趙毅 石文昊 潘昊磊 張克亮

摘 要：為探討鳳丹種子是否存在抑制萌發(fā)的物質(zhì)，以新成熟的鳳丹種子作為試驗(yàn)材料，分別提取種皮和胚乳浸提液，研究不同濃度浸提液對(duì)白菜種子萌發(fā)、幼苗生長(zhǎng)以及幾種主要抗氧化酶活性的影響。結(jié)果表明，鳳丹胚乳浸提液能顯著抑制白菜種子的萌發(fā)與幼苗生長(zhǎng)，抑制作用隨著浸提液濃度的增加而增強(qiáng)，而種皮浸提液的抑制作用不顯著，主要起到延緩幼苗生長(zhǎng)的作用;鳳丹胚乳浸提液顯著抑制了白菜幼苗的POD和CAT酶活性，間接影響SOD酶活性?？梢?，鳳丹種子中確實(shí)存在抑制種子萌發(fā)的內(nèi)源抑制物，這些物質(zhì)很可能是造成種子休眠的重要原因。

關(guān)鍵詞：白菜;浸提液;抗氧化酶;抑制作用;種子休眠

中圖分類號(hào) S63 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-7731（2021）01-0025-04

Effects of Crude Extracts of Paeonia ostii Seeds on Germination and Activities of Antioxidant Enzyme of Brassica pekinensis

ZHAO Yi et al.

（College of Horticulture and Plant Protection，Jiangsu Key Laboratory of Crop Genetics and Physiology，Yangzhou University，Yangzhou 225009，China）

Abstract： To determine whether seeds of Paeonia ostii contain substance that inhibit seed germination， we studied the effect of different concentrations of P. ostii seed coat and endosperm crude extract on seed germination， seedling growth and several antioxidant enzyme activities of Brassica pekinensis. The results indicates that endosperm of P. ostii seeds could significantly inhibit seed germination and seedling growth of B. pekinensis， and the inhibitory effect increases with the increase of the extract concentration， while the seed coat extract has no significant inhibitory effect， and mainly delays the growth of seedlings. The endosperm extract of P. ostii seeds significantly inhibited the POD and CAT enzyme activities of B. pekinensis seedlings， and indirectly affect the SOD enzyme activity. Therefore， P. ostii seeds do have endogenous inhibitors that inhibit seed germination， and these substances are likely to be important reasons for seed dormancy.

Key words： Brassica pekinensis; Water crude; Antioxidant enzyme; Inhibiting effect; Seed dormancy

鳳丹（Paeonia ostii）是芍藥科芍藥屬的一種多年生藥用牡丹，主要分布在江南區(qū)域，具有重要的藥用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值[1]。鳳丹根表皮中含豐富的丹皮酚，具有抗炎、解熱和調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的功效[2];大規(guī)模種植后發(fā)現(xiàn)，鳳丹種子還具有重要的油用價(jià)值，鳳丹籽油不飽和脂肪酸和α-亞麻酸含量高達(dá)92.26%、42%[3]。

鳳丹主要以種子繁殖為主，但由于其種子具有較長(zhǎng)的休眠期，育苗周期長(zhǎng)，普遍存在發(fā)芽率低、出苗參差不齊的現(xiàn)象，嚴(yán)重影響了鳳丹的生產(chǎn)和開發(fā)利用[4，5]。目前，對(duì)造成鳳丹種子休眠原因的研究主要集中在發(fā)育不完全的種胚和生理后熟方面，而對(duì)種子內(nèi)源性物質(zhì)可能誘導(dǎo)種子休眠的研究則較少[5，6]。為此，筆者以新成熟的鳳丹種子為試驗(yàn)材料，以白菜種子為受體材料，從種子不同部位浸提液對(duì)白菜種子萌發(fā)、幼苗生長(zhǎng)和抗氧化酶活性的影響來研究鳳丹種子休眠的原因，以期為快速打破鳳丹種子休眠，充分發(fā)揮鳳丹的藥用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料 以2019年8月底采自揚(yáng)州大學(xué)芍藥牡丹資源苗圃新成熟的鳳丹種子為實(shí)驗(yàn)材料，實(shí)驗(yàn)室陰涼通風(fēng)處自然晾干，低溫避光保存。以采購于揚(yáng)州農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)的白菜（Brassica pekinensis）種子為受體材料。

1.2 試驗(yàn)方法 選取外形飽滿有光澤的鳳丹種子，將種皮和胚乳分離，于40℃條件下烘干至恒重。將種皮和胚乳用研磨機(jī)粉碎后，各稱取10g放入100mL錐形瓶中，加入80mL去離子水，封口膜封口。放入20℃培養(yǎng)箱內(nèi)浸提24h，收集浸提液，4000r離心10min，過濾得上清液，定容至100mL，即為0.1g·mL-1的粗提液。將上述粗提液用去離子水稀釋成濃度依次為0.025、0.050、0.075和0.100g·mL-1的培養(yǎng)液，置于4℃冰箱中備用。測(cè)定項(xiàng)目如下：

1.2.1 種子萌發(fā)率 將白菜種子放置在鋪有2層濾紙的直徑為9cm的培養(yǎng)皿中。每個(gè)培養(yǎng)皿分別加入7mL不同濃度的培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)設(shè)置5個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)50粒種子，以加入同體積的去離子水為對(duì)照。培養(yǎng)皿置于25℃光照培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行萌發(fā)實(shí)驗(yàn)，以胚根突破種皮為發(fā)芽標(biāo)志[7]，72h后統(tǒng)計(jì)種子發(fā)芽率、胚根長(zhǎng)度和下胚軸長(zhǎng)度。

1.2.2 幼苗生理指標(biāo) 用去離子水將胚乳粗提液配制成濃度依次為0、0.025、0.050、0.075和0.100g·mL-1的培養(yǎng)液。按1.3中的方法將白菜種子在不同濃度的培養(yǎng)液中培養(yǎng)，分別在24h、48h和72h參照參考文獻(xiàn)[8]方法分別測(cè)定白菜幼苗的超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）和過氧化氫酶（CAT）活性。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS 20.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析。采用二因素方差分析法，分析浸提物濃度和提取部位對(duì)白菜種子萌發(fā)率、根長(zhǎng)和上胚軸長(zhǎng)度的影響以及天數(shù)和浸提液濃度對(duì)白菜抗氧化酶活性的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 鳳丹種子不同部位浸提液對(duì)白菜種子萌發(fā)的影響 由圖1可知，鳳丹胚乳浸提液處理能抑制白菜種子的萌發(fā)，萌發(fā)率隨著浸提液濃度的增加而下降;而種皮浸提液對(duì)白菜種子無明顯的抑制作用。與對(duì)照相比，0.075和0.100g·mL-1濃度的胚乳浸提液顯著抑制了白菜種子的萌發(fā)（P<0.05），濃度為0.100g·mL-1時(shí)發(fā)芽率僅為32%。

2.2 鳳丹種子不同部位浸提液對(duì)白菜幼苗生長(zhǎng)的影響 由圖2可知，鳳丹種皮和胚乳浸提液對(duì)白菜幼苗胚根的伸長(zhǎng)均有顯著的抑制作用，隨著濃度的增加，白菜幼苗胚根長(zhǎng)度呈下降趨勢(shì)。浸提液濃度為0.100g·mL-1時(shí)，白菜幼苗胚根長(zhǎng)度分別為0.6、0.4cm;在相同濃度下，胚乳浸提液對(duì)白菜幼苗胚根伸長(zhǎng)的抑制作用顯著高于種皮浸提液。由圖3可知，鳳丹胚乳浸提液對(duì)白菜幼苗上胚軸的伸長(zhǎng)有顯著的抑制作用，且隨著濃度的增加抑制作用越明顯;而種皮浸提液對(duì)白菜幼苗上胚軸伸長(zhǎng)的抑制作用明顯弱于胚乳浸提液。與對(duì)照相比，濃度為0.025g·mL-1時(shí)，種皮浸提液對(duì)上胚軸伸長(zhǎng)抑制作用最明顯，長(zhǎng)度為0.38cm，但隨著濃度的增加，抑制作用有所減弱;當(dāng)胚乳浸提液濃度為0.100g·mL-1時(shí)，上胚軸長(zhǎng)度僅為0.14cm。

2.3 鳳丹胚乳浸提液對(duì)白菜幼苗抗氧化酶活性的影響 如圖4所示，鳳丹胚乳浸提液能顯著提高白菜幼苗的SOD活性，活性整體呈現(xiàn)隨浸提物濃度增加而升高的趨勢(shì);在相同濃度下，不同處理天數(shù)的白菜幼苗SOD活性存在差異。與對(duì)照相比，處理1、2d后浸提液濃度為0.100g·mL-1時(shí)，幼苗SOD活性最大，為180U/FW;而處理3d后幼苗SOD活性最大時(shí)（160U/FW）的濃度為0.075g·mL-1，之后隨著濃度的增加，SOD活性顯著下降。

如圖5所示，鳳丹胚乳浸提液對(duì)白菜幼苗POD活性具有顯著的抑制作用，且隨著濃度的增加抑制作用越明顯;在任意相同濃度下，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，POD活性呈顯著上升的趨勢(shì)。與對(duì)照相比，浸提液濃度為0.100g·mL-1時(shí)，處理1、2、3d后的活性分別為50U/FW、190U/FW、260U/FW。

如圖6所示，鳳丹胚乳浸提液能顯著抑制白菜幼苗的CAT活性，活性隨著濃度的增加而顯著下降;在相同濃度下，不同處理天數(shù)下白菜幼苗的CAT活性存在一定的差異。與對(duì)照相比，當(dāng)濃度較低時(shí)，處理天數(shù)越短，活性越高;而當(dāng)濃度為0.100g·mL-1時(shí)，處理1d后幼苗的CAT活性最低，僅為15U/FW。

3 結(jié)論與討論

種子只有在適宜的時(shí)間和空間下萌發(fā)，才能保障幼苗的生長(zhǎng)發(fā)育，實(shí)現(xiàn)種群的成功更新[9]。因此，確定影響種子休眠的原因，調(diào)控萌發(fā)時(shí)間的機(jī)制或原理，對(duì)于保障植物幼苗生長(zhǎng)發(fā)育以及種群的繁衍具有重要的生態(tài)意義。本研究發(fā)現(xiàn)，鳳丹種子浸提液能顯著抑制白菜種子的萌發(fā)、胚根和上胚軸的伸長(zhǎng)，當(dāng)濃度為0.100g·mL-1時(shí)抑制效果最顯著，且胚乳浸提液的抑制作用明顯高于種皮浸提液。在黃牡丹和四川牡丹種子浸提液對(duì)白菜種子萌發(fā)的影響研究中也發(fā)現(xiàn)了相似的結(jié)果[10，11]。這表明鳳丹種子尤其是胚乳中確實(shí)存在抑制種子萌發(fā)的內(nèi)源性物質(zhì)。值得注意的是，鳳丹種皮浸提液雖然對(duì)白菜種子萌發(fā)的抑制作用不明顯，但卻能顯著抑制胚根的伸長(zhǎng)，這說明種皮浸提液中物質(zhì)的作用更多的是延緩種子萌發(fā)，對(duì)最終萌發(fā)率的影響可能較小，而胚乳中物質(zhì)在抑制萌發(fā)和延緩幼苗生長(zhǎng)上具有雙重抑制作用。造成這種現(xiàn)象的原因是不同部位所含內(nèi)源物質(zhì)的種類不同，還是內(nèi)源物質(zhì)含量上的較大差異，有待進(jìn)一步研究探討。

當(dāng)植物受到環(huán)境脅迫時(shí)，會(huì)產(chǎn)生大量的自由基或活性氧以及一些脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，如MDA、HNE，嚴(yán)重阻礙種子的萌發(fā)和幼苗正常生長(zhǎng)，而抗氧化酶是清除這些有害物質(zhì)的主要組成成分[12，13]。本試驗(yàn)測(cè)定了鳳丹胚乳浸提液對(duì)白菜幼苗SOD、CAT、POD活性的影響，結(jié)果表明，胚乳浸提液能顯著抑制CAT、POD的活性，但顯著提高了幼苗SOD的活性，這與鄧嵐和宋會(huì)興的研究結(jié)果一致。牛歡歡等研究發(fā)現(xiàn)，光葉紫花苕子浸提液能顯著增加紫花苜蓿與白三葉幼苗POD活性，同時(shí)增加了白三葉幼苗的CAT活性，但降低了紫花苜蓿幼苗的CAT活性[14]。我們推測(cè)這可能是由于不同物種抗氧化酶活性對(duì)不同浸提液的敏感度不一樣，當(dāng)浸提液濃度較低時(shí)，一些酶活性會(huì)被提高，而當(dāng)濃度增加或處理時(shí)間延長(zhǎng)時(shí)，這些酶的活性最終會(huì)下降。白菜幼苗SOD活性隨著濃度的增加而顯著提高，但當(dāng)處理天數(shù)延長(zhǎng)到3d時(shí)，SOD活性出現(xiàn)了明顯的下降趨勢(shì)。紫斑牡丹種子胚乳浸提液濃度在0.025g·mL-1時(shí)提高了白菜幼苗SOD活性，但隨后其活性顯著下降，該結(jié)果也證明了我們推測(cè)的可靠性[15]。此外，在鳳丹的根際中發(fā)現(xiàn)了以阿魏酸、香草醛、香豆素和丹皮酚為主的酚酸類物質(zhì)，這表明種子內(nèi)源性物質(zhì)中很可能存在酚酸類物質(zhì)，這些物質(zhì)抑制了抗氧化酶活性，同時(shí)阻礙了種子休眠的打破和萌發(fā)[16，17]。

本研究結(jié)果表明，鳳丹種子中確實(shí)存在抑制種子萌發(fā)的內(nèi)源抑制物，同時(shí)這些物質(zhì)還會(huì)顯著抑制胚根、上胚軸的伸長(zhǎng)，降低POD和CAT的活性。這些內(nèi)源抑制物主要存在于胚乳中，而在種皮中較少。鑒于胚乳是鳳丹種子萌發(fā)所需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的主要來源，這很可能是種子休眠的重要原因。

參考文獻(xiàn)

[1]徐國(guó)均.生藥學(xué)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，1995.

[2]楊玉珍，張志浩，王國(guó)霞.鳳丹愈傷組織中丹皮酚含量的測(cè)定[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2018，30（03）：412-417.

[3]張凱月，賀春玲，侯小改，等.油用牡丹經(jīng)濟(jì)價(jià)值和景觀生態(tài)價(jià)值研究現(xiàn)狀[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2019，35（10）：66-71.

[4]黃青云.解除休眠處理對(duì)鳳丹種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)的影響[J].三亞熱帶植物科學(xué)，2008，37（4）：35-37.

[5]郭麗萍，張延龍，牛立新，等.鳳丹種子休眠特性研究[J].西北林學(xué)院學(xué)報(bào)，2016，31（4）：165-169.

[6]韋祖粉，蒲振蕊，魯清清，等.油用牡丹鳳丹種子休眠解除及組織培養(yǎng)研究[J].種子，2020，39（01）：54-58，63.

[7]吳嘯業(yè).紅豆杉種子抑制物質(zhì)的初步研究[J].植物生理學(xué)通1985（4）：23-26.

[8]熊慶娥.植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)教程[M].成都：四川科學(xué)技術(shù)出版社，2003：68，31，55，127.

[9]Huang Z，Liu S，Bradford K J，et al. The contribution of germination functional traits to population dynamics of a desert plant community [J]. Ecology，2016，97（1）：250-261.

[10]鄧嵐，張翔宇，曾秀麗，等.黃牡丹種子浸提液對(duì)白菜種子萌發(fā)及幼苗抗氧化酶活性的影響[J].西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2017，30（2）：305-308.

[11]宋會(huì)興，劉光立，高素平，等.四川牡丹種子浸提液內(nèi)源抑制物質(zhì)活性初探[J].園藝學(xué)報(bào)，2012，39（2）：370-374.

[12]Ebone，L.A.，Caverzan，A.，Chavarria，G.， Physiologic alterations in orthodox seeds due to deterioration processes[J]. Plant Physiol. Biochem.，2019，145：34–42.

[13]Waszczak，C.，Carmody，M.，Kangasj?rvi，J.， Reactive oxygen species in plant signaling[J].Annu Rev. Plant Biol.，2018，69：209–236.

[14]牛歡歡，王森森，賈宏定，等.光葉紫花苕子浸提液對(duì)4種牧草種子萌發(fā)過程的化感作用[J].草業(yè)學(xué)報(bào)，2020，29（09）：161-168.

[15]李婉茹，唐紅，何麗霞.紫斑牡丹種子浸提液對(duì)植物種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)的影響[J].東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2020，48（03）：8-12.

[16]覃逸明，聶劉旺，黃雨清，等.鳳丹自毒物質(zhì)的檢測(cè)及其作用機(jī)制[J].生態(tài)學(xué)報(bào)，2009，29（3）：1153-1161.

[17]楊勇，劉光立，宋會(huì)興，等.四川牡丹胚乳浸提液對(duì)油菜種子萌發(fā)與幼苗生長(zhǎng)的影響[J].西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2013，26（1）：89-92.

（責(zé)編：張宏民）