秦 通 邢 丹 張美娜 施明杰 孫 毅** 蔣寶貴

(1.軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院微生物流行病研究所，病原微生物生物安全國家重點實驗室，媒介生物危害和自然疫源性疾病北京市重點實驗室，北京 100071 2.中國人民解放軍91638部隊衛(wèi)生所,北京 102202)

蜱是一種專性吸血的媒介節(jié)肢動物,廣布于世界五大洲許多國家和地區(qū)(Andersonetal.,2008),且能將多種病原體(包括細(xì)菌、真菌、立克次體、原生動物、線蟲、病毒及毒素等)傳播給人類、牲畜和野生動物,引發(fā)多種蜱媒傳染病的流行(Jiaetal., 2020),因此,蜱類及其傳播的蜱媒疾病是當(dāng)前傳染病防控的重要對象,而其中影響或制約蜱媒病原傳播的蛋白修飾或降解過程更是明確蜱媒病原傳播分子機制、揭示病原—宿主相互關(guān)系的關(guān)鍵環(huán)節(jié)(Hajdu?eketal., 2013)。

作為最普遍的蛋白質(zhì)翻譯后修飾因子之一,泛素在所有真核生物廣泛存在且高度保守。由E1泛素激活酶、E2泛素結(jié)合酶和E3泛素連接酶組成的三級酶聯(lián)反應(yīng)組成的泛素化過程是生物體內(nèi)蛋白質(zhì)翻譯后的修飾、降解的重要過程,是蜱類與病原體之間蛋白質(zhì)相互作用的重要方式之一(Cabezas-Cruzetal., 2019)。其中，E3泛素連接酶因其嚴(yán)格控制泛素化反應(yīng)的效率和底物特異性成為泛素化級聯(lián)反應(yīng)的關(guān)鍵成分(Zhengetal., 2017)。研究表明，E3泛素連接酶是細(xì)胞體液免疫所必需的。E3泛素連接酶VHL通過缺氧誘導(dǎo)因子1α(HIF-1α)依賴的糖酵解途徑正向調(diào)節(jié)TFH細(xì)胞的早期啟動，從而成為TFH細(xì)胞在急性病毒感染或抗原免疫時發(fā)揮功能所必需(Zhuetal., 2019)。一些病原體通過對宿主體內(nèi)E3泛素連接酶的誘導(dǎo)與控制，實現(xiàn)在宿主體內(nèi)的免疫逃逸或病原體的復(fù)制。如登革病毒2(DENV2)在感染期間通過激活未折疊蛋白反應(yīng)(UPR)而誘導(dǎo)E3泛素連接酶SIAH1的表達(dá),SIAH1與先天性免疫接頭蛋白MyD88結(jié)合并泛素化,最終實現(xiàn)抑制宿主的先天免疫反應(yīng)和促進(jìn)登革病毒2(DENV2)復(fù)制(Schaferetal., 2020)。還有一些病毒，通過招募宿主的E3泛素連接酶來促進(jìn)病毒的復(fù)制和釋放。例如埃博拉病毒(EBOV)的VP40基質(zhì)蛋白(EVP40)和馬爾堡病毒(MARV)的VP40基質(zhì)蛋白(MVP40),兩者的PPxY型L結(jié)構(gòu)域通過其WW結(jié)構(gòu)域招募宿主的E3泛素連接酶，以促進(jìn)病毒的復(fù)制和釋放(Hanetal., 2016)。此外,E3泛素連接酶還參與了傳染性病毒粒子的釋放。E3泛素連接酶與拉薩病毒(LASV)、莫佩亞病毒(MOPV)和其他病毒的Z蛋白結(jié)合，參與了病毒樣顆粒的釋放和傳染性子代病毒的釋放(Bailletetal., 2020)。更有甚者，有些病毒利用自身病毒蛋白來攜帶E3泛素酶活性，從而達(dá)到病毒在宿主體內(nèi)生存發(fā)展的某些條件，如新近發(fā)現(xiàn)的托斯卡納病毒(Toscana virus, TOSV)，其非結(jié)構(gòu)蛋白(Non-Structure Protein, NSs)本身就是負(fù)鏈RNA病毒中首次發(fā)現(xiàn)的一個具有非典型的RBR(RING between RING)結(jié)構(gòu)的E3泛素連接酶，它是通過泛素化介導(dǎo)靶點蛋白降解、實現(xiàn)免疫逃避的主要功能單元(Gori Savellinietal., 2019)。因而，E3泛素連接酶在病原體的復(fù)制、擴散與免疫逃避等眾多方面發(fā)揮著重要作用。本研究以真核生物體內(nèi)普遍存在且高度保守的E3泛素連接酶為切入點，對主要媒介蜱類E3泛素連接酶的多態(tài)性進(jìn)行初步探討，以期為進(jìn)一步揭示蜱蟲對多種病原體的媒介作用的分子機制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源

森林革蜱Dermacentorsilvarum：2020年4月采自內(nèi)蒙古扎蘭屯市巴林鎮(zhèn)風(fēng)景區(qū)(N47° 49′07″， S 122° 28′7″)，20只為一組，雄性(QTHTS_01)，雌性(QTHTS_02～03)。

全溝硬蜱Ixodespersulcatus和嗜群血蜱Haemaphysalisconcinna2020年7月采自牡丹江市海林縣大石溝林場(N44° 59′26″， S 129° 38′12″)。20只為一組，全溝硬蜱雌性(QTHTS_04～05)、全溝硬蜱雄性(QTHTS_06)，森林革蜱雄性QTHTS_07)、森林革蜱雌性QTHTS_08)。

1.2 試劑來源

DNA/RNA共提試劑盒(DNA/RNA Isolation Kit)和不含RNA酶的DNA酶I(RNase-Free DNase I)均由天根生化科技(北京)有限公司提供。

1.3 核酸提取與高通量測序

根據(jù)高通量測序?qū)颖緷舛鹊囊?，結(jié)合濃度差異以20只為測序單位，建立8組測序單位。委托北京諾禾致源科技股份有限公司進(jìn)行RNA高通量測序。

1.4 序列及結(jié)構(gòu)分析方法

利用軟件CLC Genomics Workbench v3.6.1對所得的高通量數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，主要包括去雜(trinity)、拼接(assembly)、比對(alignment)、翻譯(translation)等步驟獲得可用的序列數(shù)據(jù)；再利用BLAST工具(www.ncbi.nlm.nih.gov)將所得的序列數(shù)據(jù)與GenBank中注冊的基因序列進(jìn)行同源性比較。與此同時,利用NCBI的保守域數(shù)據(jù)庫(CDD)對獲得的氨基酸序列結(jié)構(gòu)進(jìn)行注釋(Marchler-Baueretal., 2011)并推斷其功能位點。

表1 高通量測序結(jié)果Tab.1 High-throughput sequencing result

1.5 系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹的構(gòu)建

以嗜群血蜱E3泛素連接酶CDS同源序列為基礎(chǔ)，在已完成全基因組測序的長角血蜱(CM023451.1)中檢索同源序列；同樣，以肩突硬蜱E3泛素連接酶CDS在已完成基因組測序的全溝硬蜱(JABSTQ010009524.1)中檢索同源序列；以此類推，我們獲得了亞洲璃眼蜱(CM023483.1)的E3泛素連接酶CDS同源序列。同時,從GenBank獲得其他相關(guān)節(jié)肢動物的E3泛素連接酶編碼序列，包括軟蜱科圖卡鈍緣蜱Ornithodorosturicata、森林革蜱D.silvarum、網(wǎng)紋革蜱D.reticulatus、亞洲璃眼蜱Hyalommaasiaticum、肩突硬蜱I.scapularis、蓖子硬蜱I.ricinus、微小扇頭蜱Rhipicephalusmicroplus、血紅扇頭蜱R.sanguineus、麗色扇頭蜱R.pulchellus、黃色大蜜蜂Apisdorsata、麗蠅蛹集金小蜂Nasoniavitripennis、大腹鬼蛛Araneusventricosus、橫紋金蛛Argiopebruennichi等。基于這15個節(jié)肢動物的E3泛素連接酶CDS同源序列，以黑猩猩Pantroglodytes為外群，采用鄰接法Neighbor-Join 和 BioNJ 算法構(gòu)建基于E3泛素連接酶SH3RF異構(gòu)體編碼序列遺傳距離的系統(tǒng)發(fā)育樹，并對模型進(jìn)行最大似然估計(Maximum Composite Likelihood approach, MCL)以評價系統(tǒng)發(fā)育的有效性，NJ的構(gòu)建與評估由MEGA7.0系統(tǒng)完成。

2 結(jié)果

2.1 高通量質(zhì)量評估

8組測序結(jié)果整體測序錯誤率均小于5%(表1)，原始讀長數(shù)與清潔讀長數(shù)十分接近，表明此次高通量測序質(zhì)量較高，結(jié)果可信。

2.2 媒介蜱類E3泛素連接酶的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系

從8組樣品分別獲得了與已知蜱類E3泛素連接酶高度同源(氨基酸序列大于80%)的編碼序列，經(jīng)Blast同源比對從森林革蜱發(fā)現(xiàn)E3泛素連接酶高度同源序列2條(MW354543、MW354544)、嗜群血蜱1條(MW354545)。森林革蜱、嗜群血蜱的同源序列同已知的森林革蜱E3泛素連接酶SH3RF3異構(gòu)體的同源性分別達(dá)到99.30%～99.56%(森林革蜱)和76.29%(嗜群血蜱)，而同肩突硬蜱E3泛素連接酶SH3RF3異構(gòu)體差異較大，同源性僅達(dá)64.01%～66.11%(森林革蜱)和72.38%(嗜群血蜱)(表2)。

E3泛素連接酶SH3RF3異構(gòu)體的氨基酸序列在進(jìn)化中表現(xiàn)出種屬特異性特征，且這些特征差異隨蜱種的分類地位和系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系逐漸分化(圖1)；其中，以圖卡鈍緣蜱Ornithorodosturicata為代表的軟蜱科與硬蜱科之間形成了明顯的分支；硬蜱科中以硬蜱屬為代表的硬蜱亞科形成獨立分支，同扇頭蜱亞科(革蜱屬Dermacentor、扇頭蜱屬Rhipicephalus)、璃眼蜱亞科(璃眼蜱屬Hyalomma)以及血蜱亞科(血蜱屬Haemaphysalis)差異顯著；而后三者中，血蜱亞科分化較遠(yuǎn)，璃眼蜱亞科次之，扇頭蜱亞科中的革蜱屬和扇頭蜱屬則比較接近。

表2 高通量測序所獲得得蜱類E3泛素連接酶Tab.2 The E3 Ubiquitin Ligase sequences obtained by high throughput sequencing

圖1 基于E3泛素連接酶SH3RF3異構(gòu)體氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.1 Phylogenetic analysis based on E3 ubiquitin ligase SH3RF3 amino acid sequences of different vector tick species

2.3 主要媒介蜱類E3泛素連接酶的結(jié)構(gòu)多態(tài)性特征

圖2 主要蜱類E3泛素連接酶結(jié)構(gòu)域推測Fig.2 Conserved domain speculation of E3 ubiquitin ligase of major ticksa: E3泛素連接酶SH3RF3結(jié)構(gòu)模式圖; b: E3泛素連接酶SH3RF2結(jié)構(gòu)模式圖; c: 森林革蜱E3泛素連接酶保守結(jié)構(gòu)域(MW354543、MW354544); d: 全溝硬蜱E3泛素連接酶保守結(jié)構(gòu)域; e: 嗜群血蜱E3泛素連接酶保守結(jié)構(gòu)域; f: 長角血蜱E3泛素連接酶保守結(jié)構(gòu)域; g: 亞洲璃眼蜱E3泛素連接酶保守結(jié)構(gòu)域.a: Conserved domain on E3 ubiquitin-protein ligase SH3RF3; b: Conserved domain on E3 ubiquitin-protein ligase SH3RF2; c: Conserved domain speculation on Dernacentor silvarum MW354543 and MW354544; d: Conserved domain speculation on Ixodes persulcauts; e: Conserved domain speculation on Haemaphysalis concinna MW354545; f: Conserved domain speculation on Haemaphysalis longicornis; g: Conserved domain speculation on Hyalomma asiaticum.

測序獲得的森林革蜱E3泛素連接酶(MW354543)與GenBank中的E3 ubiquitin-protein ligase SH3RF3-like isoform X1 [D.silvarum]雖然在氨基酸序列上偶有變化，但是在5個結(jié)構(gòu)域的序列比對結(jié)果完全一致(圖2-c)；MW354544除在起始的N端的環(huán)指結(jié)構(gòu)RING-HC_SH3RF3存在大量的缺失外，C端的SH3_SH3RF_C和3個SH3保守域完全相同(圖2-c)?？梢?，森林革蜱轉(zhuǎn)錄獲得的MW354543、MW354544應(yīng)為SH3RF3型E3泛素連接酶，該酶在轉(zhuǎn)錄過程可出現(xiàn)N端的環(huán)指結(jié)構(gòu)缺失現(xiàn)象。同時，從全溝硬蜱Ixodespersulcatus(JABSTQ010009524.1)中檢索獲得E3泛素連接酶與肩突硬蜱SH3RF3的5個保守結(jié)構(gòu)域同源性高度一致(圖2-d)，亦為SH3RF3型。

嗜群血蜱E3泛素連接酶(MW354545)僅包含位于N端的RING鋅指結(jié)構(gòu)域和接下來的3個SH3域(SH3_SH3RF2_1、SH3_SH3RF2_1、SH3_SH3RF2_3)，沒有C端的SH3_SH3RF2_C (Luetal., 2020)(圖2-e)。SH3域又稱為POSHER，其功能是消除RING蛋白或心臟蛋白磷酸酶1結(jié)合蛋白 (HEPP1)。SH3RF3有4個SH3結(jié)構(gòu)域。與之不同，SH3RF2型E3泛素蛋白連接酶僅具3個SH3域(圖2-a、圖2-b)。依據(jù)結(jié)構(gòu)特征, 嗜群血蜱的MW354545應(yīng)為SH3RF2型E3泛素連接酶。同樣，從基因組測序檢索獲得的長角血蜱(CM023451.1)E3泛素連接酶在RING-HC結(jié)構(gòu)域和3個SH3域同嗜群血蜱同源性高度一致，保守域結(jié)構(gòu)也完全一致(圖2-f)，應(yīng)為SH3RF2型。

亞洲璃眼蜱Hyalommaasiaticum(CM023483.1)的全基因組中檢索獲得的E3泛素連接酶序列結(jié)構(gòu)復(fù)雜，不屬于已知的SH3RF1、SH3RF2和SH3RF3(圖2g)，可能為中間類型。

3 討論

泛素化是生物體普遍存在的、調(diào)控蛋白質(zhì)合成、加工、代謝過程的重要生理機制。泛素化過程是由E1泛素激活酶、E2泛素結(jié)合酶和E3泛素蛋白連接酶組成的三酶級聯(lián)反應(yīng)。E1酶以依賴于三磷酸腺苷的方式激活泛素并將其轉(zhuǎn)移到E2酶上，E2酶的活性位點半胱氨酸與泛素的C端羧基形成硫酯鍵。E3泛素連接酶與同時負(fù)載泛素的E2酶和特定底物相互作用介導(dǎo)泛素的轉(zhuǎn)移，最終在底物的賴氨酸ε氨基和泛素的C端羧基之間形成異肽鍵。E3泛素連接酶因其嚴(yán)格控制泛素化反應(yīng)的效率和底物特異性，所介導(dǎo)的泛素與底物結(jié)合形式復(fù)雜多樣，是泛素化級聯(lián)反應(yīng)過程的關(guān)鍵成分(Zhengetal., 2017)。目前，根據(jù)E3連接酶的特征結(jié)構(gòu)域和泛素轉(zhuǎn)移蛋白底物的機制，可分為3種主要類型：(1)RING E3s，這是泛素連接酶中含量最豐富的一種類型，其特征是存在1個被稱為RING的鋅結(jié)合結(jié)構(gòu)域或者是1個U-box結(jié)構(gòu)域，能介導(dǎo)泛素直接轉(zhuǎn)移到底物上、發(fā)揮支架的作用。(2)HECT E3s, 其功能是通過兩步反應(yīng)催化泛素轉(zhuǎn)移到蛋白底物，泛素首先轉(zhuǎn)移催化E3上的半胱氨酸，然后再從E3轉(zhuǎn)移到蛋白底物。(3)RBR E3s，其功能同樣是通過兩步反應(yīng)催化泛素轉(zhuǎn)移，RBR名稱源于兩個預(yù)測的環(huán)狀域(RING1和RING2)的存在，兩個環(huán)狀域由環(huán)間結(jié)構(gòu)域(IBR)分隔(Morreale et al., 2016)。其中，SH3RF3是具有活性的E3泛素蛋白連接酶的支架蛋白，它包含5個保守域，分別是位于N端的RING-HC_SH3RF3與4個SH3結(jié)構(gòu)域。SH3RF1與SH3RF3高度同源，也具4個SH3域；與之不同，SH3RF2型E3泛素蛋白連接酶僅具3個SH3域。SH3結(jié)構(gòu)域以其中等親和力和選擇性，優(yōu)先于PxxP基序同富含脯氨酸的配體特異性結(jié)合，在細(xì)胞中發(fā)揮著酶促反應(yīng)調(diào)節(jié)、信號通路組分的亞細(xì)胞定位以及介導(dǎo)多蛋白復(fù)合物裝配等多種功能 (Luetal., 2020)。

泛素化機制在節(jié)肢動物中普遍存在，果蠅E3泛素連接酶CTRIP和Slimm/β-TrCP被證實具有調(diào)節(jié)生物鐘(Lamazeetal., 2011)和維持體內(nèi)銅穩(wěn)態(tài)的生理作用 (Zhangetal., 2020)。更為重要的是泛素化機制在媒介節(jié)肢動物感染和傳播病原微生物的過程中也發(fā)揮十分重要的生理作用。庫蚊體內(nèi)的泛素連接酶Cullin 4(cullin RING ubiquitin ligase)具有親病毒性，上調(diào)表達(dá)的Cullin 4可促進(jìn)西尼羅病毒(WNV)在庫蚊體內(nèi)的復(fù)制(Paradkaretal., 2015)。肩突硬蜱體內(nèi)的E3泛素連接酶XIAP會調(diào)控嗜吞噬細(xì)胞無形體在其體內(nèi)的定植(Severoetal., 2013)。果蠅體內(nèi)的E3泛素連接酶dSmurf是神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞突觸重塑和軸突修剪所必需的重要成分(Chenetal., 2017)，雌性果蠅突觸復(fù)合體的組裝和分解也受體內(nèi)E3泛素連接酶Sina的調(diào)節(jié)(Hughesetal., 2019)。由此可見，深入分析媒介節(jié)肢動物的泛素化作用特征及其介導(dǎo)的傳播效能將是明確病原—媒介和宿主關(guān)系的重要契機。

本研究發(fā)現(xiàn)，不同蜱種轉(zhuǎn)錄表達(dá)的E3泛素連接酶在種類和亞型(異構(gòu)體)方面呈多樣化態(tài)勢，這種多樣化態(tài)勢是否同感染的特定蜱媒病原體(萊姆病螺旋體(Andersonetal., 1991)、森林腦炎(Dumpisetal., 1999)等)、抑或與蜱類吸血狀態(tài)相關(guān)，尚需深入系統(tǒng)地開展研究。 除此之外，盡管基因組檢索證實了E3泛素連接酶SH3RF3亞型的存在，但事實上3組60只全溝硬蜱均未獲得SH3RF亞型同源序列的轉(zhuǎn)錄結(jié)果，其可能的原因是(1)E3泛素連接酶編碼基因可有選擇性地轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，在特定情況下，病毒等病原體相關(guān)核酸小分子(dsRNA、siRNA)的干擾沉默可導(dǎo)致不表達(dá)。(2)病毒等病原體的感染誘發(fā)了蜱類泛素化蛋白修飾機制，轉(zhuǎn)錄、表達(dá)的SH3結(jié)構(gòu)功能蛋白瞬時被C Jun氨基末端激酶(C Jun-N-terminal Kinase, JNK)通路中的POSHER(消除)作用完全消耗。POSHER過程需要大量的泛素化支架蛋白以充當(dāng)蜱類靶標(biāo)器官或組織抗凋亡調(diào)節(jié)劑。鑒于泛素化蛋白修飾機制在諸多病原體的感染、傳播、宿主調(diào)節(jié)和免疫逃逸中發(fā)揮著重要作用，媒介生物E3泛素連接酶對不同病原體介導(dǎo)作用及其內(nèi)在分子機制也是亟待深入探討的基礎(chǔ)性科學(xué)問題。譬如，近年來肆虐的發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒(SFTSV)已經(jīng)證實可通過長角血蜱進(jìn)行經(jīng)卵和經(jīng)期傳播(Zhuangetal., 2018)，但該病毒對媒介蜱種的選擇性是否與長角血蜱E3泛素連接酶的特異性表達(dá)相關(guān)，還有待進(jìn)一步研究。