菌酶協(xié)同處理優(yōu)化亞麻籽粕風(fēng)味的工藝研究

周彩瑩，零春甜，李欣憶，程鵬，汪建明*，鄭志強(qiáng)

（1.天津科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，天津 300457；2.天津市利民調(diào)料有限公司，天津 300000；3.軍事科學(xué)院系統(tǒng)工程研究院軍需工程技術(shù)研究所，北京 100010）

亞麻又稱胡麻，是世界上最古老的經(jīng)濟(jì)作物之一。亞麻籽粕是亞麻籽油提取后的副產(chǎn)物，蛋白資源豐富[1]，其含量占亞麻籽粕的41.45%[2]，并且該蛋白質(zhì)具有良好的乳化、保水、溶解和泡沫穩(wěn)定性[3]；亞麻籽粕中氨基酸含量極高，組成和比例接近世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）規(guī)定的適宜人體氨基酸模式的要求[4]。但是，目前亞麻籽粕通常被當(dāng)作垃圾或動(dòng)物飼料處理，價(jià)值低廉，造成了資源浪費(fèi)。

黑曲霉菌作為世界公認(rèn)的安全可食用性霉，主要分泌酸性蛋白酶，符合食品安全的需求[5]，并且所得水解物蛋白質(zhì)含量高[6-7]。酸性蛋白酶和中性蛋白酶共同作用亞麻籽粕有利于游離氨基酸的釋放和特征風(fēng)味的形成[8]。馮金曉等[9]利用中性蛋白酶對(duì)紅島蛤蜊進(jìn)行酶解，測(cè)得的氨基態(tài)氮含量是1.094 g/100 g。李業(yè)祿等[10]采用4種酶對(duì)菜籽粕進(jìn)行單酶和復(fù)合酶處理，結(jié)果表明復(fù)合酶水解產(chǎn)生的效果優(yōu)于單酶；馮結(jié)鏵等[11]利用超聲輔助酶解法酶解亞麻籽粕，結(jié)果表明在復(fù)合蛋白酶添加量為3%、pH9.4、45℃下，水解度可達(dá)到31.72%，水解液中游離氨基酸含量為2.859 mg/mL。

菌酶協(xié)同處理增強(qiáng)風(fēng)味就是采用發(fā)酵與酶解相結(jié)合的方法將植物蛋白降解為多肽和氨基酸等物質(zhì)，從而形成產(chǎn)品特征風(fēng)味[12]。研究表明，食品中風(fēng)味化合物與蛋白質(zhì)結(jié)合緊密[13]，戴梓茹等[14]研究表明多肽能產(chǎn)生特征性風(fēng)味；除此之外，分子量大于1 000 Da的多肽可以改善湯的口感，分子量在128 Da～1 000 Da的多肽除了影響其他感官特征外，主要有類肉風(fēng)味[15]。因此，菌酶協(xié)同處理強(qiáng)化亞麻籽粕風(fēng)味，可以為研究亞麻籽粕發(fā)酵酶解產(chǎn)生風(fēng)味物質(zhì)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗(yàn)材料

亞麻籽粕：天津慧智百川生物工程有限公司（蛋白質(zhì)含量32.8%，粗脂肪含量1.8%）；黑曲霉粉（Aspergillus niger）：汾源康源生物技術(shù)有限公司；中性蛋白酶（100 U/mg）：青島吉寶中新國(guó)際貿(mào)易有限公司。

1.1.2 試劑

無水葡萄糖、95%乙醇、異丙醇（分析純）：天津市津東天正精細(xì)化學(xué)試劑廠；酚酞指示劑：天津市化學(xué)試劑一廠；鄰苯二甲酸氫鉀（分析純）：天津大學(xué)科威公司；甲醛（分析純）：天津市大茂化學(xué)試劑廠甲醛公司。

1.2 儀器與設(shè)備

滅菌鍋（SN310C）：重慶雅馬拓科技有限公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱（DNP-9082BS）：上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；三溫三控水槽（DK-8D）、電熱鼓風(fēng)干燥箱（DF-101S）：上海博順實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；醫(yī)用離心機(jī)（TQ16-93）：湖南湘儀實(shí)驗(yàn)儀器開發(fā)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 亞麻籽粕發(fā)酵酶解液的風(fēng)味感官評(píng)定

請(qǐng)10位經(jīng)過感官分析培訓(xùn)的食品專業(yè)評(píng)定人員，對(duì)亞麻籽粕原料、黑曲霉發(fā)酵亞麻籽粕產(chǎn)物、亞麻籽粕發(fā)酵酶解液的香氣、色澤、組織狀態(tài)、總體評(píng)價(jià)進(jìn)行評(píng)分，滿分40分，感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如表1所示。

表1 風(fēng)味感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Flavor and sensory evaluation standard

1.3.2 游離脂肪酸（free fatty acid，F(xiàn)FA）含量的測(cè)定

參照Lam等[16]的研究，采用異丙醇-0.01 mol/L氫氧化鉀滴定法測(cè)定樣品中的FFA。

1.3.3 氨基態(tài)氮的測(cè)定

采用國(guó)標(biāo)GB 5009.235—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中氨基酸態(tài)氮的測(cè)定》中的甲醛值法測(cè)定氨基酸態(tài)氮含量[17]。

1.3.4 黑曲霉發(fā)酵亞麻籽粕單因素試驗(yàn)

亞麻籽粕與水分的料水比1∶1.5（g/mL），黑曲霉接種量4%（基于亞麻籽粕），葡萄糖添加量6%（基于亞麻籽粕），37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 d作為單因素試驗(yàn)條件，每天在無菌條件下攪拌1次～2次，以FFA和氨基態(tài)氮含量為指標(biāo)，選擇料水比 1 ∶0.5、1 ∶1.0、1 ∶1.5、1 ∶2.0、1 ∶2.5（g/mL）、接種量（2%、4%、6%、8%、10%）、葡萄糖添加量（2%、4%、6%、8%、10%）、發(fā)酵時(shí)間（2、3、4、5、6、7 d）4 個(gè)因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)，并選擇對(duì)指標(biāo)影響較大的水平進(jìn)行正交試驗(yàn)。

1.3.5 黑曲霉發(fā)酵亞麻籽粕正交試驗(yàn)

根據(jù)黑曲霉發(fā)酵亞麻籽粕單因素試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)L9（34）正交試驗(yàn)，測(cè)定氨基態(tài)氮和FFA，確定最佳的發(fā)酵條件。因素與水平見表2。

表2 黑曲霉發(fā)酵亞麻籽粕正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)Table 2 Orthogonal design factors and level of flaxseed meal fermented by Aspergillus niger

1.3.6 中性蛋白酶酶解發(fā)酵產(chǎn)物單因素試驗(yàn)

選取1.3.5確定的最佳發(fā)酵條件下的亞麻籽粕發(fā)酵物，將其配制成5%的發(fā)酵液進(jìn)行酶解試驗(yàn)。選擇加酶量、酶解溫度、酶解時(shí)間為單因素試驗(yàn)條件，以FFA和氨基態(tài)氮含量為指標(biāo)，選擇酶用量（1%、2%、3%、4%、5%）、酶解溫度（40、45、50、55、60 ℃）、酶解時(shí)間（1、2、3、4、5 h）3 個(gè)因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)，并選擇對(duì)指標(biāo)影響較大的水平進(jìn)行正交試驗(yàn)。

1.3.7 中性蛋白酶酶解發(fā)酵產(chǎn)物正交試驗(yàn)

根據(jù)中性蛋白酶酶解發(fā)酵產(chǎn)物單因素試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)L9（33）正交試驗(yàn)，測(cè)定氨基態(tài)氮和FFA，確定最佳的酶解條件，因素與水平見表3。

表3 中性蛋白酶酶解發(fā)酵產(chǎn)物正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)Table 3 Factors and levels of orthogonal design of neutral protease hydrolysates

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

所有試驗(yàn)均重復(fù)3次，采用Excel 2019進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果保留兩位小數(shù)。

2 結(jié)果分析

2.1 黑曲霉發(fā)酵亞麻籽粕單因素試驗(yàn)

根據(jù)1.3.4所述的方法進(jìn)行黑曲霉發(fā)酵亞麻籽粕單因素試驗(yàn)，按照1.3.2、1.3.3所述的方法測(cè)定FFA和氨基態(tài)氮含量，結(jié)果如圖1所示。

根據(jù)圖1A所示，亞麻籽粕與水分的料水比為1 ∶1.5（g/mL）時(shí)，F(xiàn)FA最高，達(dá)到0.35%，此時(shí)氨基態(tài)氮為1.07 g/100 g，也處于較高水平；料水比為 1 ∶2.0（g/mL）～1∶2.5（g/mL）時(shí)，F(xiàn)FA 下降；氨基態(tài)氮含量隨著料水比呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。起初可能由于固態(tài)發(fā)酵，底物的水分含量較低，而黑曲霉對(duì)水分要求過高；隨著水分含量升高，黑曲霉生長(zhǎng)受到抑制。綜合考慮兩個(gè)指標(biāo)，選擇料水比1∶1.5（g/mL）進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖1 黑曲霉發(fā)酵亞麻籽粕游離脂肪酸和氨基態(tài)氮的研究Fig.1 Study on FFA and amino nitrogen of flaxseed meal fermented by Aspergillus niger

根據(jù)圖1B所示，隨著接種量增加，F(xiàn)FA先升高后降低再升高，這可能是由于黑曲霉增多，底物含量有限，菌種之間互相抑制生長(zhǎng)[18]；當(dāng)接種量為4%時(shí)，F(xiàn)FA最高，為0.37%；隨著接種量增加，氨基態(tài)氮含量先增加至穩(wěn)定，后下降。在接種量為4%時(shí)，兩指標(biāo)含量都較高，因此選擇接種量4%進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

根據(jù)圖1C所示，當(dāng)葡萄糖添加量為發(fā)酵底物的6%和8%時(shí)，F(xiàn)FA最高，達(dá)到0.37%；氨基態(tài)氮含量隨著葡萄糖添加量的增加呈現(xiàn)先增加至最高點(diǎn)，后下降，之后又緩慢增加。這可能是由于起初葡萄糖添加量較少，碳源不充足，不能滿足黑曲霉的生長(zhǎng)需要[19-20]，而過多的葡萄糖抑制黑曲霉與底物的接觸。葡萄糖添加量為6%時(shí)，兩個(gè)指標(biāo)含量都最高，因此在后續(xù)試驗(yàn)里選擇葡萄糖添加量為6%。

根據(jù)圖1D所示，在發(fā)酵時(shí)間為4 d時(shí)，F(xiàn)FA和氨基態(tài)氮含量都很高，其中FFA為0.42%，氨基態(tài)氮為1.50 g/100 g。這可能是由于黑曲霉隨著發(fā)酵天數(shù)延長(zhǎng)，種群達(dá)到指數(shù)增長(zhǎng)[21]；到第4天時(shí)，種群到達(dá)最大值；第4天以后，種群到達(dá)衰亡期，黑曲霉數(shù)量大大減少，發(fā)酵效率降低[22]。

2.2 黑曲霉發(fā)酵亞麻籽粕正交試驗(yàn)

以黑曲霉發(fā)酵亞麻籽粕單因素試驗(yàn)結(jié)果為基礎(chǔ)，選取對(duì)FFA和氨基態(tài)氮含量影響較大的水平進(jìn)行正交試驗(yàn)。采用異丙醇-0.01 mol/L氫氧化鉀滴定法測(cè)定樣品中的FFA，甲醛滴定法測(cè)定氨基態(tài)氮含量，結(jié)果如表4所示。

對(duì)數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行極差分析，結(jié)果表明，以FFA為指標(biāo)的最優(yōu)條件為 A3B1C2D3，即料水比 1∶2.0（g/mL），接種量2%，葡萄糖添加量6%，發(fā)酵5 d；而正交結(jié)果表明最佳條件為 A3B1C3D2，即料水比 1 ∶2.0（g/mL），接種量2%，葡萄糖添加量8%，發(fā)酵4 d；此時(shí)FFA為0.45%，氨基態(tài)氮含量為1.63 g/100 g。以氨基態(tài)氮為指標(biāo)的最優(yōu)條件為 A1B3C2D3，即料水比 1 ∶1.0（g/mL），接種量6%，葡萄糖添加量6%，發(fā)酵5 d；正交結(jié)果表明最佳條件為 A1B3C3D3，即料水比 1 ∶1.0（g/mL），接種量6%，葡萄糖添加量8%，發(fā)酵5 d；此時(shí)氨基態(tài)氮含量為1.80 g/100 g，F(xiàn)FA為0.43%。

表4 黑曲霉發(fā)酵亞麻籽粕正交試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Orthogonal experiment results of flaxseed meal fermented by Aspergillus niger

2.3 黑曲霉發(fā)酵亞麻籽粕驗(yàn)證試驗(yàn)

2.3.1 以FFA為指標(biāo)的驗(yàn)證試驗(yàn)

通過極差分析，確定最佳發(fā)酵條件為料水比1∶2.0（g/mL）、接種量 2%、葡萄糖添加量為 6%、發(fā)酵5 d，在此條件下進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果取平均值，結(jié)果表明FFA可達(dá)0.54%，比優(yōu)化前（0.45%）提高20%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差 （relative standard deviation，RSD）是0.28%，此時(shí)氨基態(tài)氮含量為1.77 g/100 g，比優(yōu)化前（1.63 g/100 g）提高8.59%。

2.3.2 以氨基態(tài)氮為指標(biāo)的驗(yàn)證試驗(yàn)

通過極差分析，確定最佳發(fā)酵條件為料水比1∶1.0（g/mL）、接種量 6%、葡萄糖添加量為 6%、發(fā)酵5 d，在此條件下進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果取平均值，結(jié)果表明氨基態(tài)氮含量可達(dá)1.92 g/100 g，比優(yōu)化前（1.80 g/100 g）提高6.67%，RSD是0.16%，此時(shí)FFA為0.56%，比優(yōu)化前（0.43%）提高30.23%。

結(jié)果表明，以氨基態(tài)氮為指標(biāo)的驗(yàn)證試驗(yàn)（2.3.2）得到的兩個(gè)指標(biāo)含量都高于以FFA為指標(biāo)的驗(yàn)證試驗(yàn)（2.3.1），同時(shí)高于未優(yōu)化之前；FFA為0.56%，氨基態(tài)氮含量為1.92 g/100 g，RSD較小。因此，選擇料水比1∶1.0（g/mL）、接種量6%、葡萄糖添加量6%、發(fā)酵5 d作為最優(yōu)發(fā)酵條件，為下一步的酶解部分做好準(zhǔn)備。

2.4 中性蛋白酶酶解亞麻籽粕霉菌發(fā)酵液?jiǎn)我蛩卦囼?yàn)

根據(jù)1.3.6所述的方法進(jìn)行中性蛋白酶酶解亞麻籽粕霉菌發(fā)酵液?jiǎn)我蛩卦囼?yàn)，按照1.3.2、1.3.3所述的方法測(cè)定FFA和氨基態(tài)氮含量，結(jié)果如圖2所示。

圖2 中性蛋白酶酶解亞麻籽粕發(fā)酵液游離脂肪酸和氨基態(tài)氮的研究Fig.2 Enzymatic hydrolysis of free fatty acids and amino nitrogen in flaxseed meal fermentation broth by neutral protease

根據(jù)圖2a所示，在中性蛋白酶用量為3%時(shí)，兩個(gè)指標(biāo)均較高，此時(shí)FFA達(dá)到12.00%，氨基態(tài)氮含量為1.95 g/100 g，這可能是由于隨著酶的增加，酶與底物充分結(jié)合；當(dāng)酶添加量超過3%時(shí)，酶量過多，底物不足，過量的酶與生成物結(jié)合，抑制產(chǎn)物的釋放[23]。雖然加酶量為5%時(shí)，指標(biāo)含量也較高，但與3%時(shí)相差不太，考慮成本和生產(chǎn)實(shí)際要求，選擇加酶量3%進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

根據(jù)圖2b所示，溫度40℃～50℃時(shí)，氨基態(tài)氮含量先減小后增大；在反應(yīng)50℃時(shí)氨基態(tài)氮含量為1.94 g/100 g，F(xiàn)FA為13.50%，此時(shí)達(dá)到最高值，這可能是因?yàn)闇囟壬?，酶活力增?qiáng)反應(yīng)速率加快；之后，隨著溫度升高，氨基態(tài)氮含量大致呈下降趨勢(shì)，說明中性蛋白酶在50℃活性最強(qiáng)。因此選擇酶解溫度為50℃進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

根據(jù)圖2c所示，酶解2 h時(shí)，兩個(gè)指標(biāo)含量都較高，說明隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，中性蛋白酶與發(fā)酵亞麻籽粕反應(yīng)越充分；3 h～5 h時(shí)兩個(gè)指標(biāo)含量均較低，這說明底物和酶已充分反應(yīng)，底物也不再隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而被逐漸分解[24]，考慮到1 h時(shí)，兩指標(biāo)含量均過低，因此，選擇酶解時(shí)間3 h進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.5 中性蛋白酶酶解亞麻籽粕霉菌發(fā)酵液正交試驗(yàn)

以中性蛋白酶酶解亞麻籽粕霉菌發(fā)酵液?jiǎn)我蛩卦囼?yàn)結(jié)果為基礎(chǔ)，選取對(duì)FFA和氨基態(tài)氮含量影響較大的水平進(jìn)行正交試驗(yàn)。采用異丙醇-0.01 mol/L氫氧化鉀滴定法測(cè)定樣品中的FFA，甲醛滴定法測(cè)定氨基態(tài)氮含量，結(jié)果如表5所示。

表5 中性蛋白酶酶解亞麻籽粕霉菌發(fā)酵液正交試驗(yàn)結(jié)果Table 5 Orthogonal experiment design and results of neutral protease hydrolysis of flaxseed meal mold fermentation broth

對(duì)數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行極差分析，比較各因素不同水平，a1、b3、c1為最優(yōu)水平，即以FFA和氨基態(tài)氮為指標(biāo)的最優(yōu)條件為加酶量2%，酶解溫度55℃，酶解2 h；直觀分析表明，第9組氨基態(tài)氮和FFA最高，此時(shí)組合為a3b3c1，即加酶量為4%，溫度55℃，時(shí)間2 h，此時(shí)氨基態(tài)氮含量為3.67 g/100 g，F(xiàn)FA為22.06%。

2.6 中性蛋白酶酶解亞麻籽粕霉菌發(fā)酵液驗(yàn)證試驗(yàn)

通過極差分析，以FFA和氨基態(tài)氮為指標(biāo)，確定最佳酶解條件為加酶量2%，酶解溫度55℃，酶解2 h，在此條件下進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果取平均值，結(jié)果表明FFA含量可達(dá)22.10%，比優(yōu)化前（22.06%）提高0.18%，RSD是0.13%；氨基態(tài)氮含量為4.03 g/100 g，比優(yōu)化前（3.67 g/100 g）提高9.81%，RSD是0.06%。結(jié)果表明，酶解最優(yōu)條件為：加酶量2%，酶解溫度55℃，酶解2 h。

2.7 黑曲霉固態(tài)發(fā)酵亞麻籽粕-中性蛋白酶酶解產(chǎn)物風(fēng)味評(píng)價(jià)

2.7.1 FFA和氨基態(tài)氮分析

對(duì)亞麻籽粕，亞麻籽粕發(fā)酵物，亞麻籽粕發(fā)酵酶解液進(jìn)行各樣品指標(biāo)含量分析，結(jié)果如表6所示。

表6 各樣品指標(biāo)含量分析Table 6 Index content analysis of each sample

2.7.2 感官評(píng)價(jià)

根據(jù)1.3.1，對(duì)亞麻籽粕，亞麻籽粕發(fā)酵物，亞麻籽粕發(fā)酵酶解液進(jìn)行風(fēng)味感官評(píng)分，結(jié)果見表7。

表7 感官評(píng)價(jià)得分Table 7 Sensory evaluation score

根據(jù)表7所示，亞麻籽粕經(jīng)過發(fā)酵、酶解過程，香氣、色澤、組織狀態(tài)、總體評(píng)價(jià)分值都逐步提高，具有顯著性差異，其中亞麻籽粕發(fā)酵酶解液香氣濃郁、無異味；色澤均勻一致；組織狀態(tài)細(xì)膩、均勻。分析其原因可能是經(jīng)過微生物發(fā)酵、酶解兩步，亞麻籽粕含有的蛋白質(zhì)、脂肪等發(fā)生降解，生成小分子物質(zhì)。

3 結(jié)論

本研究采用發(fā)酵酶解兩步法增強(qiáng)亞麻籽粕風(fēng)味。結(jié)果表明，黑曲霉固態(tài)發(fā)酵亞麻籽粕優(yōu)化條件為料水比 1∶1.0（g/mL），接種量 6%（基于亞麻籽粕），葡萄糖添加量6%（基于亞麻籽粕），在37℃條件下發(fā)酵5 d；中性蛋白酶酶解亞麻籽粕發(fā)酵液優(yōu)化條件為加酶量2%，55℃酶解2 h，相比于未發(fā)酵的亞麻籽粕，氨基態(tài)氮含量增加4.03 g/100 g，F(xiàn)FA含量擴(kuò)大246倍；香氣濃郁、無異味；色澤均勻一致；組織狀態(tài)細(xì)膩、均勻。本研究為進(jìn)一步研究亞麻籽粕發(fā)酵酶解產(chǎn)生風(fēng)味物質(zhì)奠定基礎(chǔ)。