喬 欣 李 夢 焦 昆 李勝利

(首都醫(yī)科大學實驗動物部，北京 100069)

病理診斷技術在實驗動物相關科學研究中發(fā)揮著重要作用，是人類疾病動物模型檢驗、藥理毒理學分析及實驗動物疾病診斷中最為基本的一種形態(tài)學檢驗技術。病理組織切片制作則是病理診斷的基礎和必要條件。病理診斷的準確性，取決于病理組織切片制作質量的高低。制片過程中，操作方法和技巧是制作出優(yōu)質病理切片的前提保證。為提高病理組織切片制作效果，保證病理診斷的準確性和嚴謹性，對本實驗動物病理室前期制作的1 800件切片質量予以分析，以期進一步改進實驗動物常規(guī)切片的制作，提高病理切片制作質量。

1 材料和方法

1.1 切片選取

從本實驗室兩年內制作完成的病理石蠟切片中隨機選取1 800件作為研究對象，根據(jù)組織切片制備質量控制評價標準對選取的病理切片進行質量評估，觀察樣本切片存在的質量缺陷、統(tǒng)計壞片率及分析導致切片出現(xiàn)質量缺陷的原因。

1.2 評價標準

評價標準共包括切片完整等10個方面，每個小項標準滿分均為10分，滿分100分。根據(jù)質量缺陷適當減分，具體見表1。評價分≥ 90 分為甲級片(優(yōu))，75～89 分為乙級片(良)，60～74 分為丙級片(基本合格)，0～59 分為丁級片(不合格)。優(yōu)片率=[(甲級片+乙級片)/病理切片總件數(shù)]×100.0%，壞片率=[(基本合格+不合格)/ 病理切片總件數(shù)]×100.0%。

表1 蘇木素-伊紅(HE)染色切片質量的基本評價標準

2 結果

2.1 病理切片質量統(tǒng)計結果

在抽取研究的1 800 件病理切片中，甲級片有567 件(31.50%)，乙 級 片 有1 056件(58.67%)， 切 片 優(yōu) 片 率 為 90.17%(1 623/1 800)，其余177件均存在不同程度的質量缺陷，壞片率為9.83%(177/1 800)。具體切片質量情況見表2。

表2 各級別病理切片統(tǒng)計結果

2.2 壞片分類及原因分析

對評估出現(xiàn)的177件壞片予以分析，發(fā)現(xiàn)導致壞片的原因多系操作不當，其中尤以取材和標本固定不當為主，試劑試藥原因占比較低。出現(xiàn)壞片具體原因見表3。

表3 導致壞片原因

3 討論

實驗動物病理切片是獸醫(yī)病理學家做出病理診斷的重要依據(jù)。切片質量優(yōu)劣取決于病理切片制作過程的規(guī)范性及病理技術人員工作的嚴謹性，極大程度上影響病理診斷的準確性。病理切片制作過程的復雜性和繁瑣環(huán)節(jié)，無論是取材、固定、脫水透明，還是浸蠟包埋、貼片、染色封片等，上述諸多環(huán)節(jié)中，任何一個節(jié)點出現(xiàn)問題都將對切片質量造成一定的影響。當然，病理切片出現(xiàn)質量錯誤原因既可能系操作不當，也可能是器械、試劑試藥等外因所致。結合實驗動物病理工作實踐，對實驗動物病理切片制作過程中存在的問題進行歸納、分析及總結，并提出有效的解決方法，對推進實驗動物科學相關研究工作意義重大。

本研究共選取 1 800 件制作完成的病理切片，其中1 623 件符合甲、乙級切片標準，優(yōu)良率為 90.17%，剩余177件均存在不同程度的質量缺陷，壞片率為9.83%。結果證明，實驗室病理切片制作質量控制嚴格，優(yōu)良率在90%以上，壞片率控制在10%以下，基本上達到了病理室技術工作要求[1]，能夠滿足科研需要，但切片優(yōu)級率為31.5%，低于業(yè)界指標，說明制片技術仍有待于進一步提高。從統(tǒng)計結果看出，導致出現(xiàn)壞片的原因主要在于取材、標本固定、包埋切片、染色固封等環(huán)節(jié)，上述節(jié)點所致壞片比例分別為 38.42%、33.33%、15.25%和8.47%，而試劑試藥原因占比較小。壞片可以發(fā)生在切片制作的任何環(huán)節(jié)。根據(jù)上述壞片原因現(xiàn)將處理方法總結如下：(1)規(guī)范取材。取材要盡量做到保持組織自然形態(tài)、完整性、代表性、時效性、順序性和全面性，避免人為改變組織形態(tài)。為便于病理讀片時辨認組織和識別病變，取材時應選取病變顯著區(qū)與較健康區(qū)交界處和可疑病灶，組織塊大小以1.5 cm × 1.0 cm × 0.5 cm為宜(不含穿刺取材)，而較大的病灶可以反映病變各階段及病灶各層形態(tài)，故此類病灶取材時宜從中心到外周多部位順序取材，而特殊形狀器官可特殊處理。本研究涉及的因取材所致壞片中有部分系因取材不及時，組織出現(xiàn)了自溶，繼而影響到切片質量，也有部分壞片系因所取組織塊偏大，組織固定不充分而受到影響；(2)選擇適合的固定液及保證充足的固定時間。固定時，固定液應新鮮，新配制的固定液最佳，避免因久放儲存而影響固定效果。另外，固定液量應充足，至少為固定組織體積的5倍以上，且液面能夠沒過組織表面。容器大小同樣非常重要，要避免強行把組織塊塞入小口容器，以免損傷病理組織及固定完成后不易取出組織塊。固定期間使用搖床攪動組織或晃動容器有利于固定液的滲入。鑒于實驗動物病理工作涉及到的組織標本來自多種動物，且標本來源及動物年齡參差不齊，故固定要盡可能依據(jù)組織種類、性質及大小、固定液的種類、性質及滲透力、搖床轉速、環(huán)境溫度、實驗目的等掌握最佳固定時間。如使用同種固定液，老年動物病理標本較幼齡動物標本固定時間應適當延長，小型豬或非人靈長類實驗動物病理標本固定時間也要延長、小鼠標本固定時間略長。固定時間過短會導致組織結構不清晰且染色效果不佳，而固定時間過長則會導致組織過硬難以制片。目前，新型混合固定液的使用范圍增大，其可以達到縮短固定時間、固定液對制片者毒性降低等效果[2]。另外，固定方式的改良，如肺臟負壓固定、氣管灌注固定[3]以及神經(jīng)系統(tǒng)組織取材前，進行循環(huán)系統(tǒng)灌注，均可取得良好效果；(3)提升包埋與切片技巧。包埋工作對切片質量具有一定影響，需引起重視。王鳳龍[4]指出，可依據(jù)環(huán)境溫度選擇包埋用石蠟熔點，即：熔點較高的硬蠟應在環(huán)境溫度高時使用，而熔點較低的軟蠟則適用于室溫偏低時。組織包埋時，應考慮石蠟種類、浸蠟溫度、組織塊大小、石蠟硬度等因素，合理包埋。切片是制片的關鍵步驟。切片時，用力均勻穩(wěn)定，切速緩和均一，厚度一致。切片可以是單張，也可以是連續(xù)切片形成蠟帶。切片可根據(jù)室溫摸索適合蠟塊的處理方法(4 ℃預冷)，避免出現(xiàn)刀痕，以保持組織的完整性、切片的厚度均一等。另外，及時變更刀片切點既有利于保證切片質量也利于節(jié)約，提高刀片使用時間；(4)試劑試藥及時更換。存放時間過長，或其它不確定因素，均可導致試劑試藥變質，繼而將直接影響到切片制作中的組織脫水、透明、浸蠟等過程。嚴重時，還會導致污染標本，最終影響診斷。本研究出現(xiàn)的部分壞片，因未能及時更換變質的試劑試藥所致。

總之，高質量實驗動物病理切片的制備，涉及到制作過程的各個步驟，需要認真、細致及嚴謹。快速制作高水平切片需要長期摸索條件和改進方法，如超聲波的應用極大縮短制片時間[5]。改進、提升和發(fā)展病理切片制作技術，對推進實驗動物科研工作具有重要意義。