李賽菊，晉孝翠，富國(guó)文，吳玉江，四朗玉珍，蘇宇航，樊月圓*，舒相華，宋春蓮

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)，云南昆明 650201；2.西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，西藏拉薩 850009；3.永仁縣蓮池鄉(xiāng)農(nóng)業(yè)農(nóng)村服務(wù)中心，云南楚雄 651499)

抗生素是臨床上用于細(xì)菌感染的首選藥物，但由于抗生素的濫用導(dǎo)致多重耐藥菌的出現(xiàn)，而中藥及其復(fù)方的抗菌過(guò)程是一個(gè)非常復(fù)雜的過(guò)程，到目前為止鮮有關(guān)于中藥產(chǎn)生耐藥性的報(bào)道，因此中藥成為新型獸藥開(kāi)發(fā)的重中之重。

巖青蘭(DracocephalumrupestreHance,DRH) 隸屬唇形科青蘭屬植物，多分布于海拔1 500 m之上，全草藥用具有疏風(fēng)清熱、涼肝止血之功效，可以清熱消炎、健胃消食[1]，主治外感風(fēng)熱，頭痛寒熱，喉痛咳嗽，黃疸性肝炎，吐血衄血，痢疾[2]。其地上全草富含黃酮類成分[3]，無(wú)明顯的毒副作用[4]。旱辣蓼(PolygonumflaccidumMeisn,PFM)為一年生草本植物， 是一種傳統(tǒng)中藥，多分布于西藏等高海拔地區(qū)。具有除濕化滯等功效, 用于痢疾、腸炎、食滯等[5]。輪葉棘豆(OxytropischiliophyllaRoyle,OCR)為豆科棘豆屬植物，又名莪大夏(藏名)[6]，分布于海拔3 500 m～5 200 m的山坡、河灘，在我國(guó)主要產(chǎn)于西藏西部及新疆[7]。藥性涼，味苦，具有具有清熱解毒，止血消炎，止瀉鎮(zhèn)痛的作用，內(nèi)服治療創(chuàng)傷出血，瘡癤發(fā)炎，腸炎腹瀉，外用可消腫止痛，是常用藏藥[8]。

巖青蘭、旱辣蓼、輪葉棘豆3種藥物在我國(guó)分布廣泛，植物來(lái)源充足，但相關(guān)研究報(bào)道較少，目前在體外抑菌作用方面尚無(wú)研究報(bào)道，與此同時(shí)植物抑菌成分主要為黃酮類、生物堿類、醌類和有機(jī)酸類化合物[9-11]。因此本研究通過(guò)GC-MS技術(shù)對(duì)3種藥物中各類化學(xué)成分進(jìn)行分析，同時(shí)開(kāi)展3種藥物及其復(fù)方乙醇提取物體外抗大腸埃希氏菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和鏈球菌的抑菌作用研究，為開(kāi)發(fā)天然抗菌藥物奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種來(lái)源 大腸埃希氏菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和鏈球菌菌種，均由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室分離鑒定保存。

1.1.2 藥材 輪葉棘豆地上部分，巖青蘭全草和旱辣蓼根部于2019年2月在西藏采集，由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)中獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室鑒定后干燥，粉碎過(guò)100目篩備用。

1.1.3 主要試劑 LB培養(yǎng)基，廣州環(huán)凱微生物科技有限公司產(chǎn)品；溴甲酚紫指示劑，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；無(wú)水乙醇，成都市科隆化學(xué)品有限公司產(chǎn)品；石油醚，無(wú)錫市亞盛化工有限公司產(chǎn)品。

1.1.4 主要儀器 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RE52CS)，上海亞榮生物化學(xué)設(shè)備廠產(chǎn)品；鼓風(fēng)干燥箱DH(G-9240A)、電熱恒溫培養(yǎng)箱(HP-92272)，上海一恒科技有限公司產(chǎn)品；色譜儀(Eppendorf UltiMate 3000 RS)、高分辨質(zhì)譜儀(QExactive)，賽默飛世爾科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 提取物制備 分別準(zhǔn)確稱取輪葉棘豆、巖青蘭、旱辣蓼藥粉100 g和1∶1∶1比例的復(fù)方藥物100 g，按照料液比為1∶30的比例加入濃度為700 mL/L的乙醇，60 ℃超聲提取30 min，重復(fù)提取2次。負(fù)壓抽濾后置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮，經(jīng)石油醚萃取后揮干石油醚，所得的濃縮藥液于鼓風(fēng)干燥箱中干燥至浸膏，4 ℃保存。

1.2.2 GC-MS分析 取適量旱辣蓼、輪葉棘豆、巖青蘭提取物膏劑，加入1 mL甲醇∶水(8∶2，V∶V)渦旋混勻；加入二氧化鋯研磨珠研磨后，4 ℃ 20 000 r/min離心10 min；上清液經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾后上機(jī)分析。以電噴霧電離源(ESI)為離子源，正負(fù)離子切換掃描采集數(shù)據(jù)，利用ACQUITY UPLCHSS T3色譜柱進(jìn)行分析。采集的數(shù)據(jù)通過(guò)整理后進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)檢索比對(duì)，對(duì)質(zhì)譜鑒定到的分析物進(jìn)行質(zhì)譜結(jié)構(gòu)解析并選取具有生物活性的化合物進(jìn)行分析。

1.2.3 提取物體外抑菌試驗(yàn) 分別取適量滅菌蒸餾水配置成1 g/mL的藥液和適量滅菌生理鹽水配置成108CFU/mL濃度的菌液。將含10 g/L葡萄糖的LB肉湯和和配置好的1 g/mL的藥液按照二倍稀釋法稀釋10個(gè)濃度，取100 μL菌液加入到10個(gè)濃度的試管中，另取2管分別為單純藥物和單純LB肉湯培養(yǎng)基對(duì)照?；靹蚝蟮渭?滴2 mg/mL溴甲酚紫指示劑，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)18 h～24 h，觀察變色結(jié)果。選取剛好未變色的試管濃度作為最小抑菌濃度，采用打孔法進(jìn)行最小抑菌濃度抑菌圈測(cè)定，參考相關(guān)文獻(xiàn)[12]判斷標(biāo)準(zhǔn)：抑菌圈直徑≥20 mm為極敏(+++)，15 mm≤抑菌圈直徑<20 mm為高敏(++)，10 mm≤抑菌圈直徑<15 mm為中敏(+)，10 mm以下的為低敏(-)。從所得MIC值以上濃度的所有未變色試管中取100 μL涂布于LB固體培養(yǎng)基上進(jìn)行MBC值的測(cè)定。

2 結(jié)果

2.1 提取物GC-MS分析結(jié)果

如表1和圖1所示，通過(guò)對(duì)巖青蘭、旱辣蓼、輪葉棘豆乙醇提取物石油醚萃取部位正負(fù)離子模式下采集的總離子流圖、相關(guān)文獻(xiàn)和數(shù)據(jù)庫(kù)檢索及分析，巖青蘭、旱辣蓼、輪葉棘豆中分別鑒定了13、19、15種化合物。

表1 巖青蘭、旱辣蓼和輪葉棘豆提取物抑菌活性成分質(zhì)譜結(jié)構(gòu)解析

總離子流圖上半部分為正離子圖，下半部分為負(fù)離子圖；A.巖青蘭;B.旱辣蓼;C.輪葉棘豆

2.2 提取物抑菌試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 MIC和MBC值測(cè)定結(jié)果 結(jié)果如表2，復(fù)方提取物對(duì)鏈球菌抑制效果最好，巖青蘭提取物對(duì)金黃色葡萄球菌抑制效果最好，巖青蘭和復(fù)方提取物對(duì)大腸埃希氏菌抑制效果最好，復(fù)方提取物對(duì)沙門氏菌抑制效果最好。

2.2.2 MIC抑菌圈測(cè)定結(jié)果 3種藥物及其復(fù)方提取物對(duì)4種常見(jiàn)菌的MIC抑菌圈測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。根據(jù)判斷標(biāo)準(zhǔn)，巖青蘭提取物對(duì)金黃色葡萄球菌，復(fù)方提取物對(duì)沙門氏菌和金黃色葡萄球菌高度敏感，其抑菌圈大小在15.03 mm～18.75 mm之間。其他均為中度敏感，抑菌圈大小在10.12 mm～15 mm之間。

表2 3種藥物及其復(fù)方提取物對(duì)4種常見(jiàn)菌的MIC、MBC值測(cè)定

表3 3種藥物及其復(fù)方提取物對(duì)4種常見(jiàn)菌的MIC抑菌圈測(cè)定

3 討論

大腸埃希氏菌、沙門氏菌、鏈球菌和金黃色葡萄球菌為養(yǎng)殖生產(chǎn)中常見(jiàn)的病原菌，但由于抗生素的不規(guī)范使用造成病原菌耐藥性的產(chǎn)生[13-14]，因此探求安全有效的抗生素替代藥物成為新獸藥開(kāi)發(fā)的熱點(diǎn)之一，而中藥藥理機(jī)制復(fù)雜，藥效與其本身所含的活性物質(zhì)息息相關(guān)。由表1可知，鑒定出的13種巖青蘭化合物中黃酮類化合物9種，醌類化合物2種，生物堿類化合物2種，除丁聰?shù)萚15]和任冬梅等[3]鑒定出的北美圣草素、木犀草素、柚皮素和郝娜等[16]鑒定出的圣草酚以外，化合物1、2、3、4、5、9、13、15、19、20均為首次分離鑒定所得；鑒定出的19種旱辣蓼化合物中黃酮類化合物12種，有機(jī)酸類化合物2種，醌類化合物2種，生物堿類化合物3種，均為首次鑒定所得，分別為化合物1、2、4、5、6、7、10、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23；鑒定出的15種輪葉棘豆化合物中黃酮類化合物13種，醌類化合物1種，生物堿類化合物1種，除姚淑英等[5]鑒定出的槲皮素，格桑羅布等[17]和Liu Y等[18]鑒定出的(2S)-5，7-二羥基黃酮(白楊素)以外，化合物2、5、6、7、8、10、11、12、13、14、15、19和22均為首次鑒定所得。

體外抑菌試驗(yàn)結(jié)果表明，3種藥物及其復(fù)方提取物對(duì)金黃色葡萄球菌和鏈球菌抑制作用比對(duì)大腸埃希氏菌、沙門氏菌的抑制作用強(qiáng)。另外，3種藥物及其復(fù)方提取物對(duì)大腸埃希氏菌的最小抑菌濃度皆大于沙門氏菌，可能是由于人類和動(dòng)物長(zhǎng)期食用含有生物活性成分的植物而導(dǎo)致體內(nèi)的大腸埃希氏菌產(chǎn)生了一定的耐藥性。3種藏藥及其復(fù)方提取物對(duì)4種常見(jiàn)菌均有良好的抑制效果，可能是由于3種藥物中含有多種具有抑菌活性的化學(xué)成分。洪志偉等[19]研究表明，槲皮素可能通過(guò)破壞細(xì)菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)、改變細(xì)菌蛋白的表達(dá)譜， 進(jìn)而對(duì)大腸埃希氏菌產(chǎn)生明顯的抑制作用；董曉寧等[20]通過(guò)平板稀釋法考察了苦蕎麥中提取的蘆丁對(duì)大腸埃希氏菌和金黃色葡萄球菌抑制作用顯著；周紅潮[21]觀察到黃芩苷對(duì)大腸埃希氏菌、傷寒沙門氏菌、金黃色葡萄球菌均有抑制作用；Chen Y X等[22]則表明黃芩苷對(duì)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌有很強(qiáng)的影響，最低抑菌濃度達(dá)到0.04 mg/mL；徐進(jìn)[23]試驗(yàn)結(jié)果表明，1 MIC的姜黃素對(duì)濃度為1×107CFU/mL的金黃色葡萄球菌抑菌作用最為明顯(P<0.05)；劉明[24]研究發(fā)現(xiàn),大黃素對(duì)MRSA252標(biāo)準(zhǔn)株與36株MRSA臨床分離株MIC為2 μg/mL～8 μg/mL、MBC為4 μg/mL～32 μg/mL。通過(guò)對(duì)巖青蘭、旱辣蓼、輪葉棘豆乙醇提取物化學(xué)成分分析和對(duì)4種常見(jiàn)病原菌的體外抑菌試驗(yàn)，表明3種藥物及其復(fù)方提取物對(duì)4種常見(jiàn)菌均有良好的抑制效果，但由于中藥成分復(fù)雜，其抑菌機(jī)理有待進(jìn)一步的研究。