邵亮亮 杜京霖 盛林霞 應(yīng)美蓉 徐晨斌 章 程 李 燕

(1.浙江省糧油產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)中心，杭州 310012； 2.浙江省糧食局直屬糧油儲備庫， 杭州 311100)

小麥?zhǔn)鞘澜缱钪匾墓任镔Y源之一，也是我國的主要糧食作物，其質(zhì)量安全關(guān)系到人們的身體健康和社會穩(wěn)定。真菌毒素特別是嘔吐毒素(Vomitoxin)是威脅我國小麥質(zhì)量安全的主要因素之一。嘔吐毒素也叫脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(Deoxynivalenol，DON)，是一種單端孢霉烯族毒素[1]，主要來自鐮刀菌屬，具有細(xì)胞毒性、免疫抑制、致畸作用及可能的弱致癌性，人和動物在誤食被該毒素污染的食物后會導(dǎo)致各類急性中毒癥狀[2-4]。歐盟法規(guī)規(guī)定，作為口糧的小麥，DON含量不得超過1250 μg/kg[5]，我國食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)GB 2761-2017《食品中真菌毒素限量》規(guī)定了小麥、麥片和小麥粉中嘔吐毒素的限量均為1000 μg/kg[6]，超標(biāo)的小麥及其制品不能作為儲備糧也不能進(jìn)入市場[7]。

國內(nèi)外關(guān)于嘔吐毒素檢測的方法主要有薄層色譜法[8]、酶聯(lián)免疫吸附法[9]、膠體金免疫層析法[10]、高效液相色譜法[11]、高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[12，13]等。其中薄層色譜法由于溶劑消耗量大、重現(xiàn)性差等原因目前很少使用，酶聯(lián)免疫吸附法、膠體金免疫層析法和真菌毒素快速檢測儀法一般用于快速檢測和大批量樣品的初篩，容易出現(xiàn)假陰性和假陽性結(jié)果，不能作為準(zhǔn)確定量法使用，而高效液相色譜法和高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法能夠精確定量，但前處理過程均需要采用免疫親和柱凈化、氮吹等前處理，過程繁瑣、耗時過長。近年來，免疫磁珠富集凈化法由于具有操作簡便、分離快速和特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，逐漸應(yīng)用于真菌毒素檢測[14-17]，但目前尚未制定嘔吐毒素免疫磁珠凈化的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)或國家標(biāo)準(zhǔn)。本研究采用的真菌毒素全自動免疫磁珠凈化儀采用免疫磁珠富集凈化技術(shù)，嘔吐毒素經(jīng)提取后，特異性地吸附在磁珠表面的抗體上，通過內(nèi)置磁棒完成全自動高通量的磁吸、轉(zhuǎn)移、洗滌和洗脫的全過程，搭配超高效液相色譜儀，完成樣品中嘔吐毒素的快速、準(zhǔn)確的檢測。本方法簡化了前處理過程，提高了檢測的自動化水平和檢測效率，可以滿足大批量樣品的DON快速定量檢測。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

Agilent1260型高效液相色譜儀(美國Agilent 公司)；JJHZ10型真菌毒素全自動凈化儀(北京東孚久恒儀器技術(shù)有限公司)；LM3100型錘式實(shí)驗(yàn)室粉碎磨(瑞典Perten公司)；PL202-L型分析天平(瑞士Mettler Toledo公司)； EOAA-HM-01型多管漩渦混合器(上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司)；3-18K型離心機(jī)(德國Sigma 公司)；4204型電動分樣器(美國Gamet公司)。

1.2 材料與試劑

嘔吐毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液(CAS：51481-10-8，濃度為199 mg/L，不確定度為±10 mg/L，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司)；嘔吐毒素凈化試劑盒(北京東孚久恒儀器技術(shù)有限公司)；甲醇、乙腈(色譜純，德國Merck公司)；聚乙二醇(分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；小麥樣品，由浙江省內(nèi)小麥種植農(nóng)戶提供。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1樣品前處理

樣品制備參考《糧食中真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)、法規(guī)和檢驗(yàn)》中的樣品制備方法[18]，前處理方法參考國標(biāo)GB 5009.111-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇及其乙?；苌锏臏y定》第二法免疫親和層析凈化高效液相色譜法[19]，并結(jié)合嘔吐毒素凈化試劑盒使用說明書進(jìn)行：小麥樣品通過實(shí)驗(yàn)室粉碎磨進(jìn)行粉碎，過20目曬網(wǎng)，準(zhǔn)確稱取5 g(精確到0.01 g)固體粉末樣品于50 mL離心管中，加入1.0 g聚乙二醇和20 mL去離子水，渦旋振蕩提取20 min，然后離心機(jī)6000 r/min離心5 min。用1 mL移液槍準(zhǔn)確移取提取上清液1.0 mL加入試劑盒的1號樣品孔中，將試劑盒放入真菌毒素全自動凈化儀，按照設(shè)定的嘔吐毒素凈化程序開始凈化。凈化結(jié)束，用1 mL移液槍準(zhǔn)確吸取0.5 mL去離子水至5號樣品孔中，混合均勻后使用0.22 μm微孔濾膜過濾，收集濾液于進(jìn)樣瓶中供高效液相色譜測定。

1.3.2標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

用移液管準(zhǔn)確吸取0.5 mL嘔吐毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液于10 mL容量瓶中，用甲醇定容，配制成濃度為10.00 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。準(zhǔn)確移取0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 mL標(biāo)準(zhǔn)儲備液于10 mL容量瓶中，用70 %的甲醇水溶液定容至刻度，得到0.05、0.10、0.20、0.50、1.00、2.00 μg/mL系列標(biāo)準(zhǔn)工作液，4 ℃保存。

1.3.3儀器條件

色譜柱：ZORBAX Eclipse Plus C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：A相水+B相甲醇+C相乙腈(80+5+15)；柱溫35 ℃ ；流速1.0 mL/min；進(jìn)樣量50 μL；檢測波長：218 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 試樣前處理條件的選擇與優(yōu)化

由于小麥試樣感染嘔吐毒素并不均勻，不同籽粒、不同的部位所含嘔吐毒素差異較大[20],為了保證試樣的代表性和檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，需要大量取樣以制備樣品[21]，本實(shí)驗(yàn)將小麥樣品混合均勻，通過分樣器縮分至1 kg左右再通過實(shí)驗(yàn)室粉碎磨粉碎，混勻。試樣稱樣量為5 g，便于在離心管中渦旋振蕩提取，但同國標(biāo)5009.111-2016相比稱樣量縮小了5倍。此外，國標(biāo)法中洗脫液需先通過氮吹儀氮吹至近干，再用流動相定容至1.0 mL，而本實(shí)驗(yàn)為了快速測定，無需通過氮吹，改為在洗脫液(1.0 mL)中加入0.5 mL純水，定容至1.5 mL。為了驗(yàn)證本方法的可行性，本實(shí)驗(yàn)選擇了一個嘔吐毒素含量為1163 μg/kg的小麥陽性樣品，分別采用兩種前處理方法(A：稱樣量5 g，渦旋提取，不氮吹，定容至1.5 mL；B：稱樣量25 g，振蕩提取，氮吹，定容至1.0 mL)進(jìn)行6次提取，比較結(jié)果的差異性，見表1。通過T檢驗(yàn)可知，A法和B法測定結(jié)果之間沒有顯著性差異(P>0.05)，實(shí)驗(yàn)結(jié)論與文獻(xiàn)一致[22]。

表1 兩種DON測定前處理方法的結(jié)果比較

2.2 全自動免疫磁珠凈化儀參數(shù)優(yōu)化

由于小麥樣品基質(zhì)較復(fù)雜，待測液如果直接進(jìn)行高效液相色譜測定會產(chǎn)生很多干擾峰，影響檢測結(jié)果，因此進(jìn)樣前需要對待測液進(jìn)行凈化處理，本實(shí)驗(yàn)通過全自動免疫磁珠凈化儀進(jìn)行凈化。全自動免疫磁珠凈化儀凈化過程見圖1。凈化過程就是磁棒帶動磁珠在試劑盒各孔位之間的富集、清洗和洗脫等操作步驟。其中試劑盒1號孔位為樣品上樣和稀釋孔，2號孔位為免疫磁珠孔，含磷酸鹽緩沖液(PBS)，3、4號孔位為清洗孔，含Twen-20的磷酸鹽緩沖液(PBST), 5號孔位為洗脫孔，洗脫液為甲醇。本實(shí)驗(yàn)設(shè)置的全自動免疫磁珠凈化儀參數(shù)見表2。在此參數(shù)下，30min內(nèi)能同時完成10個樣品的凈化。樣品凈化后，通過高效液相色譜測定可以有效去除提取液中的干擾物質(zhì)，得到理想的色譜圖(圖2)。

圖1 全自動免疫磁珠凈化儀凈化過程

表2 全自動免疫磁珠凈化儀參數(shù)

2.3 液相色譜條件的選擇和優(yōu)化

通過紫外掃描，可知DON最大吸收波長在218 nm附近，故選擇218 nm作為檢測波長，此外通過二極管陣列檢測器(DAD)可以對樣品目標(biāo)峰進(jìn)行光譜分析，減少假陽性結(jié)果，因此本實(shí)驗(yàn)選擇DAD檢測器進(jìn)行檢測。

由于本方法不需通過氮吹，定溶液甲醇含量較高，而常用的流動相中有機(jī)相比例較低，液相分析時容易產(chǎn)生不同程度的溶劑效應(yīng)，從而影響DON峰型，因此需要對流動相進(jìn)行優(yōu)化。實(shí)驗(yàn)采用3種流動相進(jìn)行比較：A.水+甲醇=20+80，B.水+乙腈=20+80，C.水+甲醇+乙腈+20+5+15，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，流動相為A時，溶劑效應(yīng)影響很大，目標(biāo)峰峰形很差，影響結(jié)果準(zhǔn)確性；流動相為B時，無溶劑效應(yīng)，目標(biāo)峰峰形良好，但出峰提前，與溶劑峰和雜峰分離度較差；流動相為C時，無溶劑效應(yīng)，目標(biāo)峰良好，且與溶劑峰和雜峰等具有很好的分離度，DON在6min可完成分析，符合DON快速測定的要求。DON標(biāo)準(zhǔn)溶液(A)和樣品(B)的液相色譜圖如圖2所示。

圖2 DON標(biāo)準(zhǔn)溶液(A)和樣品(B)的高效液相色譜圖

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍和檢出限

在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，對6個不同質(zhì)量濃度(0.05、0.10、0.20、0.50、1.00、2.00 μg/mL)的DON標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測定，以DON目標(biāo)峰的峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，對應(yīng)的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖3，并根據(jù)信噪比(S/N)確定檢出限(LODs，RSN=3)和定量限(LOQs，RSN=3)。如圖所示，DON在線性范圍內(nèi)具有很好的線性關(guān)系，回歸方程為Y=58.62X-0.34，相關(guān)系數(shù)為0.9999，檢出限為40.9 μg/kg，定量限為136.4 μg/kg。

2.5 方法準(zhǔn)確性

對23個具有不同DON污染水平的小麥樣品，分別采用免疫親和柱凈化法(國標(biāo)法)和全自動免疫磁珠凈化法(儀器法)進(jìn)行前處理，并測定DON含量(CDON)，比較結(jié)果的差異性和一致性。將樣品分為輕度污染組(CDON≤1000 μg/kg)、中度污染組(1000 μg/kg2500 μg/kg)分別比較，結(jié)果見表3。

表3 儀器法與國標(biāo)法測定結(jié)果比較

圖3 DON標(biāo)準(zhǔn)曲線

通過SPSS配對T檢驗(yàn)可知，DON輕度或中度污染的小麥樣品(CDON≤2500 μg/kg)，采用國標(biāo)法和儀器法進(jìn)行前處理，DON測定結(jié)果沒有顯著差異(P>0.05)，通過Kendall一致性檢驗(yàn)可知，DON輕度或中度污染的小麥樣品采用兩種凈化法進(jìn)行前處理，DON測定結(jié)果具有顯著的一致性(Kendall漸進(jìn)顯著性P<0.05)，且一致性水平很高(K(W)≥0.98)；然而當(dāng)小麥DON污染水平較高時(CDON>2500 μg/kg)，通過儀器法進(jìn)行前處理測得的DON結(jié)果比國標(biāo)法顯著偏低(P<0.05)，兩者結(jié)果不具有一致性(Kendall漸進(jìn)顯著性P>0.05)。出現(xiàn)偏差的原因是全自動免疫磁珠凈化法測定DON污染水平較高的小麥樣品時，樣品提取液中的DON含量超過了免疫磁珠抗體的最大吸附量而出現(xiàn)吸附不完全，從而造成DON測定結(jié)果偏低。因此，對于重度污染的樣品，提取時需要適當(dāng)稀釋，使DON含量在免疫磁珠最大吸附量范圍內(nèi)，即可保證測定結(jié)果的準(zhǔn)確性。

2.6 回收率和精密度

向不含DON的小麥全麥粉中添加低、中、高3個濃度水平的DON標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照全自動免疫磁珠凈化儀設(shè)定的方法進(jìn)行凈化，并通過HPLC測定DON含量，每個加標(biāo)水平平行測定6次，計算3個濃度水平下DON的加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果如表4所示。在3個濃度水平下DON平均回收率在94.96～108.58 %范圍內(nèi)，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于5.0 %，說明該方法可靠，精密度良好，符合高效液相色譜法快速測定的要求。

表4 DON加標(biāo)回收率(n=6)

2.7實(shí)際樣品測定

采用1組10孔的嘔吐毒素凈化試劑盒，可以同時對10個小麥樣品進(jìn)行全自動免疫磁珠凈化操作，本實(shí)驗(yàn)選擇本地生產(chǎn)的10個不同品種的小麥樣品，進(jìn)行3次平行測定，結(jié)果如表5所示。10個小麥樣品的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于10 %，符合國標(biāo)GB 5009.111-2016第二法規(guī)定的精密度要求(<23 %)。受種植環(huán)境的影響，本實(shí)驗(yàn)選擇的10個不同品種小麥中均檢出DON，且含量有較大差異，其中鎮(zhèn)麥12和鎮(zhèn)麥168的DON含量超過國標(biāo)限量(1000 μg/kg)，而蘇麥188和揚(yáng)麥23的DON含量較低。

表5 不同品種小麥中DON含量

續(xù)表5

3 結(jié)論

采用全自動免疫磁珠凈化法對小麥樣品進(jìn)行凈化處理，通過高效液相色譜快速測定DON含量。小麥樣品前處理中通過全自動免疫磁珠凈化儀進(jìn)行批量凈化，節(jié)省大量的人力和時間，樣品無需通過氮吹，可以直接通過條件優(yōu)化后的高效液相色譜法進(jìn)行測定，在6 min內(nèi)就能進(jìn)行準(zhǔn)確定量。該方法快速、準(zhǔn)確，回收率和精密度高，并能達(dá)到良好的分離效果，適用于實(shí)驗(yàn)室對批量小麥中DON的快速測定。