乳酸鏈球菌素誘導氧化應激促進人骨肉瘤MG63細胞凋亡*

張 晴， 李泳祺， 孫小涵， 葉露雯， 閆勇勇， 黃慶東， 侯 丹

（廣州醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院實驗室，廣州市口腔再生醫(yī)學基礎與應用研究重點實驗室，廣州醫(yī)科大學口腔醫(yī)學院口腔基礎醫(yī)學教研室，廣東廣州510182）

骨肉瘤是一類起源于骨間葉細胞的原發(fā)性惡性骨腫瘤，在兒童和青少年中發(fā)病率較高，由于好發(fā)于血運豐富的干骺端，因此具有較高的肺轉移率（約為10%～20%）和復發(fā)率，成為導致患者死亡的主要原因之一［1］。臨床治療主要以手術切除和化療為主，術后患者5 年總體生存率由20% 提高到60%～70%［2-3］。盡管骨肉瘤治療方案有所改善，但臨床治療仍面臨諸多挑戰(zhàn)，如化療藥物的毒副作用、腫瘤細胞的耐藥性、腫瘤的復發(fā)及肺部轉移等。

乳酸鏈球菌素（nisin）是乳酸鏈球菌（Lactococcuslactis）產生的低分子量五環(huán)抗菌肽，由34 個氨基酸殘基組成，具有廣譜抗菌活性和安全性［4］。1988年被食品和藥品管理局FDA 批準用于食品防腐劑［5］。最近的研究發(fā)現(xiàn)乳酸鏈球菌素具有抑制多種腫瘤細胞（頭頸部鱗狀細胞癌、皮膚癌、結腸癌細胞和人星形細胞瘤細胞等）生長、誘導腫瘤細胞凋亡的作用［6-9］。然而，乳酸鏈球菌素對人骨肉瘤細胞的作用效果及其抗腫瘤的機制還不明確。本研究旨通過觀察乳酸鏈球菌素對人骨肉瘤MG63細胞活力、凋亡及線粒體功能的影響，探討乳酸鏈球菌素誘導的細胞凋亡與細胞氧化應激之間的關系，以期進一步明確其抗腫瘤的作用機制。

材 料 和 方 法

1 實驗材料

乳酸鏈球菌素Z（3.8×107U/g）購自浙江銀象生物工程有限公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、雙抗（青霉素和鏈霉素）和0.25%胰蛋白酶購自Gibco；本研究所使用的抗體均購自Cell Signaling Technology；CCK-8購自日本同仁化學研究所；annexin V-FITC/PI試劑盒、活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）檢測試劑盒［采用2′，7′-二氯熒光素二乙酸酯（2′，7′-dichlorofluorescein diacetate，DCFH-DA）法］和5，5′，6，6′-四氯-1，1′，3，3′四乙基苯并咪唑羰花青碘化物（5，5′，6，6′-tetrachloro-1，1′，3，3′-tetraethyl benzimidazolyl carbocyanine iodide，JC-1）線粒體膜電位（mitochondrial membrane potential，MMP）檢測試劑盒購自上海貝博生物科技有限公司；N-乙酰-L-半胱氨酸（N-acetyl-L-cysteine，NAC）購自碧云天生物技術研究所。人骨肉瘤細胞系MG63 購自中國科學院昆明細胞庫。

2 實驗方法

2.1 細胞培養(yǎng) 細胞使用含有10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。

2.2 CCK-8 實驗檢測細胞活力 細胞傳代接種于96孔板內，待細胞貼壁后，根據(jù)實驗需要加入不同濃度藥物，于細胞培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，加藥后24 h 加入CCK-8（每孔10 μL），繼續(xù)放入培養(yǎng)箱孵育2 h 后，酶標儀測定各孔在450 nm波長處的吸光度（A）值。

2.3 流式細胞術及annexin V-FITC/PI 雙染法檢測凋亡 給予不同濃度的藥物處理細胞后，使用不含EDTA 的胰酶收集細胞，經 PBS 洗滌后，加入 400 μL結合緩沖液重懸，加入Annexin V-FITC 染液避光孵育15 min，隨后加入PI 染液避光染色5 min，流式細胞術檢測細胞凋亡情況。

2.4 DCFH-DA 熒光探針檢測細胞內的ROS 水平經不同濃度藥物處理后，常規(guī)消化離心，重懸浮于DCFH-DA 濃度為 20 mol/L 的 PBS 緩沖液中，培養(yǎng)箱孵育20 min 后，PBS 洗滌細胞1 次，用無血清培養(yǎng)基重懸，流式細胞術檢測細胞內ROS的水平。

2.5 JC-1熒光探針檢測MMP 的變化 細胞經藥物處理后，常規(guī)消化離心，加入JC-1 染色工作液（5 μmol/L），于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15 min，離心收集細胞，500 μL 孵育緩沖液重懸細胞，流式細胞儀檢測。在線粒體膜電位較高時，JC-1聚集在線粒體基質中，形成聚合物，產生紅色熒光，在線粒體膜電位較低時，JC-1 不能聚集在線粒體的基質中，此時JC-1 為單體形式，產生綠色熒光。

2.6 Western blot 檢測凋亡相關蛋白的水平 細胞經藥物處理后，裂解細胞，使用BCA試劑盒進行蛋白定量，加入上樣緩沖液煮樣變性，SDS-PAGE 分離后轉膜，Ⅰ抗封閉過夜，次日Ⅱ抗室溫封閉1 h，加入化學底物發(fā)光液，暗室曝光、顯影、定影，拍照保存。

3 統(tǒng)計學處理

采用GraphPad Prism 6.0 作圖，采用SPSS 21.0軟件統(tǒng)計分析。實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（mean±SD）表示。組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），先檢驗方差齊性，若方差齊則各組均數(shù)間的兩兩比較采用Bonferroni 校正的t檢驗，若方差不齊則使用Dunnett T3 檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 乳酸鏈球菌素對人骨肉瘤MG63 細胞活力及凋亡的影響

不同濃度（0、200、400、600 和800 mg/L）乳酸鏈球菌素處理骨肉瘤MG63細胞24 h，CCK-8實驗檢測乳酸鏈球菌素對細胞活力的影響。結果顯示，當乳酸鏈球菌素的濃度達到400 mg/L 時，細胞活力顯著降低（P＜0.01），隨著給藥濃度的增加，腫瘤細胞的細胞活力顯著降低，呈濃度依賴性，見圖1A。為進一步研究乳酸鏈球菌素是否可以誘導骨肉瘤細胞凋亡，使用annexin V/PI 染色及流式細胞術檢測細胞凋亡率，結果顯示，隨著乳酸鏈球菌素濃度的增加，細胞凋亡率逐漸升高，在600 mg/L 濃度時，細胞的凋亡率顯著上升（P＜0.01），早期凋亡（annexin V+/PI-）和晚期凋亡（annexin V+/PI+）的細胞比例分別達到8.6%和68.3%，見圖1B。Western blot 檢測結果表明，經乳酸鏈球菌素處理骨肉瘤MG63細胞24 h后，抗凋亡蛋白Bcl-2 的表達降低，cleaved caspase-3 的蛋白水平顯著升高（P＜0.01），促凋亡蛋白Bax 與抗凋亡蛋白Bcl-2的比值升高（P＜0.05），見圖1C。

Figure 1.Nisin inhibited the viability and induced the apoptosis of MG63 cells.A：effects of nisin（24 h）on the cell viability（n=5）；B：effects of nisin（24 h）on apoptosis（n=3）；C：the protein levels of Bax，Bcl-2，and cleaved caspase-3 after nisin treatment for 24 h（n=3）.Mean±SD.*P＜0.05，**P＜0.01 vs 0 mg/L group.圖1 Nisin抑制MG63細胞活力并誘導細胞凋亡

2 乳酸鏈球菌素誘導人骨肉瘤MG63 細胞內ROS生成增多和MMP下降

為研究乳酸鏈球菌素對MG63 細胞氧化應激的影響，本實驗通過DCFH-DA 熒光探針檢測不同濃度（0、400和600 mg/L）乳酸鏈球菌素處理骨肉瘤MG63細胞24 h后細胞內ROS水平的變化，結果顯示，隨著乳酸鏈球菌素濃度的增加，細胞內ROS 的生成逐漸增多（P＜0.01），見圖2A。另外本實驗使用JC-1 探針檢測MG63 細胞經不同濃度乳酸鏈球菌素處理24 h后MMP 的變化，結果顯示，隨著給藥濃度的增加，含有JC-1 單體的細胞比例逐漸增多（P＜0.01），且在濃度為600 mg/L 時，含JC-1 單體的細胞比例達到67.6%，表明MG63 細胞經乳酸鏈球菌素處理后，MMP顯著降低，見圖2B。

Figure 2.Nisin promoted reactive oxygen species（ROS）production and reduced mitochondrial membrane potential（MMP）in MG63 cells.A：effects of nisin（24 h）on intracellular ROS level of MG63 cells；B：effects of nisin（24 h）on the MMP.Mean±SD. n=3.**P＜0.01 vs 0 mg/L group.圖2 Nisin促進MG63細胞ROS產生，降低MMP

3 NAC 抑制乳酸鏈球菌素對人骨肉瘤MG63 細胞的促凋亡作用

使用不同濃度的（0、1、2 和5 mmol/L）抗氧化劑NAC 預處理 MG63 細胞 1 h 后，與 800 mg/L 乳酸鏈球菌素聯(lián)合處理細胞24 h，CCK-8 法檢測乳酸鏈球菌素對細胞活力的影響，結果顯示，與單獨乳酸鏈球菌素處理組相比，經NAC 預處理可以顯著減弱乳酸鏈球菌素引起的MG63 細胞活力的降低（P＜0.05），并且當NAC 濃度為5 mmol/L 時抑制效果最為顯著（P＜0.01），見圖3A。同樣地，使用5 mmol/L NAC 預處理細胞MG63 細胞1 h 后，聯(lián)合不同濃度乳酸鏈球菌素處理細胞24 h，經annexin V/PI 染色及流式細胞術檢測細胞凋亡率和Western blot 檢測凋亡相關蛋白的水平。結果表明，與乳酸鏈球菌素單獨處理組相比，NAC 預處理可以顯著抑制乳酸鏈球菌素引起的細胞凋亡率的升高（P＜0.01），促進Bcl-2 的表達，顯著降低cleaved caspase-3的蛋白水平（P＜0.01），Bax/Bcl-2的比值也顯著降低（P＜0.05），見圖3B、C。

4 NAC 降低乳酸鏈球菌素引起的MG63 細胞內ROS水平的增加，恢復MMP

經 5 mmol/L NAC 預處理 MG63 細胞 1 h 后，聯(lián)合600 mg/L 乳酸鏈球菌素處理細胞24 h，DCFH-DA 熒光探針和JC-1 探針分別檢測細胞內ROS 水平和MMP的變化，結果顯示，與單獨乳酸鏈球菌素處理組相比，NAC 預處理可減輕乳酸鏈球菌素引起的ROS水平的增加（P＜0.01），恢復降低的MMP（P＜0.01），見圖4。

討 論

乳酸鏈球菌素是一種天然無毒的低分子量抗菌肽，其抗菌作用機制明確，在食品防腐和胃及十二指腸潰瘍、口腔潰瘍、皮膚病、結核病及乳腺炎臨床治療方面應用廣泛［10-13］。近年來，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)乳酸鏈球菌素可以抑制多種腫瘤的生長，如皮膚癌、頭頸部鱗癌、結腸癌和人星形細胞癌等。本研究結果顯示，乳酸鏈球菌素處理人骨肉瘤MG63細胞24 h后，呈濃度依賴性抑制細胞活性，促進細胞凋亡。

Figure 3.NAC attenuated nisin-induced apoptosis of MG63 cells.A：effects of nisin on cell viability（24 h）with NAC pretreatment（n=5）；B：effects of nisin（24 h）on apoptosis with NAC pretreatment（n=3）；C：the protein levels of Bax，Bcl-2 and cleaved caspase-3 after nisin treatment for 24 h with NAC pretreatment（n=3）.Mean±SD.*P＜0.05，**P＜0.01 vs respective nisin groups（without NAC pretreatment）.圖3 NAC抑制nisin對MG63細胞的促凋亡作用

Figure 4.NAC reduced ROS production caused by nisin and restored the decreased MMP in MG63 cells.A：effects of nisin（24 h）on intracellular ROS level of MG63 cells with NAC pretreatment；B：effects of nisin（24 h）on the MMP with NAC pretreatment.Mean±SD. n=3.**P＜0.01 vs nisin group（without NAC pretreatment）.圖4 NAC降低nisin引起的MG63細胞ROS生成、恢復下降的MMP

機體在有氧代謝過程中會產生ROS，在正常的生理狀態(tài)下，細胞內ROS 的產生和清除系統(tǒng)處于動態(tài)平衡狀態(tài)。但在病理狀態(tài)（如糖尿?。┗蚩鼓[瘤藥物、重金屬、紫外線輻射和空氣污染物等外源因素刺激下，會誘導大量ROS產生，累積的ROS水平超過一定閾值，會導致細胞氧化應激，造成生物大分子和細胞器（如蛋白質、脂質、DNA 和線粒體等）損傷［14-18］。大量研究發(fā)現(xiàn)ROS的形成和積累在介導細胞凋亡中起著至關重要的作用［19］。線粒體是ROS 的主要來源，也是ROS 的主要攻擊目標，ROS 大量產生使線粒體膜通透性改變，導致線粒體膜電位下降，促使線粒體通透性轉換孔大量開放，細胞色素C 和凋亡誘導因子從線粒體內釋放出來，最終觸發(fā)caspase 級聯(lián)反應導致細胞凋亡［20-23］。本研究結果發(fā)現(xiàn)，乳酸鏈球菌素可顯著提高人骨肉瘤MG63 細胞ROS 的產生，降低線粒體膜電位，增加細胞凋亡率，在使用抗氧化劑NAC 后，乳酸鏈球菌素誘導的細胞內積聚的ROS 含量降低，線粒體膜電位基本恢復正常，細胞凋亡率顯著降低，提示在乳酸鏈球菌素的作用下細胞出現(xiàn)了顯著的氧化應激損傷。Western blot 結果顯示，經乳酸鏈球菌素處理后，MG63 細胞的抗凋亡蛋白Bcl-2表達降低，Bax/Bcl-2 的比值顯著升高，促凋亡蛋白cleaved caspase-3 的蛋白水平顯著上調，進一步地，在聯(lián)合使用NAC 后，Bcl-2 表達水平提高，Bax/Bcl-2的比值顯著降低，cleaved caspase-3 的蛋白水平顯著下降。由此，本研究推測，乳酸鏈球菌素可能通過促進細胞氧化應激、激活線粒體凋亡通路而發(fā)揮抗腫瘤作用。

綜上所述，乳酸鏈球菌素可有效降低人骨肉瘤MG63 細胞活力，誘導細胞凋亡，此作用主要與其促進細胞內ROS 生成引發(fā)氧化應激作用，進而激活線粒體凋亡通路有關。本研究為抗菌肽類藥物治療腫瘤提供了理論依據(jù)。