產(chǎn)后逐瘀膠囊治療產(chǎn)后出血的機(jī)制研究

唐連敏，付翠芳，寧 超，郝俊蘭，姚莉蕓 (河北省邢臺市第三醫(yī)院產(chǎn)科，邢臺 054000)

產(chǎn)后出血是伴隨產(chǎn)婦生產(chǎn)的常見多發(fā)現(xiàn)象，多指分娩后24 h內(nèi)出血量>500 mL，病情嚴(yán)重者會因短時(shí)間失血過多誘發(fā)失血性休克癥狀，危及產(chǎn)婦生命[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國每年約有70%的產(chǎn)婦在產(chǎn)后恢復(fù)過程中存在惡露不絕的現(xiàn)象[2]，雖不會危及生命，但長期流血淋漓不盡會導(dǎo)致產(chǎn)褥期縮復(fù)不良，影響產(chǎn)婦的身心健康和正常生活。產(chǎn)后惡露不絕的主要誘因包括宮縮乏力、凝血功能異常和術(shù)后感染等[3]，因此其對應(yīng)治療應(yīng)以促進(jìn)子宮收縮、止血補(bǔ)血和消炎抗炎為主，以加速內(nèi)膜修復(fù)、縮短出血時(shí)間。

本研究利用一系列分子實(shí)驗(yàn)檢測產(chǎn)后逐瘀膠囊對產(chǎn)后出血大鼠模型的血清生化指標(biāo)、組織生理特性以及標(biāo)記基因的表達(dá)變化影響，闡明并探討產(chǎn)后逐瘀膠囊治療產(chǎn)后出血的作用機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供相應(yīng)理論支持。

1 儀器與材料

1.1儀器 RM6240E/EC型多道生理信號采集處理系統(tǒng)(成都儀器廠)；1-14K型小型臺式冷凍離心機(jī)(Sigma公司)；BS200S型電子天平(賽多利斯集團(tuán))；Light Cycler?Nano熒光定量PCR儀(羅氏制藥有限公司)；Biosens SC 950型凝膠成像系統(tǒng)(上海山富科學(xué)儀器有限公司)；NanoDrop 2000超微量分光光度計(jì) (賽默飛世爾科技有限公司)；Glomax 96型微孔板型熒光檢測儀/酶標(biāo)儀(普洛麥格公司)。

1.2試藥 產(chǎn)后逐瘀膠囊(規(guī)格：0.3 g×36粒，江西民濟(jì)藥業(yè)有限公司)；腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-1(IL-1)、白細(xì)胞介素-6 (IL-6)酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(6×)(批號P0015F)和放射免疫沉淀檢測(RIPA)裂解液(批號P0013B)，均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；大鼠免疫球蛋白A(IgA)和大鼠免疫球蛋白G (IgG)酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，均購自武漢基因美生物科技有限公司；SYBR Green I Master (羅氏制藥有限公司,編號04707516001)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(普洛麥格公司，批號A3500)；化學(xué)發(fā)光顯色底物(賽默飛世爾科技有限公司，批號A38554)；RNAiso Plus提取液(Takara生物公司，批號Cat#9108)；磷酸化熱休克蛋白27(P-HSP 27)鼠源抗體(批號sc-81498)和HRP-山羊抗鼠抗體(批號sc-200)，均購自圣克魯斯生物技術(shù)有限公司；血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)鼠源抗體(艾博抗貿(mào)易有限公司，批號ab1316)；洛氏液，自制；異丙醇(上海滬試化工有限公司,批號40064360)；焦碳酸二乙酯處理水(DEPC，北京索萊寶科技有限公司，批號R1600)。

2 方法

2.1實(shí)驗(yàn)動物建模與分組 8～10周齡SPF級SD大鼠，以雌雄2∶1的比例合籠飼養(yǎng)(不包含空白組)，待陰栓出現(xiàn)后將雌鼠每只分籠飼養(yǎng)直至雌鼠生產(chǎn)。將產(chǎn)后大鼠隨機(jī)分為造模組、產(chǎn)后逐瘀膠囊高、中、低劑量組，每組6只。處理組按組別在大鼠產(chǎn)后當(dāng)天開始分別灌胃不同劑量的產(chǎn)后逐瘀膠囊顆粒物(用溫開水沖服)，低、中、高劑量組分別按100，200，400 mg·kg-1灌胃?？瞻捉M和造模組在相同時(shí)間點(diǎn)灌胃等體積溫開水。飼養(yǎng)條件：溫度為20～25 ℃，日溫差不超過3 ℃，光照時(shí)間為12 h，空氣相對濕度保持在40%～70%之間。實(shí)驗(yàn)過程嚴(yán)格遵守實(shí)驗(yàn)室動物使用原則。

2.2樣本采集 灌胃給藥3 d后，觀察到造模組和產(chǎn)后逐瘀膠囊高劑量組的出血情況存在顯著差異，對各組大鼠麻醉后進(jìn)行腹主動脈采血，用于后續(xù)血清生化因子測定，之后采用頸椎脫臼處死大鼠，立即解剖，取大鼠子宮，置于洛氏液中，剝離附著于子宮的結(jié)締組織和脂肪組織，切取中段子宮平滑肌肌條，長約1 cm，寬約0.4 cm，厚約0.2 cm，用于后續(xù)判斷子宮收縮能力。同時(shí)切取若干子宮組織塊，快速置于液氮中以備后續(xù)蛋白提取和RNA提取測定相關(guān)基因表達(dá)變化。

2.3樣本制備和檢測方法 離體子宮平滑肌收縮活力測定方法：將收集的各組子宮平滑肌條一端固定在裝有洛氏液的玻璃浴槽中，一端與張力換能器相連，負(fù)荷設(shè)置為1 g，以每秒1～2個(gè)小氣泡通過氧氣和二氧化碳混合氣體(體積比為95∶5)，待子宮穩(wěn)定收縮后，利用RM6240 E/EC多道生理信號采集處理系統(tǒng)對子宮收縮狀況進(jìn)行記錄。記錄離體子宮平滑肌條的收縮幅度、收縮頻率以及收縮活動力，本試驗(yàn)重復(fù)6次。Elisa法檢測生化指標(biāo)因子：全血取樣后在4 ℃以3 000 r·min-1離心10 min，得到血清后分裝于提前預(yù)冷的離心管中，于-80 ℃保存，后續(xù)按照Elisa試劑盒說明書檢測血清中各種生化指標(biāo)因子以及免疫球蛋白的含量。包括TNF-α、IL-1、IL-6、IgA 和 IgG。RNA的提取以及反轉(zhuǎn)錄：取子宮組織約100 mg放入用液氮預(yù)冷充分的研缽充分研磨成粉末狀后，加入RNAiso Plus 溶液1 mL，混合勻漿至透明后轉(zhuǎn)移至離心管中，室溫靜置5 min，4 ℃離心吸取上清液,加入1/5體積氯仿，劇烈振蕩15 s，乳化后在室溫下靜置5 min，4 ℃離心15 min，吸取上層透明水相至新的離心管中，加入等體積異丙醇，輕柔顛倒混勻，室溫靜置10 min，4 ℃離心得到底部沉淀，用體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇洗滌沉淀，離心后去除上清，室溫晾干至RNA半透明，加入DEPC水溶解。使用超微量分光光度計(jì)測定RNA濃度，按照Promega反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明反轉(zhuǎn)錄得到第一鏈cDNA用于后續(xù)qRT-PCR分析。待調(diào)查的基因包括基質(zhì)金屬蛋白酶7 (MMP7)、基質(zhì)金屬蛋白酶9 (MMP9)、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制物-1 (TIMP-1)、三磷酸鳥苷酶A (RhoA)、三磷酸鳥苷酶激酶Ⅰ (ROCK Ⅰ) 及內(nèi)參基因β-actin[4]。對應(yīng)特異性引物序列如下：MMP7-F：GGTGTGGAGTGCCAGATGTT；MMP7-R：ACCATCCGTCCAGTACTCAT；MMP9-F：CTGGTGCTCCTGGCTCTAG，MMP9-R:GGCAAGTCTTCGGTGTAGC；TIMP-1-F:ACAGCTTTCTGCAACTCGGA，TIMP-1-R：AGCGTCGAATCCTTTGAGCA;RhoA-F：GTTTATGTGCCCACGGTGTT，RhoA-R:ACTATCAGGGCTGTCGATGG；ROCK Ⅰ-F:TGTGAAGCCTGACAACATGC，ROCK Ⅰ-R：CTGACCACCAGTCACACTCT;β-actin-F:TCTTCCAGCCTTCCTTCCTG，β-actin-R：CACACAGAGTACTTGCGATC。蛋白提取和Western-Blot分析：取子宮組織100 mg，置于液氮預(yù)冷研缽中研磨充分后轉(zhuǎn)移至離心管中，加入RIPA裂解液，混合均勻后置于冰上裂解反應(yīng)30 min，4 ℃離心10 min后得到上清液，即為蛋白樣品，使用2，2-聯(lián)喹啉-4，4-二甲酸二鈉(BCA)法定量蛋白，調(diào)整至各組濃度一致后進(jìn)行后續(xù)Western Blot分析。蛋白樣品加入1/5體積SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液，95 ℃加熱5 min后迅速置于冰上，得到變性蛋白樣品，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)后以濕轉(zhuǎn)膜法進(jìn)行轉(zhuǎn)膜(180 mA，90 min)，經(jīng)封閉后，依次孵育一抗(1∶1 000)和二抗(1∶10 000)后進(jìn)行化學(xué)發(fā)光顯影，使用熒光圖像分析儀獲取蛋白印跡結(jié)果，比較各組子宮組織中P-HSP27和VEGF水平。

3 結(jié)果

3.1子宮平滑肌收縮實(shí)驗(yàn) 造模組大鼠經(jīng)歷分娩活動，其子宮平滑肌收縮幅度、頻率以及收縮活動力顯著高于空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；產(chǎn)后逐瘀膠囊低劑量組與造模組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，產(chǎn)后逐瘀膠囊中、高劑量組顯著高于造模組以及低劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 產(chǎn)后逐瘀膠囊對大鼠離體子宮平滑肌的影響

3.2大鼠血清中TNF-α、IL-1、IL-6、IgA和IgG的含量 造模組大鼠血清內(nèi)促炎因子TNF-α、IL-1、IL-6、IgA 和 IgG含量顯著高于空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，尤其是IL-6提升了將近3倍，產(chǎn)后逐瘀膠囊低、中、高劑量組均可顯著降低造模組中大鼠的相應(yīng)蛋白含量，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但降低后仍高于空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 產(chǎn)后逐瘀膠囊對大鼠血清中TNF-α、IL-1、IL-6、IgA 和 IgG含量的影響

3.3大鼠子宮組織中TIMP-1、MMP7、MMP9、RhoA以及ROCK Ⅰ的表達(dá) 造模組大鼠子宮組織中MMP7的表達(dá)水平與空白組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，產(chǎn)后逐瘀膠囊低、中、高劑量組相比于造模組可降低MMP7和MMP9的表達(dá)水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且呈劑量依賴性；造模組大鼠TIMP-1含量顯著低于空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，產(chǎn)后逐瘀膠囊處理組可顯著提升TIMP-1含量，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；造模組大鼠子宮組織中RhoA和ROCK Ⅰ的表達(dá)水平高于空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，低于產(chǎn)后逐瘀膠囊中、高劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與低劑量組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

3.4大鼠子宮組織中VEGF和P-HSP27蛋白表達(dá) 造模組大鼠子宮組織中VEGF和P-HSP27含量均高于空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，P-HSP27低于產(chǎn)后逐瘀膠囊低、中、高劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

表3 產(chǎn)后逐瘀膠囊對大鼠子宮組織TIMP-1、MMP7、MMP9、RhoA和ROCK Ⅰ表達(dá)的影響

表4 產(chǎn)后逐瘀膠囊對大鼠子宮組織VEGF和P-HSP27蛋白含量的影響

4 討論

產(chǎn)婦因生產(chǎn)耗費(fèi)氣力多表現(xiàn)為氣虛血瘀、脈絡(luò)不暢，需益氣扶正、祛邪化瘀[5]。此時(shí)產(chǎn)婦氣虛不固，因此需用平衡之法，否則便有傷正之憂。因此此時(shí)機(jī)體免疫應(yīng)答不宜過強(qiáng)，否則引發(fā)過強(qiáng)炎癥反應(yīng)傷累機(jī)體，但也不宜過弱，否則無法抵抗外界感染。免疫球蛋白是機(jī)體免疫應(yīng)答中的重要組分，其可通過促進(jìn)T淋巴細(xì)胞活化，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬能力和機(jī)體免疫力[6]。本研究發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)后逐瘀膠囊可顯著降低造模組中IgA和IgG含量，同時(shí)又保持高于空白組，降低機(jī)體損傷所引發(fā)的過強(qiáng)的免疫應(yīng)答，同時(shí)又提高免疫力保障機(jī)體穩(wěn)步修復(fù)。

MMP9和MMP7在適度水平下可加快膠原分解過程[7-8]，利于子宮陳舊組織蛻落，但促炎因子會促進(jìn)子宮內(nèi)膜部位基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)的合成異常升高，進(jìn)而破壞MMPs/基質(zhì)金屬蛋白酶抑制物(MMPs/TIMPs)的平衡，造成血管基底膜降解，誘發(fā)血管通透性增加，破壞血管完整性，造成炎性細(xì)胞浸潤，增加潛在的出血可能[9]。子宮內(nèi)膜基質(zhì)降解還會引發(fā)間質(zhì)水腫造成內(nèi)膜表面潰瘍等炎性反應(yīng)，影響子宮內(nèi)膜的修復(fù)，延長出血時(shí)間[10]。本研究發(fā)現(xiàn)造模組相比于空白組中MMPs以及促炎因子TNF-α[11]、IL-1[12]和IL-6[13]顯著上調(diào)，揭示產(chǎn)后恢復(fù)過程引發(fā)了強(qiáng)烈的炎性反應(yīng)，產(chǎn)后逐瘀膠囊高、中、低劑量組相比于造模組中促炎因子顯著下調(diào)，與上文免疫球蛋白含量變化相一致。同時(shí)TIMP-1含量顯著上升，且MMPs也呈現(xiàn)劑量依賴性的下降趨勢，說明產(chǎn)后逐瘀膠囊可以通過降低炎性反應(yīng)改善MMPs/TIMPs平衡，進(jìn)而縮短產(chǎn)后惡露持續(xù)時(shí)間。

VEGF可特異性誘導(dǎo)血管生成[14]，本研究中造模組VEGF含量顯著高于空白組，說明在子宮恢復(fù)過程中對于新生血管的需求較高，但有研究顯示，其過度表達(dá)會誘發(fā)血管增生，引起子宮異常出血[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)后逐瘀膠囊可降低造模組異常高表達(dá)的VEGF，但又高于空白組，進(jìn)而介導(dǎo)正常平衡的產(chǎn)后新生血管重塑，促進(jìn)子宮內(nèi)膜的修復(fù)。同時(shí)，VEGF還具有激活神經(jīng)再生的功能[16]，因此產(chǎn)后逐瘀膠囊亦可通過提升VEGF的水平起到鎮(zhèn)痛和抗驚厥的作用。

產(chǎn)后宮縮乏力也是造成產(chǎn)后子宮復(fù)舊不全引發(fā)惡露不絕的重要原因，造模組雖然相比于空白組具有較高的子宮平滑肌收縮能力，但這是由于分娩活動造成的；造模組雖然與產(chǎn)后逐瘀膠囊低劑量組在子宮收縮能力上無顯著差異，但產(chǎn)后逐瘀膠囊中、高劑量組的子宮收縮能力顯著高于造模組，說明產(chǎn)后逐瘀膠囊可以興奮子宮，具有行血去瘀的功效。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為：瘀血不去，新血不生；瘀血不去，新血不得歸經(jīng)；離經(jīng)之血妄行，瘀滯胞中，血海不寧而致崩漏之癥。產(chǎn)后出血不止實(shí)則氣滯血瘀之癥，去瘀生新才是治療此癥的關(guān)鍵所在。相比于造模組，產(chǎn)后逐瘀膠囊處理組子宮組織中RhoA和ROCK Ⅰ的表達(dá)水平明顯上調(diào)，揭示產(chǎn)后逐瘀膠囊的有效成分可通過激活RhoA/磷酸鳥苷酶(RhoA/Rho)信號通路參與產(chǎn)后子宮收縮調(diào)節(jié)，加速排血過程[17]。熱休克蛋白27(HSP27)是一種在平滑肌組織表達(dá)豐富的小分子熱休克蛋白，被報(bào)道其參與肌動蛋白絲骨架重塑[18]，其P-HSP27可介導(dǎo)肌肉收縮[19-20]。經(jīng)Western-Blot檢測分析發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)后逐瘀膠囊可顯著提升子宮組織中P-HSP27的含量，從而增進(jìn)子宮平滑肌收縮能力，減少因?qū)m縮乏力誘發(fā)的產(chǎn)后出血以及子宮復(fù)舊不全。

綜上所述，產(chǎn)后逐瘀膠囊可舒緩產(chǎn)后激增的強(qiáng)免疫應(yīng)答，維持機(jī)體炎癥反應(yīng)處于合理范圍，從而保障子宮內(nèi)膜基質(zhì)代謝正常運(yùn)作，修復(fù)內(nèi)膜血管，降低出血，同時(shí)，產(chǎn)后逐瘀膠囊可促進(jìn)RhoA/Rho信號通路介導(dǎo)子宮平滑肌加強(qiáng)收縮，從而達(dá)到治療產(chǎn)后出血惡露不絕的目的。