌胃治療。由于腦部手術(shù)對動(dòng)物健康損害較大，造模和恢復(fù)期各組均有少數(shù)大鼠死亡。因此為了更好的運(yùn)用統(tǒng)計(jì)方法分析資料最后每組取9只大鼠進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

2.2 Morris水迷宮行為學(xué)測試

灌胃治療結(jié)束后使用Morris水迷宮測量SD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力。定位航行試驗(yàn)進(jìn)行連續(xù)5天，每天訓(xùn)練2次，圓形水池壁上標(biāo)有東西南北的四個(gè)入水點(diǎn)，它們將水池分為四個(gè)象限(A、B、C、D象限)，每次從固定的C平臺(tái)象限及平臺(tái)對側(cè)象限為入水點(diǎn)將大鼠面向池壁放入水中，然后計(jì)算機(jī)分析處理系統(tǒng)記錄每只大鼠找到安全平臺(tái)所需的時(shí)間(逃避潛伏期)。第六天為空間探索實(shí)驗(yàn)，歷時(shí)1天。移走平臺(tái)后任選一個(gè)入水點(diǎn)將大鼠放入水中，時(shí)間為1 min，由計(jì)算機(jī)分析處理系統(tǒng)記錄大鼠原平臺(tái)所在象限滯留時(shí)間百分比和有效區(qū)域進(jìn)入次數(shù)等數(shù)據(jù)。

2.3 RT-qPCR法檢測各組大鼠海馬和腦皮層中Nrf2、Keap1、HO-1、NQO1 mRNA表達(dá)水平

取-80 ℃保存的大鼠海馬組織及大腦皮質(zhì)層，用trizol試劑盒抽提獲取總RNA。利用逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA。然后利用各目的基因序列設(shè)計(jì)特異性引物，進(jìn)行熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)。引物序列見表1。最后根據(jù)各反應(yīng)孔的ct值，采用2-ΔΔCt法計(jì)算各組mRNA的相對表達(dá)量。

表1 引物序列

2.4 Western blotting法檢測各組大鼠海馬和腦皮質(zhì)層中Nrf2、Keap1、HO-1、NQO1蛋白的表達(dá)水平

將SD大鼠麻醉后快速斷頭，冰上取出大鼠新鮮海馬組織及大腦皮質(zhì)層，-80 ℃凍存。取各組大鼠海馬組織和大腦皮質(zhì)層，剪切成細(xì)小的碎片，按照每200 mg組織加入150～250 μL裂解液的比例加入RIPA組織裂解液。將裂解后的樣品10 000～14 000g在4 ℃ 12 000 rpm條件下，離心10 min，取上清，然后用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。根據(jù)蛋白定量標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各樣本內(nèi)蛋白含量。每組取10 μL進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電(SDS-PAGE)，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，加入含5%脫脂奶粉的TBST緩沖液，室溫?fù)u床封閉1 h。將封閉的PVDF膜浸泡在以抗體稀釋液稀釋的Keap1(1∶1 000)、Nrf2(1∶1 000)、HO-1(1∶1 000)和NQO1(1∶10 000)一抗中，4 ℃孵育過夜，洗滌后浸泡在以TBST(1∶10 000)稀釋的二抗中，室溫孵育1 h。最后將PVDF膜至于凝膠成像儀上加入ECL化學(xué)發(fā)光劑顯色成像并保存。用Image J軟件進(jìn)行灰度分析，以Nrf2、Keap1、HO-1和NQO1與β-actin灰度值的比值表示目的蛋白的相對表達(dá)含量。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 對大鼠行為學(xué)的影響

結(jié)果表明，與空白組比較，模型組大鼠逃避潛伏期顯著增長，原平臺(tái)所在象限滯留時(shí)間百分比和有效區(qū)域進(jìn)入次數(shù)顯著減少(P<0.01)；與模型組比較，鹽酸多奈哌齊組和阿里紅多糖高，中劑量組逃避潛伏期均顯著減短，原平臺(tái)所在象限滯留時(shí)間百分比和有效區(qū)域進(jìn)入次數(shù)顯著增加(P<0.01)，結(jié)果提示阿里紅多糖能夠改善Aβ1-42誘導(dǎo)的AD大鼠模型學(xué)習(xí)記憶能力損。

圖1 各組大鼠第五天定位航行軌跡圖Fig.1 Location trajectory of rats in each group on the fifth day

圖2 各組大鼠第六天空間搜索軌跡圖Fig.2 The spatial search trajectory of rats in each group

表2 FOPS對大鼠定位航行實(shí)驗(yàn)中逃避潛伏期的影響

表3 FOPS對大鼠空間搜索實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響

3.2 對大鼠海馬和腦皮層Nrf2、Keap1、HO-1及NQO1 mRNA表達(dá)量的影響

結(jié)果表明，與空白組比較，模型組Keap1表達(dá)量顯著升高(P<0.01)，而Nrf2、HO-1及NQO1表達(dá)量顯著降低(P<0.01)；與模型組比較，鹽酸多奈哌齊組和FOPS高、中劑量組可降低AD大鼠海馬組織和腦皮質(zhì)層中Keapl基因的mRNA表達(dá)水平(P<0.01)，增加Nrf2基因的激活，從而升高其下游抗氧化反應(yīng)元件HO-1、NQO1基因的mRNA表達(dá)水平(P<0.05，P<0.01)。結(jié)果提示阿里紅多糖可抑制Keap1的表達(dá)量，并提高Nrf2、HO-1及NQO1表達(dá)量。

表4 FOPS對大鼠海馬區(qū)中Nrf2、Keap1、HO-1及NQO1 mRNA表達(dá)的影響

表5 FOPS對大鼠腦皮層中Nrf2、Keap1、HO-1及NQO1 mRNA表達(dá)的影響

3.3 對大鼠海馬和腦皮層Nrf2、Keap1、HO-1及NQO1蛋白表達(dá)量的影響

結(jié)果表明，與空白組比較，模型組Keap1蛋白表達(dá)量顯著升高(P<0.01)，而Nrf2、HO-1及NQO1蛋白表達(dá)量顯著降低(P<0.01)；與模型組比較，鹽酸多奈哌齊組和FOPS高、中劑量組可降低AD大鼠海馬組織和腦皮質(zhì)層中Keapl蛋白的表達(dá)水平(P<0.05，P<0.01)，增加Nrf2蛋白的激活，從而升高其下游抗氧化反應(yīng)元件HO-1、NQO1蛋白的表達(dá)水平(P<0.01)。結(jié)果提示阿里紅多糖可激活Nrf2/ARE抗氧化應(yīng)激通路發(fā)揮抗氧化作用。

表6 FOPS對大鼠海馬組織中Nrf2、Keap1、HO-1及NQO1蛋白表達(dá)的影響

表7 FOPS對大鼠腦皮層中Nrf2、Keap1、HO-1及NQO1蛋白表達(dá)的影響

4 討論與結(jié)論

淀粉樣蛋白前體蛋白(APP)由γ分泌酶和β分泌酶裂解后，成Aβ，大量的Aβ在腦內(nèi)異常沉積形成老年斑是阿爾茨海默病最具特征的病理改變，與大腦認(rèn)知障礙密切相關(guān)并且有實(shí)驗(yàn)表明，在體外培養(yǎng)海馬神經(jīng)元時(shí)，低濃度的Aβ1-42寡聚體可以直接導(dǎo)致神經(jīng)元的損傷，且隨著濃度的升高表現(xiàn)出線性關(guān)系[15]。由此本研究中將Aβ1-42注射入大鼠雙側(cè)海馬以模擬Aβ在腦組織內(nèi)的沉積，建立大鼠AD模型。并在注射前先將Aβ1-42于37 ℃水浴一周使其老化形成聚集態(tài)，從而使其毒性顯著增強(qiáng)。Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)可敏感反映動(dòng)物空間認(rèn)知能力變化，是AD行為學(xué)評價(jià)的常用方法。此研究通過Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠較空白組逃逸潛伏期顯著增加，原平臺(tái)象限滯留時(shí)間百分比和有效區(qū)域進(jìn)入次數(shù)顯著減少，表明AD大鼠模型建立成功；經(jīng)阿里紅多糖高，中劑量組治療后AD大鼠的逃逸潛伏期明顯縮短，原平臺(tái)象限滯留時(shí)間百分比和有效區(qū)域進(jìn)入次數(shù)顯著升高，證實(shí)阿里紅多糖能夠提高AD大鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力。

圖3 大鼠海馬組織(a)和大腦皮質(zhì)層(b)中Nrf2、Keap1、HO-1及NQO1蛋白表達(dá)電泳Fig.3 Nrf2,Keap1,HO-1 and NQO1 protein expression electrophoresis in rat hippocampus(a) and cerebral cortex(b)注：A.空白組；B.模型組；C.鹽酸多奈哌齊組；D.FOPS低劑量組；E.FOPS中劑量組；F.FOPS高劑量組。Note:A.Control group;B.Model group;C.Donepezil group;D.FOPS-L group;E.FOPS-M group F.FOPS-H group.

AD發(fā)病機(jī)制的“Aβ學(xué)說”認(rèn)為Aβ在特定腦區(qū)的聚集、介導(dǎo)氧化應(yīng)激(oxidative stress，OS)損傷，而氧化還原穩(wěn)態(tài)不穩(wěn)定是阿爾茨海默病(AD)和帕金森氏病(PD)的共同標(biāo)志在健康狀態(tài)的機(jī)體中，ROS形成的水平與抗氧化能力平衡；然而，當(dāng)ROS的產(chǎn)生超過了機(jī)體的抗氧化能力，ROS累積，從而引發(fā)OS和細(xì)胞損傷，中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)由于其高耗氧量以及含有豐富的不飽和脂肪酸，極易受到OS的攻擊，因而特別容易受到脂質(zhì)過氧化作用的影響[16]。此外有研究發(fā)現(xiàn)，AD人群大腦中氧化蛋白的水平明顯高于與年齡相配的對照組[17]。

Nrf2被認(rèn)為是調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)眾多抗氧化物表達(dá)的關(guān)鍵性因子，具有維持細(xì)胞氧化一抗氧化平衡、抑制、凋亡、抗炎的多重生物活性；其與抗氧化反應(yīng)序列元件(ARE)共同構(gòu)成Nrf2/ARE信號通路，Nrf2/ARE信號通路的激活可誘導(dǎo)產(chǎn)生一系列內(nèi)源性酶，如血紅素加氧酶(HO-1)、醌氧化還原酶(NQO1)等，這些自由基清除酶能夠參與機(jī)體的抗氧化防御機(jī)制，從而減少氧化應(yīng)激和介導(dǎo)抗氧化的主要途徑[18]。Nrf2的轉(zhuǎn)錄活性受細(xì)胞骨架相關(guān)性抑制蛋白Keap1的調(diào)節(jié)，該調(diào)控蛋白還引導(dǎo)Nrf2通過蛋白酶體進(jìn)行泛素化和降解，從而限制其基本細(xì)胞水平。在基礎(chǔ)條件下，該蛋白作為Nrf2抑制因子，與Nrf2結(jié)合并穩(wěn)定存在于在細(xì)胞漿中，親電子物質(zhì)或者氧化刺激引起Keap1的修飾，使Keap1-Nrf2復(fù)合體解離，從而游離出Nrf2，進(jìn)而激活抗氧化反應(yīng)序列元件下游的Ⅱ相解毒酶基因及產(chǎn)生抗氧化酶的基因轉(zhuǎn)錄，并增加細(xì)胞對氧化應(yīng)激、外源性化學(xué)物質(zhì)及親電子化合物刺激的抗性。許多研究表明，應(yīng)激條件下，Nrf2的激活可以促進(jìn)細(xì)胞存活[19]。

大腦皮質(zhì)層和海馬組織是兩種具有不同結(jié)構(gòu)和功能的腦組織。大腦皮質(zhì)位于大腦的表層，是機(jī)體的最高級神經(jīng)中樞；大腦皮層除了對外部世界感知，還具有語言、學(xué)習(xí)、記憶和思維等方面的高級功能；海馬體位于大腦丘腦和內(nèi)側(cè)顳葉之間，屬于邊緣系統(tǒng)的一部分，主要負(fù)責(zé)長時(shí)記憶的存儲(chǔ)轉(zhuǎn)換和定向等功能。這兩種腦組織是AD病變最為顯著的區(qū)域，表現(xiàn)為老年斑的出現(xiàn)、NFTs的形成和神經(jīng)元的大量丟失等[20]。因此本研究中我們選取了大腦皮質(zhì)層和海馬組織兩種具有不同結(jié)構(gòu)和功能的腦組織進(jìn)行了檢測。

研究結(jié)果表明，模型組大鼠較空白組大鼠海馬區(qū)和腦皮質(zhì)層Nrf2、HO-1及NQO1 mRNA水平及蛋白表達(dá)水平顯著降低，而Keap1 mRNA水平及蛋白表達(dá)水平顯著升高，說明AD模型已經(jīng)存在嚴(yán)重腦組織氧化損傷，同時(shí)經(jīng)阿里紅多糖高，中劑量組治療后AD大鼠海馬組織和大腦皮層中Nrf2、HO-1及NQO1 mRNA水平及蛋白表達(dá)顯著升高，而Keap1 mRNA水平及蛋白表達(dá)顯著減弱，表明阿里紅多糖高、中劑量組通過負(fù)向調(diào)節(jié)Keap1的表達(dá)，促進(jìn)Nrf2的激活，誘導(dǎo)NQO1、HO-1的表達(dá)，通過增強(qiáng)抗氧化酶系活性，發(fā)揮提高機(jī)體抗氧化損傷作用，從而改善AD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力。

綜上所述，阿里紅多糖治療AD的作用機(jī)制可能與激活Nrf2/ARE信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑有關(guān)。但記憶力形成與修復(fù)的過程和機(jī)制極其復(fù)雜，阿里紅多糖改善AD患者記憶力的作用機(jī)制還有待進(jìn)一步深入探討，本研究為其奠定了初步的基礎(chǔ)和參考。