Q 型煙粉虱細胞色素P450 CYP6DV5 基因克隆及其在煙粉虱對噻蟲嗪抗性中的作用

楊峰山, 殷 城, 楊 靜, 危學高, 杜田華,楊 鑫, 王少麗, 張友軍*,

(1. 黑龍江大學 生命科學學院，黑龍江省寒地生態(tài)修復與資源利用重點實驗室，農(nóng)業(yè)微生物技術教育部工程研究中心，黑龍江省普通高校分子生物學重點實驗室，哈爾濱 150030；2. 中國農(nóng)業(yè)科學院 蔬菜花卉研究所，北京 100081)

煙粉虱Bemisia tabaci 是一種世界性農(nóng)業(yè)害蟲，其寄主植物廣泛，以直接取食植物汁液，分泌蜜露誘發(fā)煤污病以及傳播植物病毒等方式危害農(nóng)作物生長[1-2]。在與環(huán)境協(xié)同進化的過程中，煙粉虱被分化出數(shù)十種不同的生物型 (隱種)，其中入侵性最強、危害最為嚴重的是B 型和Q 型煙粉虱。中國于20 世紀90 年代首次發(fā)現(xiàn)B 型煙粉虱，2003 年首次發(fā)現(xiàn)Q 型煙粉虱，隨后Q 型煙粉虱大面積爆發(fā)，導致番茄病毒病大規(guī)模發(fā)生，造成了嚴重危害[3-6]。

目前煙粉虱的防治主要依賴于化學防治，盡管觸殺型的殺蟲劑對其成蟲具有一定殺蟲效果，但是對隱藏在植物葉片背面的若蟲則防效不佳。噻蟲嗪作為第二代新煙堿類殺蟲劑，具有良好的觸殺及內(nèi)吸性殺蟲效果，在世界范圍內(nèi)被大量用于煙粉虱、桃蚜和褐飛虱等刺吸式害蟲的防治[7]。隨著噻蟲嗪長時間的使用，煙粉虱逐漸對其產(chǎn)生了嚴重的抗性[8-11]。自2007 年起，在中國境內(nèi)的田間抗性監(jiān)測中陸續(xù)發(fā)現(xiàn)煙粉虱對噻蟲嗪產(chǎn)生了不同程度的抗性[12-13]。

昆蟲對新煙堿類殺蟲劑的抗性機制主要包括靶標抗性和代謝抗性，其中關于靶標抗性的報道主要有褐飛虱因乙酰膽堿受體α 亞基突變 (Y151S)[14]和蚜蟲因乙酰膽堿受體β1 亞基突變 (R81T)[15]，最終導致其對吡蟲啉產(chǎn)生抗性。目前尚未見關于煙粉虱靶標抗性機制的報道。煙粉虱對新煙堿類殺蟲劑的抗性主要為代謝抗性，如在煙粉虱對吡蟲啉的抗性種群中發(fā)現(xiàn)，由于細胞色素P450 基因CYP6CM1 過量表達，使得煙粉虱將吡蟲啉代謝成親水性更強的羥基化吡蟲啉，并且這種抗性機制在田間種群中也得到了廣泛的驗證[16-18]。

前期研究比較了對噻蟲嗪抗性和敏感的煙粉虱種群間的一系列I 期和II 期解毒酶間的轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平的差異，其中包括細胞色素P450、UDP-葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST) 和幾種ABC 轉(zhuǎn)運蛋白[19]。在細胞色素P450酶系數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)，相比于對噻蟲嗪敏感的煙粉虱種群，細胞色素P450 基因CYP6DV5 在噻蟲嗪抗性煙粉虱種群中顯著過量表達，表明其很可能參與了煙粉虱對噻蟲嗪抗性的形成。本研究對該基因進行克隆，分析了其在噻蟲嗪抗性煙粉虱不同部位和不同發(fā)育階段的相對表達量，并通過RNA干擾試驗探究了其在煙粉虱對噻蟲嗪產(chǎn)生抗性中的作用。研究結(jié)果將有助于揭示煙粉虱對噻蟲嗪的抗性形成機制，并且為煙粉虱的綜合治理提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

昆蟲：Q 型煙粉虱來自于中國農(nóng)業(yè)科學院蔬菜花卉所長期飼養(yǎng)的種群，寄主植物為棉花，溫室飼養(yǎng)條件為溫度 (25 ± 1) ℃、相對濕度70% ±5%、光照14 h (光照) : 10 h (黑暗)。其中噻蟲嗪敏感種群長期無藥劑接觸史；噻蟲嗪抗性種群通過噻蟲嗪汰選獲得，與噻蟲嗪敏感種群相比，其對噻蟲嗪的抗性倍數(shù)約為58.4 倍[20]。

1.2 供試試劑及儀器

1.2.1 藥劑及試劑 噻蟲嗪 (thiamethoxam) 原藥(上海源葉生物科技有限公司)；RNA 提取試劑Trizol (賽默飛世爾科技有限公司)；cDNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript?RT reagent Kit (REAL TIME)(寶日醫(yī)生物技術有限公司)；熒光定量PCR 試劑盒SuperReal PreMix Plus (SYBR Green) (北京天根生化科技有限公司)；dsRNA 合成試劑盒T7 RiboMAX Express RNAi system (普洛麥格生物技術有限公司)；PCR 引物 (合成自北京擎科新業(yè)生物技術有限公司)；PCR EsTaq with 6 × Loading Buffer MIX(北京康為世紀生物科技有限公司)；DH5α 感受態(tài)細胞、PCR 產(chǎn)物純化試劑盒、pEASY-T1 載體 (北京全式金生物技術有限公司)，其他實驗室常用化學試劑 (分析純) 均為市售。

1.2.2 儀器 ABI7500 熒光定 PCR 儀；Bio-Rad S1000PCR 儀；Thermo Scientific Nanodrop 2000 分光光度計；Sigma 3K15 高速離心機；超純水儀(ZMQ55VOTI Mini Q)；分子實驗用移液器(Eppendorf)。

1.3 試驗方法

1.3.1 煙粉虱RNA 提取及cDNA 合成 用吸蟲管從煙粉虱養(yǎng)蟲籠中取50 頭成蟲于離心管中，經(jīng)液氮速凍5 min 后使用Trizol 試劑參照試劑使用說明書提取總RNA。每個離心管內(nèi)加入1 mL Trizol 和兩粒小鋼珠，于勻漿器中充分破碎。向離心管內(nèi)加入200 μL 氯仿，漩渦振蕩1 min，于冰上靜置5 min，于 4 ℃、12 000 r/min 下離心 10～15 min。吸取上層清液400 μL 至新的離心管中，加入400 μL 預冷的異丙醇，輕輕上下顛倒混勻，于冰上靜置10 min，再在4 ℃、12 000 r/min 下離心10 min。棄去上清液，加入體積分數(shù)為70%的乙醇1 mL 顛倒清洗，于4 ℃、8 000 r/min 下離心5 min。棄去上清液，將管內(nèi)殘余液體吸干，于超凈臺內(nèi)晾置5 min。加入10 μL 焦碳酸二乙酯(DEPC) 水溶解，于冰上靜置3 min 后進行OD260/OD280值和RNA 質(zhì)量濃度測定。選擇OD260/OD280值在1.9 以上、質(zhì)量濃度高于200 μg/μL 的 RNA 進行反轉(zhuǎn)錄。

反轉(zhuǎn)錄參照TaKaRa 反轉(zhuǎn)錄合成試劑盒說明書合成cDNA，熒光定量樣品RNA 反轉(zhuǎn)總量為1 μg。

1.3.2 煙粉虱CYP6DV5 基因克隆 通過煙粉虱基因組序列[21]獲得CYP6DV5 基因全長，利用Primer Premier 5.0 軟件設計擴增引物CYP6DV5-F/R (表1)，由生工生物工程股份有限公司合成。以煙粉虱cDNA為模板，反應體系：cDNA 1.0 μL, Taq 酶 mix 12.5 μL,Primers-F/R 0.5 mL, ddH2O 10.5 μL。PCR 反應程序：95 ℃ 預變性 5 min；95 ℃ 變性 30 s，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，35 個循環(huán)；72 ℃最終延伸10 min。PCR 擴增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳檢測后切下目的條帶，用DNA 瓊脂糖凝膠回收試劑盒進行膠回收，將產(chǎn)物連接到pEASY-T1 克隆載體上，然后轉(zhuǎn)染進入DH5α 感受態(tài)細胞中，進行藍白斑篩選，挑取陽性克隆，送北京擎科生物科技有限公司測序，結(jié)果在NCBI 上進行比較分析。

表1 本研究中所用引物Table 1 Primers used in this study

1.3.3 煙粉虱CYP6DV5 基因表達量分析 收集煙粉虱抗性種群的卵、1～4 齡若蟲、成蟲以及成蟲的頭、胸、腹部位，每個樣品進行4 個生物學重復。

卵及若蟲收集：顯微鏡下用毛刷刷下煙粉虱產(chǎn)在葉片上的卵，每個生物學重復約2 000 粒。顯微鏡下用挑針挑取煙粉虱若蟲，1、2 齡若蟲一起收集，每個生物學重復約200 頭；3、4 齡若蟲一起收集，每個生物學重復約100 頭。

成蟲收集：用玻璃管抓取單頭煙粉虱成蟲，在顯微鏡下辨別雌雄后分別收集，每個生物學重復約60 頭。

成蟲各部位收集：用玻璃管抓取單頭煙粉虱成蟲，在顯微鏡下用解剖針分解挑取煙粉虱的頭部、胸部和腹部，立即放入裝有Trizol 的離心管中。每個生物學重復分別為2 000、300 和100 頭。

以上樣品取樣放入液氮中冷凍，?80 ℃保存。對取得的樣品分別提取RNA。取1 μg 總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，用于研究CYP6DV5 基因在煙粉虱不同發(fā)育階段和部位的表達量差異。依據(jù)基因克隆得到的CYP6DV5 基因全長序列，設計篩選熒光定量PCR 引物CYP6DV5-qF/qR (表1)，內(nèi)參基因為煙粉虱延伸因子 (elongation factors-1α，EF-1α) 和核糖體蛋白L29(ribosomal protein L29,RPL29)。熒光定量PCR (qRT-PCR) 采用SYBR Green I 染料進行，20 μL 反應體系：2 × SuperReal PreMix Plus 10 μL, 10 μmol/L 上下游引物各 0.5 μL,50 × ROX Refernce Dye 0.4 μL, cDNA 模板 1.0 μL，RNAse-Free ddH2O 7.6 μL。反應條件：95 ℃ 預變性 10 min，95 ℃ 變性 15 s，60 ℃ 退火 30 s，72 ℃延伸30 s，40 個循環(huán)。熒光定量引物擴增效率模板采用3 倍梯度稀釋，統(tǒng)計不同濃度下的Ct值，計算擴增效率，每個樣品3 個生物學重復。根據(jù)2?ΔΔCt法[22]計算 CYP6DV5 基因在煙粉虱不同發(fā)育階段和部位、以及在噻蟲嗪抗敏煙粉虱種群中的表達量。

1.3.4 煙粉虱RNA 干擾 采用飼喂法進行煙粉虱RNA 干擾[20]。將雙鏈RNA (dsRNA) 和營養(yǎng)液(30%的蔗糖和5%的酵母浸出物溶液) 混合配制成含dsRNA 的飼喂液。取一個兩端開口的圓柱形玻璃管 (長5 cm，直徑2 cm)，將培養(yǎng)皿封口膜拉伸至盡可能地透薄，覆蓋在玻璃管開口的一端，取配制好的雙鏈RNA 營養(yǎng)液滴加在玻璃管封口端外側(cè)封口膜上，再拉展一層封口膜覆蓋在其上，使營養(yǎng)液均勻分布在兩層封口膜中間。將封好營養(yǎng)液的玻璃管的另一開口端扣在飼養(yǎng)煙粉虱的葉片上，輕輕拍動葉片使煙粉虱自然飛入管內(nèi)，每管取40～50 頭，取完后用封口膜將開口端封住。利用煙粉虱的趨光性，將營養(yǎng)液端以外的玻璃管身用黑色塑料殼覆蓋，僅留營養(yǎng)液端向光放置在培養(yǎng)箱內(nèi)，讓煙粉虱集中在營養(yǎng)液端取食，溫度(25 ± 1) ℃、相對濕度 70% ± 5%、光照 14 h (光照) :10 h (黑暗)。雙鏈 RNA 飼喂質(zhì)量濃度為 0.5 μg/μL，飼喂量為每個飼喂小袋100 μL，每個處理3 個生物學重復。48 h 后取出煙粉虱，提取其RNA，反轉(zhuǎn)錄后進行qRT-PCR 以測定目的基因的干擾效率。

1.3.5 煙粉虱噻蟲嗪敏感性測定 在噻蟲嗪抗性煙粉虱體內(nèi)敲低CYP6DV5 基因后，對其進行噻蟲嗪敏感性測定。其中煙粉虱成蟲敏感性測定參考Feng 等[23]的葉片浸藥法。試驗分為6 個質(zhì)量濃度的藥劑處理組以及1 組空白對照，每個質(zhì)量濃度4 個生物學重復，添加曲拉通以便使藥劑在葉片上有更好的附著效果。藥劑處理組使用蒸餾水、二甲基亞砜 (DMSO)、噻蟲嗪原藥和0.01%的曲拉通溶液配制，對照組使用蒸餾水和0.1‰的曲拉通溶液配制。指形管底部鋪上2%的瓊脂，凝固后待管壁水蒸氣晾干，將預先打取的棉花葉片浸藥10 s，晾干后輕輕放于玻璃管中瓊脂上，每管接入煙粉虱成蟲20～30 頭，用棉塞封口。整個裝置倒置于培養(yǎng)箱中，溫度 (25 ± 1) ℃、相對濕度70% ±5%、光照14 h (光照) : 10 h (黑暗)。統(tǒng)計測定結(jié)果時，輕輕拍打管壁，觀察煙粉虱生存情況，用昆蟲針撥動煙粉虱，以無活動跡象記為死亡。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)均采用SPSS 19.0 軟件進行統(tǒng)計學分析，不同發(fā)育階段，成蟲不同部位以及噻蟲嗪抗性、敏感之間的基因表達量均采用單因素方差分析，誘導后的基因表達量變化應用Tukey 法進行多重比較分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 煙粉虱CYP6DV5 基因的克隆及其序列分析

分別以噻蟲嗪抗性、敏感煙粉虱cDNA 為模板，通過PCR 獲得1 527 bp 的CYP6DV5 基因的全長ORF 序列 (圖1)，該長度與基因組序列一致。將對噻蟲嗪抗性與敏感的煙粉虱CYP6DV5 基因ORF 序列進行比對后，未發(fā)現(xiàn)兩者間存在差異位點。進一步分析后發(fā)現(xiàn)，煙粉虱CYP6DV5 基因編碼509 個氨基酸，分子質(zhì)量為58.71 kDa，等電點為6.13，具有細胞色素P450 基因的保守結(jié)構域：C-helix (W × × × R) 結(jié)構域 (51-55)、Hemebinding 結(jié)構域 (369-379)、Oxygen-binding 結(jié)構域(176-180) 以及 P × × F × P 結(jié)構域 (345-350)，屬于典型的昆蟲P450 基因 (圖2)。

2.2 CYP6DV5 基因在噻蟲嗪抗性煙粉虱不同發(fā)育階段和部位的表達量

應用熒光定量PCR 分析CYP6DV5 基因在噻蟲嗪抗性煙粉虱不同齡期的表達情況，結(jié)果如圖3A所示，CYP6DV5 基因在噻蟲嗪抗性煙粉虱卵期表達量最低，若蟲階段有一定的表達量，成蟲期的雄性和雌性個體表達量最高；不同部位表達如圖3B 所示，該基因在噻蟲嗪抗性煙粉虱腹部表達很少，主要集中在頭部和胸部表達。

2.3 噻蟲嗪抗性及敏感品系的CYP6DV5 表達量分析

通過檢測室內(nèi)飼養(yǎng)的Q 型煙粉虱敏感種群以及相應篩選的噻蟲嗪抗性種群，發(fā)現(xiàn)該基因在噻蟲嗪抗性種群中的表達量為敏感種群的2.95 倍，差異極顯著 (圖4A)。進一步用50 mg/L 的噻蟲嗪對抗性種群進行殺蟲劑誘導試驗，結(jié)果如圖4B所示，隨著接觸噻蟲嗪時間的延長，細胞色素CYP6DV5 基因的表達量顯著上調(diào)。

2.4 RNA 干擾后煙粉虱CYP6DV5 基因的表達量及其對噻蟲嗪敏感性變化

CYP6DV5 基因在噻蟲嗪抗性煙粉虱種群中過量表達，對于該基因在煙粉虱對噻蟲嗪抗性中發(fā)揮的作用需要進一步研究。通過RNA 干擾的方法敲低該基因在噻蟲嗪抗性煙粉虱體內(nèi)的表達量，對其飼喂 0.5 μg/μL 的 dsCYP6DV5 營養(yǎng)液 48 h后，用熒光定量PCR 檢測發(fā)現(xiàn)該基因在煙粉虱成蟲體內(nèi)表達量減少了39% (圖5 A)。在敲低該基因在噻蟲嗪抗性煙粉虱體內(nèi)的表達量后，在50 和100 mg/L 的噻蟲嗪處理條件下，測定RNAi 后的煙粉虱對噻蟲嗪敏感性變化。結(jié)果顯示，50 和100 mg/L 噻蟲嗪處理組中，dsGFP 組死亡率分別為26.79%和52.17%，dsCYP6DV5 組死亡率分別為56.12%和70.66%，dsCYP6DV5 組死亡率顯著高于 dsGFP 組。(圖 5 B)。

3 討論

噻蟲嗪作為第二代新煙堿類殺蟲劑，于21 世紀初在中國推廣使用，由于其良好的殺蟲效果而得以大量推廣，但是靶標害蟲的抗藥性問題也隨之而來，其中煙粉虱作為噻蟲嗪重要的靶標防治害蟲，也產(chǎn)生了嚴重的抗藥性，特別是以逐漸取代B 型煙粉虱進而在中國大面積爆發(fā)的Q 型煙粉虱抗藥性最為嚴重。盡管Q 型煙粉虱在抗藥性能力方面比B 型煙粉虱強[24]，但關于Q 型煙粉虱對于主要防治藥劑的抗藥性機制卻知之甚少。在前期室內(nèi)篩選的噻蟲嗪抗性機制研究中發(fā)現(xiàn)，細胞色素P450 基因參與了煙粉虱對噻蟲嗪抗性的形成[25]，隨后對噻蟲嗪抗性、敏感品系進行的轉(zhuǎn)錄組測序研究結(jié)果表明，細胞色素P450 基因、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶 (GST) 基因等解毒酶基因在噻蟲嗪抗藥性形成機制中發(fā)揮重要作用[26]，在此基礎上通過定量分析發(fā)現(xiàn)了一個CYP4-like 基因可能參與了煙粉虱對噻蟲嗪抗性的形成[25]1，并且進一步通過驗證GST 基因功能，發(fā)現(xiàn)了GST14 也可能與其對噻蟲嗪的抗性形成有關[18]1。

本論文在前期研究基礎上進一步通過對噻蟲嗪抗性、敏感品系煙粉虱的定量PCR 分析，發(fā)現(xiàn)P450 基因CYP6DV5 在對噻蟲嗪產(chǎn)生抗性的煙粉虱成蟲階段具有高表達，說明該基因可能參與了煙粉虱成蟲階段對噻蟲嗪抗性的形成；同時CYP6DV5 基因在煙粉虱成蟲頭部的表達最為豐富，表明該基因可能在頭部行使功能。另外，隨著煙粉虱接觸噻蟲嗪時間的增加，其體內(nèi)CYP6DV5基因相對表達量也逐漸升高，表明該基因具有對噻蟲嗪的響應機制，可能與噻蟲嗪的瞬時解毒代謝相關，最終的RNA 干擾也表明，該基因被敲低后顯著提高了煙粉虱對噻蟲嗪的敏感性，本研究證明了CYP6DV5 基因可能與煙粉虱對噻蟲嗪抗性的形成有關。

煙粉虱作為寄主廣泛的刺吸式害蟲，在進化過程中形成了數(shù)量眾多的細胞色素P450 基因，對于這些基因具體的功能以及相應的調(diào)控機制等有待深入研究，特別是田間煙粉虱環(huán)境復雜，形成抗藥性的機制也很復雜，需要通過一系列的研究才能最終揭示煙粉虱對殺蟲劑的抗藥性及其調(diào)控機制，為田間煙粉虱抗藥性水平的監(jiān)測、合理使用殺蟲劑以及高效防治煙粉虱提供技術支撐。