消腫止痛合劑對大鼠隨意皮瓣血管再生的影響*

劉 濤， 姚興璋， 何志軍△， 宋 淵 ， 李 巖， 李金鵬，陳 文， 王海剛， 何元旭

（1甘肅省中醫(yī)院，2甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅蘭州730050）

皮瓣是重大創(chuàng)傷和整形外科重要的修復(fù)手段，然而皮瓣壞死屢見不鮮，因此盡快建立血液循環(huán)是皮瓣成活的關(guān)鍵。血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）-Dll4/Notch 信號通路在血管再生中發(fā)揮著重要作用，近年被研究者重視。中醫(yī)藥在這方面的取得了一定的研究進(jìn)展。前期研究發(fā)現(xiàn)，消腫止痛合劑能促進(jìn)鼠尾再植后的血管修復(fù)，提高VEGF 表達(dá)水平［1］。臨床研究發(fā)現(xiàn)消腫止痛合劑可顯著降低軟組織中腫瘤壞死因子α 和白細(xì)胞介素6的水平，促進(jìn)皮瓣成活，降低轉(zhuǎn)化生長因子β1和單核細(xì)胞趨化蛋白1 等炎癥因子水平，阻止外傷后炎癥介質(zhì)的釋放［2-3］。目前針對中醫(yī)藥通過VEGFDll4/Notch 信號通路調(diào)控皮瓣還鮮見報道。本研究采用大鼠隨意皮瓣模型，利用消腫止痛合劑及聯(lián)合VEGF-Dll4/Notch 信號通路阻斷劑干預(yù)，觀察皮瓣邊緣血管數(shù)量，將進(jìn)一步揭示VEGF-Dll4/Notch 信號通路在皮瓣血管再生中的作用機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 材料

240 只健康SD 大鼠購自甘肅中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心，許可證號為SYXK（甘）2016-0012。VEGF 受體（VEGF receptor，VEGFR）抑制劑axitinib（AXI）和Notch 阻斷劑MK-0752 均購自Selleck；免疫組織化學(xué)染色I(xiàn)I 抗試劑盒（BOSTER）。倒置相差顯微鏡（OLYMPUS）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 動物分組 將240 只大鼠隨機(jī)分為6 組，空白（blank）組、假手術(shù)（sham）組、模型（model）組、消腫止痛合劑組（消腫組，detumescence 組）、消腫止痛合劑+AXI 組（detumescence+AXI 組）和消腫止痛合劑+MK-0752 組（detumescence+MK 組），每組 40 只。各組再按 4 個不同時點(diǎn)分為 5 d、10 d、15 d 和 20 d 亞組，每個亞組10只。

2.2 動物模型的建立 除空白組外所有SD 大鼠禁食6～8 h。術(shù)前行水合三氯乙醛（3 mg/kg）腹腔麻醉，麻醉生效后，行俯臥位固定。于背部形成2 cm×8 cm蒂部位于雙側(cè)髂棘連線上的隨意皮瓣，皮瓣內(nèi)包括背部肉膜層，解剖應(yīng)在背部肌膜的淺面進(jìn)行。結(jié)扎創(chuàng)面較活躍出血點(diǎn)，以確保所形成皮瓣為隨意型皮瓣。皮瓣形成后用1 號縫合線間斷原位縫合。待大鼠麻醉完全恢復(fù)后送回飼養(yǎng)籠、觀察，單籠飼養(yǎng)。術(shù)后每日早上肌注青霉素12×104U，連用3 d。

2.3 藥物處理 消腫止痛合劑由甘肅省中醫(yī)院科研制劑中心制成，注冊文號為甘衛(wèi)普制準(zhǔn)字（1997）-202-04，批號為20051122，規(guī)格為每瓶250 mL。消腫組每日灌胃服用10 mL/kg 消腫止痛合劑（含生藥90 g/L）；消腫+AXI 組每日灌胃服用 10 mL/kg 消腫止痛合劑和 0.03 g/kg 的 VEGFR 抑制劑 AXI；消腫+MK 組每日灌胃服用10 mL/kg消腫止痛合劑和0.03 g/kg的Notch 阻斷劑MK-0752；模型組、空白組和假手術(shù)組每日灌服相應(yīng)體積的蒸餾水。分別服藥5、10、15 和20 d 后分批麻醉并處死大鼠，剝離皮瓣組織多聚甲醛固定或-80℃保存，心臟取血離心分離血清。

2.4 HE 染色 皮瓣組織經(jīng)多聚甲醛固定48 h 后，乙醇梯度脫水，二甲苯透明后進(jìn)行石蠟包埋并切片。將脫水后的切片進(jìn)行脫蠟至水，蘇木素侵染5 min，流水沖洗5 min 后，鹽酸分化5 s，伊紅染液侵染5 min，流水沖洗5 min 后，樹脂封片并進(jìn)行拍照。利用Image-Pro Plus 6.0 軟件計(jì)算皮瓣邊緣新生毛細(xì)血管的數(shù)量（每個高倍鏡視野下的陽性數(shù)目）、微血管密度（高倍鏡視野單位面積下微血管數(shù)目）、微血管管徑及血管成活面積。

2.5 ELISA 檢測血清中VEGF 的含量 根據(jù)說明書運(yùn)用酶標(biāo)儀得出相關(guān)吸光度（A），再根據(jù)公式計(jì)算VEGF含量。

2.6 RT-qPCR 檢測方法 將-80℃保存的皮瓣組織加入液氮研磨，呈粉末狀后，加入1 mL Trizol 裂解液，將細(xì)胞置于冰板裂解5 min 后，將裂解液轉(zhuǎn)移至離心管中-80℃保存。待所有樣品收集完畢后，Trizol 提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。按照TaKaRa Prime Ex TaqTMⅡPCR 試劑盒操作說明進(jìn)行。加樣體積按照說明書進(jìn)行，PCR 條件：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性5 s，60℃退火，40 個循環(huán)，每個循環(huán)31 s，最后進(jìn)行溶解階段。所有結(jié)果經(jīng)GAPDH 內(nèi)參照校正后，ΔΔCt 法計(jì)算最終結(jié)果并采用 2-ΔΔCt表示，引物序列見表1。

表1 RT-qPCR的引物序列Table 1.The sequences of the primers for RT-qPCR

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。組間均數(shù)比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），方差齊者兩組間的差異比較用SNK-q檢驗(yàn)，方差不齊者兩組間的差異比較用Dunnett 法。以P＜0.05 認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 皮瓣毛細(xì)血管充盈時間

第5 天，模型組、消腫組、消腫+MK 組和消腫+AXI 組較空白組和假手術(shù)組毛細(xì)血管充盈時間均顯著延長（P＜0.05）；第10 天，與模型組相比，消腫組毛細(xì)血管充盈時間顯著縮短（P＜0.05），而與消腫組相比，消腫+AXI 組的毛細(xì)血管充盈時間顯著延長（P＜0.05）；第15 和20 天所有組間的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見圖1。

Figure 1.The results of capillary filling time.Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs blank or sham group；#P＜0.05 vs model group；&P＜0.05 vs detumescence group.圖1 毛細(xì)血管充盈時間結(jié)果

2 HE染色的觀察結(jié)果

假手術(shù)組大鼠皮瓣組織細(xì)胞呈單層，排列有序、細(xì)胞核清晰；模型組大鼠皮瓣組織細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞核稀疏，可見明顯水腫，大量白細(xì)胞浸潤；消腫組和消腫+MK 組大鼠皮瓣水腫明顯減輕，組織間隙炎癥細(xì)胞浸潤減少，見圖2～5。

3 藥物處理后微血管數(shù)量、大血管數(shù)量、微血管密度、微血管內(nèi)徑和微血管面積的變化

第5、10、15 和20 天時，與假手術(shù)組比較，模型組微血管數(shù)量、密度和面積均顯著增加，其中第10 天增加最明顯（P＜0.05）；與模型組比較，消腫組微血管數(shù)量、密度和面積增加，其中第10 天增加最明顯（P＜0.05）；與消腫組相比，消腫+AXI 組的微血管數(shù)量、密度和面積顯著減少（P＜0.05）；與消腫組相比，第5天和10 天消腫+MK 組的微血管數(shù)量和密度顯著增加（P＜0.05）；第5、10、15 和20 天大血管數(shù)量和微血管內(nèi)徑在所有組間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性（P＞0.05），見圖6～10。

Figure 2 HE staining results after 5 d of drug treatment（×100）.圖2 藥物處理5 d的HE染色結(jié)果

Figure 3.HE staining results after 10 d of drug treatment（×100）.圖3 藥物處理10 d的HE染色結(jié)果

4 血清中VEGF含量的檢測結(jié)果

第5 天時，模型組VEGF 含量較假手術(shù)組顯著增加（P＜0.05）；當(dāng)加入消腫止痛合劑后，與模型組相比VEGF 含量顯著增加（P＜0.05）；然而加入VEGFR 抑制劑后，消腫止痛合劑引起的VEGF 增加消失，與消腫組相比，消腫+AXI 組VEGF 含量顯著降低（P＜0.05）；加入Notch 阻斷劑后，消腫止痛合劑引起的VEGF增加趨勢進(jìn)一步增加，然而消腫組與消腫+MK組之間并無顯著差異。第10、15 和20 天的結(jié)果與第5天類似。見圖11。

5 皮瓣中 VEGFA、Notch 和 Dll4 mRNA 表達(dá)水平的檢測結(jié)果

第 10 天 時 ，模 型 組 VEGFA、Notch 和 Dll4 的mRNA 表達(dá)量顯著增加，與假手術(shù)組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；當(dāng)利用消腫止痛合劑處理后，VEGFA、Notch 和 Dll4 的 mRNA 表達(dá)量進(jìn)一步增加，與模型組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；然而，當(dāng)加入VEGFR 抑制劑后，消腫止痛合劑引起的VEGFA、Notch和Dll4的mRNA 表達(dá)量增加的趨勢被顯著抑制，與消腫組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；當(dāng)加入Notch 阻斷劑后，消腫止痛合劑引起的VEGFA mRNA 表達(dá)量增加的趨勢更加明顯，而Notch 和Dll4 mRNA 表達(dá)量增加的趨勢被有效抑制（P＜0.05），見圖12。第 15 天時 VEGFA、Notch 和 Dll4 的 mRNA 表達(dá)量與第10天類似，見圖13。

Figure 4.HE staining results after 15 d of drug treatment（×100）.圖4 藥物處理15 d 的HE染色結(jié)果

Figure 5.HE staining results after 20 d of drug treatment（×100）.圖5 藥物處理20 d的HE染色結(jié)果

討 論

皮瓣技術(shù)是顯微外科和矯形外科手術(shù)中重要的技術(shù)之一，用于覆蓋腫瘤切除后大的創(chuàng)口、覆蓋開放性傷口、治療骨髓炎及整形［4-6］。但困擾醫(yī)生的是發(fā)生術(shù)后皮瓣壞死，有研究報道皮瓣壞死發(fā)生率為10%～15%［7］。隨意皮瓣受長寬比例限制，一般不超過2∶1，這就極大地限制了其臨床應(yīng)用。臨床總結(jié)認(rèn)為，血運(yùn)障礙為皮瓣壞死最主要的原因。因此，尋找更好的藥物和方法，改善皮瓣血運(yùn)狀況［8］，盡快促進(jìn)皮瓣血管再生是提高皮瓣成活率的重中之重。

瘀血或血瘀證是皮瓣修復(fù)術(shù)后并發(fā)血管危象的主要病理基礎(chǔ)，活血化瘀法應(yīng)用于皮瓣修復(fù)術(shù)后體現(xiàn)了中醫(yī)辨病辨證施治的原則［9］?！盎钛奔椿钇溲}，改善和促進(jìn)循環(huán)生理功能；“化瘀”即祛其瘀滯，緩解血凝狀態(tài)，解除已經(jīng)發(fā)生的病理狀態(tài)。消腫止痛合劑為甘肅省中醫(yī)院院內(nèi)制劑，由川芎、桃仁、紅花、赤芍、生地、當(dāng)歸、三七、木香、青皮、澤蘭等組成，具有活血化瘀、消腫止痛之功。組方中的川芍、紅花、赤芍、三七等藥物均有單體實(shí)驗(yàn)研究證明對血管有保護(hù)作用并具有抗凝作用；有研究證明川芎提取物川芎嗪可擴(kuò)張血管，增加冠脈血流及腦血流，抑制血小板聚集，降低血小板活性，為一種鈣拮抗劑［10-11］。

血管再生是指原有的血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、游走，形成新的血管網(wǎng)，并在原來存在的血管結(jié)構(gòu)上長出新血管的生物學(xué)過程。VEGF 是目前發(fā)現(xiàn)最強(qiáng)的促血管再生的細(xì)胞因子，具有促血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移、促血管生成、延長血管內(nèi)皮細(xì)胞壽命、提高血管通透性等生物學(xué)作用［12-13］。VEGF-Dll4/Notch 信號通路對血管再生調(diào)節(jié)的具體機(jī)制為：VEGFA 通過與VEGFR2 結(jié)合，刺激并誘導(dǎo)內(nèi)皮頂端細(xì)胞表達(dá)Dll4，Dll4 與鄰近柄細(xì)胞內(nèi)的Notch 信號結(jié)合，通過下調(diào)VEGFR2 和VEGFR1 的表達(dá)水平，抑制頂端細(xì)胞表型，促進(jìn)柄細(xì)胞特化，使二者之間保持在一個合適的比例，以確保血管出芽的精確性［14］。由此可見，VEGF 是 Dll4 的正向調(diào)節(jié)因素，而 Dll4 是 VEGF 信號的負(fù)向調(diào)節(jié)因素［15］。VEGF-Dll4/Notch 信號通路在腫瘤血管再生及抗腫瘤藥物治療方面的研究較多，但是在皮瓣血管再生方面卻未見報道。

Figure 6.Changes in the number of microvessels.Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs sham group；#P＜0.05 vs model group；&P＜0.05 vs detumescence group.圖6 微血管數(shù)量的變化

Figure 7.Changes in the number of large blood vessels.Mean±SD. n=6.圖7 大血管數(shù)量的變化

Figure 8.Changes of microvascular density.Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs sham group；#P＜0.05 vs model group；&P＜0.05 vs detumescence group.圖8 微血管密度的變化

Figure 9.Changes of microvascular diameter.Mean±SD. n=6.圖9 微血管的內(nèi)徑的變化

Figure 10.Changes of microvascular area.Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs sham group；#P＜0.05 vs model group；&P＜0.05 vs detumescence group.圖10 微血管的面積的變化

Figure 11.Determination of VEGF in rat serum.Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs sham group；#P＜0.05 vs model group；&P＜0.05 vs detumescence group.圖11 大鼠血清中VEGF含量的檢測結(jié)果

Figure 12.The mRNA expression of VEGFA，Notch and Dll4 in flap tissues after 10 d of drug treatment.Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs sham group；#P＜0.05 vs model group；&P＜0.05 vs detumescence group.圖12 藥物處理10 d后皮瓣組織中VEGFA、Notch和Dll4的mRNA表達(dá)檢測結(jié)果

Figure 13.The mRNA expression of VEGFA，Notch and Dll4 in flap tissues after 15 d of drug treatment.Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs sham group；#P＜0.05 vs model group；&P＜0.05 vs detumescence group.圖13 藥物處理15 d后皮瓣組織中VEGFA、Notch和Dll4的mRNA表達(dá)檢測結(jié)果

本研究著重研究消腫止痛合劑對VEGF-Dll4/Notch 信號激活與血管新生的作用。皮瓣由于缺血缺氧的發(fā)生會導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡，造成不可逆的損傷，所以臨床治療中需要促進(jìn)血管的新生，保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞完整。本研究發(fā)現(xiàn)，消腫止痛合劑可顯著提高皮瓣成活率，HE染色顯示該藥可增加微血管數(shù)量、密度和面積，減輕炎癥反應(yīng)，增強(qiáng)VEGF的表達(dá)。由于VEGF 是促進(jìn)血管形成的起始關(guān)鍵細(xì)胞因子，可激活Notch 和Dll4 信號，這樣的作用無疑是血管形成的關(guān)鍵。VEGFR 抑制劑可抑制VEGFA、Notch 和 Dll4 的 mRNA 表達(dá)增加，Notch 信號阻斷劑引起對 Notch 和 Dll4 mRNA 的抑制，而 VEGFA 的mRNA 表達(dá)繼續(xù)增加。抑制Dll4/Notch 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)可通過促進(jìn)新生血管和血管生成，提高皮瓣成活率。

綜上所述，消腫止痛合劑可以通過調(diào)控VEGFDll4/Notch 信號，促進(jìn)大鼠皮瓣微血管數(shù)量、密度和面積增加，減輕皮瓣水腫，減少炎癥細(xì)胞浸潤，進(jìn)而促進(jìn)皮瓣的成活。本研究為消腫止痛合劑在皮瓣缺血缺氧治療方面的應(yīng)用提供了初步的研究基礎(chǔ)。