彭喜之，王濤輝 ， 馬珺 怡，童應(yīng)凱，王雪梅，張 敏，葉玉棟，陳帥君*

(1. 天津農(nóng)學(xué)院農(nóng)學(xué)與資源環(huán)境學(xué)院生物技術(shù)系 天津300384；2. 天津恒基利得生物科技發(fā)展有限公司 天津300392)

0 引 言

土壤是農(nóng)業(yè)發(fā)展基本的生產(chǎn)資料，土壤質(zhì)量?jī)?yōu)略直接影響農(nóng)業(yè)的健康發(fā)展。鹽堿化是影響土壤質(zhì)量的一個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題。鹽堿地是鹽類集積的一個(gè)種類，是指土壤里面所含大量的鹽分會(huì)破壞土壤水分的平衡，改變土壤的結(jié)構(gòu)，致使土壤通透性變?nèi)?，滲透率變大，容易板結(jié)和膠粘，土壤肥力下降，影響到作物的正常生長(zhǎng)。我國(guó)有 9913萬(wàn)公頃鹽堿化土地[1]，堿土和堿化土壤的形成，大部分與土壤中碳酸鹽的累積有關(guān)，因而堿化度普遍較高，嚴(yán)重的鹽堿土壤地區(qū)植物幾乎不能生存[2]。

本研究通過(guò)微生物發(fā)酵菌肥修復(fù)技術(shù)來(lái)對(duì)鹽堿土和酸性土進(jìn)行改良[3]。鹽堿土中富含大量鹽堿成分，而酸性土壤中存在著過(guò)酸物質(zhì)，故制備微生物菌肥所用的微生物菌株必需具有耐酸、耐鹽、降鹽特性，才能在鹽堿化和酸化土壤中起到治理作用[4]。研究選育耐鹽、降鹽微生物在本課題中具有關(guān)鍵作用，如果能從過(guò)酸、過(guò)堿物質(zhì)或土壤中提取出某些具有抗酸堿性并能在其環(huán)境下生長(zhǎng)的菌種[5]，將其投入肥料生產(chǎn)，施肥于鹽堿土地，可以達(dá)到改良土地酸堿性的目的。本文從動(dòng)物糞便與鹽堿土壤中提取出部分菌種，用于進(jìn)行鹽梯度生長(zhǎng)測(cè)試；篩選出 4個(gè)耐鹽菌株，通過(guò)分別測(cè)試其對(duì)鹽堿土和酸性土的中和降解能力，研究4種菌與肥料混合發(fā)酵后對(duì)土壤酸堿性調(diào)節(jié)的最佳比例并獲得了成功。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 原料與菌種

從天津靜海雞養(yǎng)殖場(chǎng)(恒基利得生物科技發(fā)展有限公司)獲取的雞糞便、鹽堿土壤。

1.1.2 培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，瓊脂 15～20g，水 1000mL，pH 7.0～7.2。

M6 培養(yǎng)基：MgS04·7H20 0.25g，葡萄糖 10g，NaCl 20g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.5g，(NH4)2SO42.0g，KH2PO413.6g，去離子水 1000mL，pH 7.5(KOH 調(diào)節(jié))。用于菌株篩選培養(yǎng)。

M63 鹽梯度培養(yǎng)基：FeSO4·7H20 0.5g；KH2PO413.6g；(NH4)2SO42.0g；MgSO4·7H2O 0.25g；葡萄糖10g；NaCl視需要，自來(lái)水1000mL，pH 7.5(KOH調(diào)節(jié))。用于菌株篩選培養(yǎng)。

1.2 主要儀器

pH儀(STARTER 2100S上海奧豪斯儀器公司)，無(wú)菌操作臺(tái)(BCM-1300A 蘇凈安泰)，恒溫培養(yǎng)箱(PH240A 上海一恒科技有限公司)，電子天平(AR124CN 上海奧豪斯儀器公司)，高壓蒸汽滅菌鍋(LDZX-30FBS 上海申安醫(yī)療器械廠)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 微生物菌株分離

根據(jù)吳曉衛(wèi)[4]的方法，從雞糞和鹽堿土壤中分離菌種。

1.3.2 耐鹽菌篩選

選取培養(yǎng)皿上生長(zhǎng)快、直徑大的菌株用平板劃線法接在平板上，在 30 ℃的恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng) 72h。所得菌落再次劃線轉(zhuǎn)接到平板上并在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，之后將平板上的單菌落轉(zhuǎn)接斜面，置于冰箱 4 ℃保存。其中每項(xiàng)操作均重復(fù)3次。

篩選出 4 種生長(zhǎng)良好的菌：N1、N2、N3、N4。篩選結(jié)果生長(zhǎng)情況見(jiàn)表1。

1.3.3 菌株形態(tài)鑒定

將所得菌株劃線轉(zhuǎn)接到富集培養(yǎng)基平皿內(nèi)，30℃恒溫培育 24h后，顯微鏡觀看菌株生長(zhǎng)情況和形態(tài)特征：記錄菌體形態(tài)、菌體大小、菌落質(zhì)地、菌落邊緣。鑒定參照微生物學(xué)《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》和《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》實(shí)行。

表1 菌落篩選結(jié)果Tab.1 Results of colony screening

1.3.4 所選菌株性能檢測(cè)

將經(jīng)過(guò)鑒定的微生物菌株分別接入液體鹽梯度培養(yǎng)基，培養(yǎng)基含 NaCl量分別為 10、20、30、40、50、60g/L。30℃恒溫?fù)u瓶發(fā)酵 24h，運(yùn)用紫外分光光度計(jì)法吸光度 595nm值[9]檢測(cè)發(fā)酵液內(nèi)菌體數(shù)來(lái)判定菌株對(duì)鹽耐受生長(zhǎng)情況[9]。

1.4 微生物菌肥發(fā)酵工藝

1.4.1 發(fā)酵原料和工藝流程

以雞糞為原料，糞便含水量很高，pH自然。

圖1 工藝流程Fig.1 Process flo w

斜面保藏的菌種轉(zhuǎn)接到相應(yīng)的培養(yǎng)基培養(yǎng)進(jìn)行活化，30 ℃恒溫 24h。巨大芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和假單胞菌用肉湯培養(yǎng)基培養(yǎng)[10]；酵母用 PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)[11]?；罨蟮木炅舸龜U(kuò)大培養(yǎng)。

1.4.2 混合菌劑拮抗性能研究

將所得到的固體菌劑按照不同比例混合制備混合菌劑[12]，并轉(zhuǎn)接到同一肉胨平板上和同一肉胨培養(yǎng)基搖瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)，探究混合菌劑間是否產(chǎn)生拮抗抑制作用[13]。通過(guò)觀察平板上菌落生長(zhǎng)情況、菌落數(shù)目、表面形態(tài)和檢測(cè)搖瓶?jī)?nèi)各菌含量判斷是否具有拮抗作用。

1.4.3 復(fù)配方案

按照吳曉衛(wèi)[4]的方法，按照 1%接種量將混合菌劑接入糞便混合物中進(jìn)行發(fā)酵，研究不同比例制成的混合菌劑對(duì)發(fā)酵結(jié)果的影響[14]。以發(fā)酵菌肥中大分子有機(jī)質(zhì)降解多(有機(jī)質(zhì)含量高)、活菌數(shù)目多和發(fā)酵過(guò)程升溫快、保溫時(shí)間長(zhǎng)(有利于殺死糞便中的蟲(chóng)卵、病毒或減少有害物質(zhì)和促進(jìn)菌肥腐熟)的混合比例作為菌種最佳復(fù)配比例，最佳比例見(jiàn)表2。

1.5 土壤pH值恢復(fù)測(cè)定

1.5.1 單菌種對(duì)土壤pH值恢復(fù)測(cè)定

取天津農(nóng)學(xué)院內(nèi)農(nóng)學(xué)種植土壤用 NaOH和 HCl調(diào)節(jié) pH＝2、4、6、8、10、12、14，每個(gè)分組做 3 次，取平均值[14]。將各試驗(yàn)菌種分別施入并測(cè)定其對(duì)pH的恢復(fù)能力，設(shè)立一組對(duì)照組，加入等量超純水進(jìn)行對(duì)照[15]。

表2 混合比例Tab.2 Mixing ratio

1.5.2 復(fù)配菌種對(duì)培養(yǎng)基pH恢復(fù)能力測(cè)定

按復(fù)配方案中的比例將其與肥料混合發(fā)酵，再次取天津農(nóng)學(xué)院內(nèi)農(nóng)學(xué)種植土壤用NaOH和HCl調(diào)節(jié)pH＝2、4、6、8、10、12、14，每個(gè)分組做 3 次，取平均值[16]。施入并測(cè)定4種方案對(duì)pH值的恢復(fù)能力。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株形態(tài)鑒定

根據(jù)微生物學(xué)《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》和《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》判斷出圖 2至圖 5的結(jié)果。N1為巨大芽孢桿菌屬，N2為枯草芽孢桿菌屬，N3為假單胞菌屬，N4為酵母菌屬。

圖2 N1巨大芽孢桿菌屬Fig.2 N1 Bacillus megaterium

圖3 N2枯草芽孢桿菌屬Fig.3 N2 Bacillus subtilis

圖4 N3假單胞菌屬Fig.4 N3 Pseudomonas

圖5 N4酵母菌屬Fig.5 N4 Saccharomyces

2.2 菌株性能檢測(cè)

如圖6所示，其中枯草芽孢桿菌屬在鹽濃度超過(guò)50g/L時(shí)可繼續(xù)生長(zhǎng)，較其他菌屬耐鹽含量高，其最適生長(zhǎng)濃度為 45g/L左右；其次是巨大芽孢桿菌屬，鹽濃度達(dá)到 50g/L的培養(yǎng)液內(nèi)菌體數(shù)超過(guò)另外兩種，菌體數(shù)在鹽含量 30g/L時(shí)達(dá)到最高[9]，巨大芽孢桿菌總體生長(zhǎng)情況不如枯草芽孢桿菌；假單胞菌屬和酵母菌屬的最適鹽濃度為 20g/L，過(guò)高的鹽濃度對(duì)它們的生長(zhǎng)有毒害作用。

圖6 NaCl含量對(duì)各菌株生長(zhǎng)影響Fig.6 Effect of NaCl content on growth of each strain

2.3 混合菌劑拮抗性能

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)混合菌劑在肉胨培養(yǎng)基上和搖瓶?jī)?nèi)(吸光度595nm檢測(cè))4種微生物均生長(zhǎng)良好，無(wú)拮抗性作用，可以混合使用。

2.4 單菌種對(duì)土壤pH恢復(fù)測(cè)定結(jié)果

單菌試驗(yàn)結(jié)果如圖7至圖10所示。

圖7 巨大牙孢桿菌對(duì)土壤pH恢復(fù)測(cè)定Fig.7 Determination of soil pH recovery by Bacillus megaterium

圖8 枯草牙孢桿菌對(duì)土壤pH恢復(fù)測(cè)定Fig.8 Determination of soil pH recovery by Bacillus subtilis

圖9 酵母菌屬對(duì)土壤pH恢復(fù)測(cè)定Fig.9 Determination of soil pH recovery by Saccharomyces

圖10 假單胞菌屬對(duì)土壤pH回復(fù)測(cè)定Fig.10 Determination of soil pH recovery by Pseudomonas

表3 對(duì)照組pH變化測(cè)定Tab.3 Change of pH value in control group

以上各圖中 2至 8為起始設(shè)定土壤 pH分別為2、4、6、8、10、12、14 組的待測(cè)樣品。從數(shù)據(jù)結(jié)果可知：枯草芽孢桿菌對(duì) pH的恢復(fù)是顯著的，在 pH呈酸性時(shí)恢復(fù)能力穩(wěn)定，能逐漸將其恢復(fù)到 pH 6以上并接近7的程度；而在pH呈堿性時(shí)恢復(fù)能力則較弱一些，隨著 pH的逐漸升高恢復(fù)能力減弱。巨大芽孢桿菌與其相似，但在 pH呈堿性時(shí)恢復(fù)能力上顯得更弱一些。而酵母菌與假單胞菌在pH為酸性時(shí)的恢復(fù)能力穩(wěn)定，但 pH呈堿性時(shí)恢復(fù)能力變?nèi)?，隨著 pH的升高而降低。通過(guò)觀察對(duì)照組可知，在 pH土壤過(guò)酸的情況下，由于酸性物質(zhì)的自然揮發(fā)會(huì)使其 pH向平衡的一端轉(zhuǎn)移，但是若沒(méi)有微生物菌劑輔助的話，往往在某一個(gè)階段就停止變化。根據(jù)表 3對(duì)照組所示，堿性土壤或過(guò)堿土壤中的 pH則幾乎不隨時(shí)間變化而變化，很好地展示出了微生物對(duì)土壤的修復(fù)能力。其中枯草芽孢桿菌對(duì)土壤恢復(fù)能力最佳，其次為巨大芽孢桿菌，假單胞菌與酵母菌屬最弱。

2.5 復(fù)配菌種對(duì)培養(yǎng)基pH恢復(fù)能力測(cè)定結(jié)果

由圖 11可知，A方案的恢復(fù)能力在 pH呈酸性時(shí)恢復(fù)能力不錯(cuò)，但在 pH呈堿性時(shí)弱于其他組。B方案與D方案對(duì)比A方案較強(qiáng)。但是C方案在pH呈酸性或堿性時(shí)，其恢復(fù)度都與其他 3組有明顯差異，在 pH呈酸性時(shí)穩(wěn)定上升，在 pH呈堿性時(shí)則與其他組不同，產(chǎn)生了顯著效果，使 pH下降迅速且穩(wěn)定。4種復(fù)配比例下的混合發(fā)酵中，對(duì)土壤 pH恢復(fù)能力為C＞B＞D＞A；最佳配比為枯草芽孢桿菌∶巨大芽孢桿菌∶假單胞菌∶酵母菌＝1∶2∶1∶1。

圖11 4個(gè)比例的復(fù)合菌劑pH恢復(fù)測(cè)定Fig.11 Determination ofpH recovery by four proportions of compound bacteria

3 討 論

本研究從天津靜海雞養(yǎng)殖場(chǎng)的糞便和鹽堿地中分離出4種對(duì)酸堿有抗性并能改良其pH值的菌屬，對(duì)其進(jìn)行鏡檢觀察并對(duì)照《手冊(cè)》大致確定其為：枯草芽孢桿菌屬、巨大芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、酵母菌屬。在確定之后分別測(cè)定了 4種菌對(duì)酸堿土壤的恢復(fù)能力，并安排了對(duì)照組進(jìn)行對(duì)比，最后確定枯草芽孢桿菌屬對(duì)土壤pH恢復(fù)的能力最佳。對(duì)混合菌劑開(kāi)展了拮抗性試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)菌劑在同一平板和同一搖瓶實(shí)驗(yàn)中未顯示菌株間有拮抗性，菌株生長(zhǎng)良好。

確定混合菌劑肥最佳復(fù)配比例，再以 1%接種量雞糞為原料來(lái)發(fā)酵微生物菌種，測(cè)定土壤 pH恢復(fù)值作為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，最終確定了4種混合菌劑的最佳配比為 1∶2∶1∶1，在此比例下對(duì)土壤 pH 值恢復(fù)能力最佳。

由于實(shí)驗(yàn)材料的限制，本研究用以發(fā)酵微生物菌肥的菌株篩選方法比較單一，需要多次重復(fù)的實(shí)驗(yàn)過(guò)程才能得到高效株，過(guò)程繁瑣。可以考慮結(jié)合化學(xué)誘變劑、等離子體誘變技術(shù)和基因組技術(shù)對(duì)菌株進(jìn)行改造，獲得耐鹽性強(qiáng)的突變菌株。后續(xù)將嘗試運(yùn)用誘變等方法盡可能篩選出更高效的菌株并再次測(cè)定，之后施入土壤并種植作物以測(cè)定更多數(shù)據(jù)。