孟令宅，龐洪澤，趙 卓，趙 款,2﹡，袁萬(wàn)哲,2﹡

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，河北保定 071001，2.河北省獸醫(yī)生物技術(shù)創(chuàng)新中心,河北保定 071001，3.北京華夏興洋生物科技有限公司，北京 102629)

新城疫(Newcastle disease，ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)引起雞、鴨、鵝、火雞等多種禽類的一種烈性傳染病，臨床主要表現(xiàn)為高熱、呼吸困難、下痢、腸道黏膜出血，并伴有一定的神經(jīng)癥狀。新城疫是世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)規(guī)定的必須報(bào)告的動(dòng)物疫病，我國(guó)將其列為一類動(dòng)物疫病，對(duì)我國(guó)養(yǎng)禽業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[1-3]。新城疫病毒于1926年在印度的爪哇和英國(guó)的新城被發(fā)現(xiàn)，之后在全世界廣泛流行[4]。根據(jù)對(duì)雞的致病性，NDV分為強(qiáng)毒株、中等毒株以及弱毒株[5-7]。研究表明，F(xiàn)蛋白的112-117裂解位點(diǎn)是NDV致病性的主要分子決定因素[8]，強(qiáng)毒株的序列通常為112R/K-R-Q-R/K-R-F117，可被全身組織細(xì)胞內(nèi)的裂解酶裂解，可以引起全身組織器官的感染；弱毒株的序列通常為112G/E-K/R-Q-G/E-R-L117，其中112位點(diǎn)的G及117位點(diǎn)的L使得F蛋白對(duì)細(xì)胞內(nèi)裂解酶不敏感，而更依賴于呼吸道及腸道的細(xì)胞外蛋白酶裂解，雞感染后只表現(xiàn)出一些輕微的呼吸道及腸道癥狀。NDV只有一個(gè)血清型，根據(jù)其基因組長(zhǎng)度可分為兩大分支，即ClassⅠ與ClassⅡ。ClassⅠ一般為低毒力或無(wú)毒力的毒株，多從水禽中分離；歷史上引起全世界范圍內(nèi)新城疫4次大流行的毒株均屬于ClassⅡ分支，目前該分支已發(fā)現(xiàn)至少包含18個(gè)基因型[9]，我國(guó)雞群中主要流行的是ClassⅡ中的基因Ⅶ型強(qiáng)毒株，優(yōu)勢(shì)亞型為Ⅶd和Ⅶe[10]，各基因型之間不能提供較好地交叉保護(hù)。由于疫苗免疫壓力下，新城疫常表現(xiàn)為非典型臨床癥狀，同時(shí)易與其他病原發(fā)生混合感染，如大腸埃希氏菌、禽流感病毒、雞傳染性支氣管炎病毒等，不僅增加了臨床的診斷難度，還造成緊急免疫接種失敗[11]。非典型新城疫使得傳統(tǒng)疫苗受到挑戰(zhàn)，現(xiàn)有疫苗無(wú)法提供完全保護(hù)，應(yīng)迫切開發(fā)新型疫苗來(lái)應(yīng)對(duì)新城疫的防控。

1 病原分子特征

NDV為副黏病毒科禽腮腺炎病毒屬成員，為有囊膜的單股負(fù)鏈RNA病毒，病毒粒子呈球形，直徑為150 nm～250 nm，目前已知的NDV基因組長(zhǎng)度有3種,即15 186 nt、15 192 nt和15 198 nt[12-14]。NDV的復(fù)制嚴(yán)格遵循“六堿基原則”，即只有在基因組大小為6個(gè)核苷酸的倍數(shù)時(shí)才能進(jìn)行有效復(fù)制。NDV基因組編碼6種病毒結(jié)構(gòu)蛋白[15]，分別為核衣殼蛋白(NP)、磷酸化蛋白(P)、基質(zhì)蛋白(M)、融合蛋白(F)血凝素-神經(jīng)氨酸酶蛋白(HN)及依賴RNA的RNA聚合酶(L)。NDV基因組3'端有長(zhǎng)為55 nt的引導(dǎo)序列，5'端有長(zhǎng)為114 nt的尾隨序列，兩端的序列存在廣泛的堿基互補(bǔ)現(xiàn)象，為病毒的重要調(diào)控區(qū)。內(nèi)部蛋白NP、P和L可形成核糖核蛋白復(fù)合物(RNP)，該復(fù)合物是轉(zhuǎn)錄模板也是翻譯模板。此外，P基因還可通過(guò)RNA編輯機(jī)制編碼產(chǎn)生非結(jié)構(gòu)蛋白V和W[16],可防止NP蛋白對(duì)其他蛋白的“非法”衣殼化。M、F和HN為病毒的外部蛋白，F(xiàn)蛋白和HN蛋白是決定NDV毒力的兩個(gè)重要蛋白，其中F蛋白為NDV表面糖蛋白，可介導(dǎo)與宿主細(xì)胞的融合，HN蛋白是一種多功能蛋白，可根據(jù)其多肽的長(zhǎng)度分為HN616、HN577及HN571等，其功能包括識(shí)別宿主細(xì)胞受體，去除受體，防止自組裝以及與F蛋白相互作用促進(jìn)融合[17-18]。M蛋白位于囊膜內(nèi)側(cè)面，在病毒RNA的合成調(diào)控和感染性粒子的組裝方面起著重要作用，M蛋白還是病毒脂質(zhì)囊膜內(nèi)表面的支持物，能夠維持病毒結(jié)構(gòu)的完整性[19]。

2 傳統(tǒng)疫苗

2.1 滅活疫苗

滅活疫苗是將病毒滅活之后與相應(yīng)佐劑按一定比例混合制備的疫苗，最為常見的是油乳劑滅活疫苗，滅活疫苗安全性高，無(wú)毒力返強(qiáng)風(fēng)險(xiǎn)，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈的體液免疫應(yīng)答。目前，我國(guó)審批通過(guò)的滅活疫苗毒株主要包括La Sota株、Ulster 2C株、A-Ⅶ株以及相應(yīng)的多聯(lián)疫苗株等。白軍等[20]使用滅活的La Sota疫苗免疫SPF雞，結(jié)果表明當(dāng)NDV HI ≥ 4 log2時(shí)，攻毒保護(hù)率為80%；NDV HI≥5 log2時(shí)，保護(hù)率可達(dá)100%。近年來(lái)，由于NDV出現(xiàn)不同的基因型，且不同基因型之間存在較大抗原性差異，研究人員對(duì)新城疫滅活疫苗的研究主要集中在不同基因型的病毒多價(jià)苗、新城疫病毒與其他病原多聯(lián)苗等方面。劉長(zhǎng)清等[21]用雞新城疫(基因Ⅶ型)、禽流感(H9亞型)二聯(lián)滅活疫苗(aSG10株+G株)免疫雞群，免疫后2周，NDV HI平均抗體水平可達(dá)10.9 log2，接種4周達(dá)到峰值11.0 log2，取得了良好的免疫效果。但滅活疫苗在使用過(guò)程中也存在一些問(wèn)題，例如礦物油的副作用對(duì)機(jī)體的損害較大，不同免疫劑量組差異顯著，不能誘導(dǎo)細(xì)胞免疫等缺點(diǎn)和不足。

2.2 弱毒疫苗

弱毒疫苗通常是用某些具有良好免疫原性的自然弱毒株或者經(jīng)過(guò)人為改造致弱的毒株增殖培養(yǎng)后制成的疫苗。接種后疫苗毒能在體內(nèi)復(fù)制，可同時(shí)誘導(dǎo)機(jī)體的體液免疫、細(xì)胞免疫以及局部黏膜免疫。我國(guó)審批通過(guò)的弱毒疫苗毒株主要包括Ⅰ系(Mukteswar株)、Ⅱ系(B1株)、Ⅲ系(F株)、Ⅳ系(La Sota株)、Clone-30株及耐熱毒株V4等，尚無(wú)基因Ⅶ型的弱毒疫苗株。其中Ⅰ系苗屬于中等毒力疫苗株，不適用于雛雞和產(chǎn)蛋雞的免疫，一般用于日齡較大的青年雞的免疫，免疫后雞產(chǎn)生抗體較快，持續(xù)時(shí)間可為3周～5周。Ⅱ系、Ⅲ系和Ⅳ系苗毒力均低于Ⅰ系株，可采用滴鼻、點(diǎn)眼、噴霧、飲水等多種方式進(jìn)行免疫。但弱毒疫苗在臨床生產(chǎn)應(yīng)用中也存在一些風(fēng)險(xiǎn)和缺點(diǎn)，如免疫應(yīng)激、易受飼養(yǎng)環(huán)境影響、存在毒力返強(qiáng)等風(fēng)險(xiǎn)。仇旭升等[22]通過(guò)分析基因Ⅲ型新城疫強(qiáng)毒分離株Js/7/05/Ch和JS/9/05/Go與中等毒力疫苗株Mukteswar的親緣性關(guān)系，發(fā)現(xiàn)2株強(qiáng)毒分離株與Mukteswar的全基因組核苷酸同源性均為99.7%，氨基酸同源性為98.8%～99.8%，然而雞胚平均致死時(shí)間(mean death time，MDT)、1日齡雞腦內(nèi)接種致病指數(shù)(intracerebral pathogenicity index，ICPI)和6周齡雞靜脈接種致病指數(shù)(intravenous pathogenicity index，IVPI)均顯著強(qiáng)于Mukteswar疫苗株，推斷分離株JS/7/05/Ch和JS/9/05/Go是由疫苗株Mukteswar自然進(jìn)化而來(lái)的返強(qiáng)毒株，所以需要進(jìn)一步研制新型疫苗來(lái)更好地控制ND流行。

3 基因工程疫苗

3.1 亞單位疫苗

亞單位疫苗是利用原核或真核表達(dá)載體體外高效表達(dá)NDV的保護(hù)性抗原基因，并將獲得的重組蛋白輔以佐劑制成的疫苗。王興龍等[23]將F基因插入到pFastBad質(zhì)粒中，利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)制備了亞單位疫苗株，免疫后可以產(chǎn)生較好的保護(hù)效果，能抵抗新城疫病毒強(qiáng)毒的攻擊；Khulape S A等[24]將編碼F基因的重組質(zhì)粒(pcDNA3.1-F)和表達(dá)F基因的重組蛋白(pcDNA3.1-F-protein)聯(lián)合后制備亞單位疫苗，同時(shí)設(shè)置重組質(zhì)粒(pcDNA3.1-F)或重組蛋白(pcDNA3.1-F-protein)單獨(dú)免疫組，3組分別免疫14日齡SPF雞后發(fā)現(xiàn)，pcDNA3.1-F組、pcDNA3.1-F-protein組和聯(lián)合組的免疫保護(hù)率分別為66.6%、83.3%和91.6%，聯(lián)合組免疫機(jī)體后，通過(guò)MHCⅠ和MHCⅡ途徑可以迅速誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞增殖活化，啟動(dòng)機(jī)體的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答，可更好的實(shí)現(xiàn)全面保護(hù)。亞單位疫苗在預(yù)防和治療方面有較大優(yōu)勢(shì)，但在制備工藝、免疫劑量上成本較大，因此目前較難得到廣泛應(yīng)用。

3.2 重組活載體疫苗

利用皰疹病毒、痘病毒等作為載體，插入新城疫病毒的保護(hù)性抗原基因構(gòu)建的重組活載體病毒疫苗，試用于臨床免疫，在被接種雞體內(nèi)抗原得到大量表達(dá)，能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，使雞得到免疫保護(hù)，這就是重組活載體疫苗[25-26]。相比傳統(tǒng)疫苗，重組活載體疫苗有一定優(yōu)勢(shì)，如免疫機(jī)體后，僅會(huì)產(chǎn)生針對(duì)病毒某一結(jié)構(gòu)蛋白的單一抗體，易于區(qū)分野毒感染和疫苗免疫；其次，可以在載體插入其他病原的保護(hù)性抗原基因，達(dá)到同時(shí)預(yù)防多種疾病的目的。智海東等用共表達(dá)新城疫病毒F基因和雞傳染性喉氣管炎病毒gB基因的重組痘病毒(rFPV-gB-F)，對(duì)28日齡SPF雞進(jìn)行免疫攻毒試驗(yàn)，結(jié)果表明攻毒保護(hù)率均在80%以上，取得了良好的免疫效果。傳統(tǒng)疫苗可以減少感染動(dòng)物的死亡率，抑制組織臟器的嚴(yán)重病變，但免疫動(dòng)物往往表現(xiàn)排毒散毒，而重組活載體疫苗可以顯著減少動(dòng)物的排毒散毒，降低其他動(dòng)物的感染風(fēng)險(xiǎn)，所以有研究者將二者聯(lián)合起來(lái)，使其發(fā)揮各自的優(yōu)勢(shì)。Palya V等[27]將表達(dá)F蛋白的火雞皰疹病毒重組載體活疫苗rHVT-ND免疫21日齡SPF雞，同時(shí)設(shè)置與傳統(tǒng)疫苗聯(lián)合免疫組，結(jié)果表明聯(lián)合免疫組的保護(hù)率可達(dá)95%以上，免疫持續(xù)期可以達(dá)72周，排毒量顯著減少?；钶d體疫苗所表達(dá)的抗原以半復(fù)制的方式遞呈給宿主，可同時(shí)誘導(dǎo)體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答，還可以與傳統(tǒng)疫苗聯(lián)合使用，便于開發(fā)多價(jià)苗和多聯(lián)苗，是未來(lái)的疫苗研究熱點(diǎn)之一。

3.3 新城疫病毒載體疫苗

NDV的P基因和M基因之間可嵌入3 kb左右的外源基因片段[28]。NDV作為載體具有一些優(yōu)勢(shì)。首先，NDV為負(fù)鏈RNA病毒，整個(gè)復(fù)制過(guò)程在細(xì)胞漿中進(jìn)行，不產(chǎn)生DNA，消除了與宿主細(xì)胞DNA整合的可能性，安全性高，遺傳穩(wěn)定性好。第二，呼吸道和消化道為多種禽類病原微生物感染宿主的主要途徑，而NDV不僅能夠在其中較好的增殖，還可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈的細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答。第三，NDV還可以在多種細(xì)胞系及雞胚中增殖并能達(dá)到很高的病毒滴度，便于大規(guī)模生產(chǎn)和應(yīng)用。第四，NDV還可以誘生干擾素，以其為載體制備的疫苗可用于緊急免疫。Nagy A等[29]以La Sota疫苗株為骨架，構(gòu)建表達(dá)禽流感病毒H9亞型血凝素(HA)的重組病毒，其在雞胚上有較高的生長(zhǎng)滴度，免疫雞后抗體水平H9 HI可達(dá)8.3 log2，NDV HI可達(dá)7.5 log2,可以抵抗致死劑量NDV和AIV的攻擊。Tian K Y等[30]構(gòu)建了1株可以表達(dá)禽腺病毒4型fiber-2基因的重組NDV，用100 μL(107EID50)的免疫劑量免疫，然后分別用105TCID50的禽腺病毒4型強(qiáng)毒CH/HNJZ/2015株和104EID50的新城疫病毒強(qiáng)毒F48E9株進(jìn)行攻擊，存活率均為100%，取得了良好的免疫效果。Chen X等[31]利用反向遺傳學(xué)拯救出表達(dá)非洲豬瘟病毒p72蛋白的重組新城疫病毒rNDV/p72，通過(guò)雞胚傳代10次仍具備良好的增殖特性，將rNDV/p72免疫小鼠后，產(chǎn)生了高滴度的IgG抗體，同時(shí)可促進(jìn)T細(xì)胞增殖活化，IFN-γ和IL-4表達(dá)水平上升。

3.4 病毒樣顆粒疫苗

病毒樣顆粒(virus-like particles，VLPs)是利用異源宿主系統(tǒng)表達(dá)一種或幾種病毒結(jié)構(gòu)蛋白，使其自動(dòng)裝配成在形態(tài)上類似于天然病毒的空心顆粒。VLPs可刺激產(chǎn)生體液免疫、細(xì)胞免疫和黏膜免疫應(yīng)答，同時(shí)能作為載體表達(dá)其他抗原，也可設(shè)計(jì)成為區(qū)分野毒感染與免疫接種的疫苗株，具有很好的發(fā)展前景[32]。Pantua等證實(shí)NDV的M蛋白是促進(jìn)病毒出芽和釋放的主要驅(qū)動(dòng)力，在HN、F和NP的參與下，可以形成與真實(shí)病毒粒子大小、形態(tài)、功能類似的VLPs。Qian J等[33]發(fā)現(xiàn)NDV VLPs通過(guò)上調(diào)MHCⅡ和共刺激分子以及通過(guò)TLR4/NF-κB途徑促炎的細(xì)胞因子來(lái)有效激活DC，進(jìn)而起到更好的免疫效果。此外，NDV VLPs還可誘導(dǎo)DC成熟和遷移，激活CD4+T細(xì)胞，從而誘導(dǎo)IFN-γ和IL-4水平上的升高。Wu X等[34]將雞傳染性支氣管炎病毒(Infectious bronchitis virus，IBV)S1蛋白和新城疫病毒F蛋白分別連于IBV S蛋白的跨膜區(qū)和胞外域，構(gòu)建了新型嵌合傳染性支氣管炎-新城疫(IB-ND)病毒樣顆粒(VLPs)疫苗，用不同劑量(50、75、100 μg)免疫SPF雞后，分別用IBV和NDV強(qiáng)毒攻擊，結(jié)果顯示當(dāng)免疫劑量為100 μg 時(shí)，保護(hù)率均為100%，且組織和泄殖腔中病毒RNA水平明顯降低，表明嵌合IB-ND VLP具有良好的免疫原性，免疫動(dòng)物后可以抵抗強(qiáng)毒攻擊。盡管VLPs具備安全、穩(wěn)定、免疫原性好以及不依賴雞胚等優(yōu)勢(shì)，但在生產(chǎn)成本、表達(dá)量上還是存在一定的缺陷，因此，真正運(yùn)用到臨床生產(chǎn)，還需要進(jìn)一步優(yōu)化生產(chǎn)成本及制備工藝。

3.5 核酸疫苗

新城疫核酸疫苗的原理是將表達(dá)F或HN基因的真核表達(dá)載體導(dǎo)入機(jī)體，使其在體內(nèi)大量表達(dá)，激發(fā)特異性免疫應(yīng)答。李楠等[35]將穩(wěn)定表達(dá)NDV HeB02株F基因的真核表達(dá)質(zhì)粒pSV-F采用活體電擊法免疫3周齡SPF雞，以100EID50劑量攻毒后，免疫組未分離到病毒；姜永厚等構(gòu)建了共表達(dá)IL-2、NDVF基因的重組質(zhì)粒，免疫SPF雞后，然后用NDV強(qiáng)毒株F48E9攻擊，結(jié)果共表達(dá)重組質(zhì)粒組的免疫保護(hù)率顯著高于單獨(dú)接種F基因組，證實(shí)所克隆的IL-2有免疫增強(qiáng)作用，表明核酸疫苗可以通過(guò)優(yōu)化質(zhì)?；騺?lái)增強(qiáng)抗原遞呈細(xì)胞的識(shí)別能力，進(jìn)而提高疫苗的免疫效果；Zhao K等[36]將不同數(shù)量的C3d插入表達(dá)NDVF基因的真核表達(dá)載體PVAXI中，使用N-2-羥丙基三甲基氯化銨殼聚糖納米粒子為佐劑，細(xì)胞轉(zhuǎn)染試驗(yàn)表明，pVAXI-F-C3d6表達(dá)量最高，通過(guò)滴鼻途徑免疫產(chǎn)生了高水平的IgG和sIgA，使用NDV強(qiáng)毒株F48E9攻擊，保護(hù)率在80%以上，表明氯化銨殼聚糖納米粒子可作為有效的免疫佐劑，在疫苗和藥物方面有廣闊則應(yīng)用前景。核酸疫苗具有免疫應(yīng)答持久、無(wú)散毒和毒力返強(qiáng)的危險(xiǎn)，不引起宿主自身免疫病等諸多優(yōu)點(diǎn)，但也存在免疫應(yīng)答較弱、容易引起免疫耐受、價(jià)格昂貴的缺點(diǎn)和不足，真正運(yùn)用到臨床實(shí)際應(yīng)用還需要進(jìn)一步研究和探索。

4 展望

目前，國(guó)內(nèi)外一直廣泛應(yīng)用的La Sota、Clone30等疫苗株仍然是上世紀(jì)50年代流行的基因Ⅱ和Ⅰ型毒株，不能有效防控基因Ⅶ型毒株，導(dǎo)致臨床上多見非典型新城疫與高抗體家禽發(fā)生NDV感染。滅活疫苗存在副作用較大，不能誘導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答等缺點(diǎn)，弱毒活疫苗存在毒力返強(qiáng)風(fēng)險(xiǎn)、易與其他病原菌混合感染；亞單位疫苗、病毒樣顆粒疫苗與核酸疫苗雖然在免疫原性、安全性、刺激細(xì)胞免疫應(yīng)答等方面有一定優(yōu)勢(shì)，但在生產(chǎn)成本、表達(dá)量等方面還存在一定缺陷。利用反向遺傳技術(shù)構(gòu)建的新城疫病毒載體疫苗株可以提供較高的保護(hù)率，但目前尚無(wú)針對(duì)新城疫的標(biāo)記疫苗株，未來(lái)研發(fā)重點(diǎn)是研發(fā)針對(duì)該病的表位缺失或基因缺失的標(biāo)記疫苗毒株上，同時(shí)在已建立的反向遺傳操作平臺(tái)的基礎(chǔ)上，研發(fā)不同基因型的多價(jià)苗、多聯(lián)苗。此外，使用雞胚生產(chǎn)，成本較高。對(duì)于細(xì)胞培養(yǎng)NDV的技術(shù)尚未取得實(shí)質(zhì)性突破，應(yīng)進(jìn)一步優(yōu)化生產(chǎn)工藝，以研制出安全、高效、價(jià)格低廉、生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單、適用的NDV疫苗，使我國(guó)基因Ⅶ型新城疫得到有效防控。