何 婷 艾樂樂 朱長強 胡 丹 王長軍 李 萌 譚偉龍**

(1.南京醫(yī)科大學附屬兒童醫(yī)院輸血科，江蘇南京 210000； 2.東部戰(zhàn)區(qū)疾病預防控制中心，江蘇南京 210000)

蜱蟲是一類專性吸血的媒介節(jié)肢動物，可以傳播細菌、病毒、立克次體等多種病原體(Chenetal., 2014)。其中，克里—米亞剛果出血熱病毒(CCHFV)(Leblebiciogluetal., 2016)、蜱傳腦炎病毒(TBEV)(Lindquistetal., 2008)和發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒(SFTSV)(Yuetal., 2011)等對人類具有較高的致病性。Dabieshan病毒和SFTSV、哈特蘭德病毒(HRTV)(Mcmullanetal., 2012)同屬布尼亞病毒目、白纖病毒科、白蛉病毒屬，節(jié)段式單股負鏈RNA病毒。2015年通過高通量測序技術首次發(fā)現(xiàn)該病毒(Shietal., 2016)。2016年本課題組通過對舟山地區(qū)蜱蟲高通量測序及特異性PCR技術發(fā)現(xiàn)該地區(qū)蜱蟲中廣泛攜帶Dabieshan病毒，陽性率高達64.9%(Zhuetal., 2020)。大多數(shù)布尼亞病毒NP蛋白能夠與RNA結合，協(xié)助RNA轉錄和復制，在病毒的入侵和定植中發(fā)揮作用(Fieldsetal., 1993)。本課題組前期發(fā)現(xiàn)的Dabieshan病毒NP蛋白(GenBank序列號MN723842.1)，雖然與致病的發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒(SFTSV) (GenBank序列號YP006504092.1)以及裂谷熱病毒(Rift Valley fever virus)(GenBank序列號ABQ2358.1)同屬于白蛉病毒屬的分支，但其位置上相距較遠，同源性只有29.88%和35.00%。相反，與2015年發(fā)現(xiàn)的Dabieshan病毒(GenBank序列號KM817733.1)和Yongjia病毒(GenBank序列號AJG39335.1)同源性比較高，分別為100%和55.06%(何婷，2019)。為了明確Dabieshan病毒NP蛋白的生物學功能，解析該病毒的潛在致病性和流行病學特征，實現(xiàn)對舟山地區(qū)蟲媒病毒的監(jiān)控和預警，本文以Dabieshan病毒NP蛋白生物信息學分析為基礎，成功表達和構建一種以NP蛋白為包被抗原的高特異性和敏感度的間接ELISA方法，后續(xù)將對采集地人群動物進行血清學的初步篩查。

1 材料與方法

1.1 材料

限制性內切酶XhoI/EcoRV、T4連接酶、JM-109/BL-21感受態(tài)細胞和質粒提取試劑盒均購自寶生物工程有限公司(大連)；Goat-anti-rabbit/mouse IgG-HRP購自博奧森生物技術公司(北京)；Anti-6×His Tag mouse monoclonal antibody購自Thermo Fisher Scientific(美國)；pET-32a空載體質粒由實驗室提供；Dabieshan病毒陽性cDNA來自舟山地區(qū)長角血蜱Haemaphysalislongicornis樣本，由本實驗室-80 ℃低溫冰箱保存；抗SFTSV病毒NP蛋白陽性兔血清由課題組提供(諸葛堯堯，2020)。

1.2 NP蛋白基因序列擴增

以Dabieshan病毒陽性的cDNA為模板，以帶有ECORV酶切位點的上游引物C C GG A T A T CA T G G G C G A C C A A G A T C TG和帶有XhoI酶切位點的下游引物C C GC T C G A GT C A G C C C A G G A G C T G G C GG進行PCR擴增。PCR反應體系(50 μL)： 2×premix taq 25 μL，上下游引物各1 μL，cDNA模板1 μL，ddH2O 25 μL。反應條件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min共計35循環(huán)，最后延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠鑒定以后，回收純化目的片段。

1.3 重組質粒構建

將純化好的帶有酶切位點的NP基因片段和pET-32a空載體質粒進行雙酶切反應，酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠鑒定后回收純化。T4連接酶于16 ℃連接NP片段和載體片段，重組質粒經(jīng)JM109感受態(tài)細胞轉化，擴增培養(yǎng)后，收集純化pET-32a-NP質粒，并且用T7通用引物進行測序，保證序列連接的準確性。

1.4 重組蛋白表達純化

將pET-32a-NP質粒轉化到BL21感受態(tài)細胞中，加入終濃度為0.1 mmol/L的IPTG誘導蛋白高表達，37 ℃培養(yǎng)4 h后，冰浴超聲破碎菌體后，取上清和沉淀分別進行SDS-PAGE確定蛋白表達形式，用含His-tag的鎳柱對蛋白進行收集純化。

1.5 Western Blot實驗

將經(jīng)鎳柱收集純化的NP重組蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳后轉移到PVDF膜，用5%脫脂乳4 ℃封閉過夜。以抗-His單克隆抗體(1∶5000)為一抗，4 ℃孵育過夜，TBST緩沖液洗3次,再加入HRP標記的羊抗鼠IgG (1∶5000)為二抗37 ℃孵育1 h，TBST緩沖液洗3次后顯色。

1.6 間接ELISA方法建立

1.6.1包被NP抗原濃度確定:將經(jīng)Western Blot鑒定后的NP蛋白(原始濃度為300 μg/mL)按照1∶1、1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256、1∶512、1∶1024、1∶2048 倍比稀釋包被ELISA板，將兔血清按照1∶104、 1∶ 5×104和1∶105比例稀釋后作為一抗，棋盤滴定法依據(jù)P/N值確定抗原抗體最佳反應比。

1.6.2酶標二抗?jié)舛却_定：以棋盤滴定結果確定的最佳抗原包被濃度和一抗?jié)舛茸鳛榉磻獥l件，在此條件下，將二抗以1∶1000，1∶5000和1∶10000比例稀釋，確定二抗最佳反應濃度。

1.6.3最佳底物反應時間確定：根據(jù)上述實驗確定的最佳抗原抗體反應濃度，設置3個孔，分別顯色5、10和15 min，確定最佳底物顯色時間。

1.7 特異性實驗

按照上述確定的最佳試驗條件，以發(fā)熱伴血小板減少綜合征NP蛋白兔免疫血清作為對照，確定Dabieshan病毒NP蛋白是否和發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒陽性血清存在血清學交叉反應。

1.8 板內重復性實驗

按照上述確定的最佳實驗條件，設置3塊ELISA板，每塊板隨機選取8個孔，重復滴定，測定各孔OD450值。

2 結果

2.1 重組質粒陽性克隆PCR驗證

利用針對PET-32a質粒載體的通用引物對T7，對轉化有PET-32a-NP重組質粒的感受態(tài)細胞JM109的單克隆菌落進行PCR驗證，如圖1所示。將PCR陽性的單克隆擴增培養(yǎng)后進行DNA測序，返回序列在NCBI核苷酸數(shù)據(jù)庫上進行比對，沒有gap，也沒有突變位點形成終止密碼子，說明序列插入正確，pET-32a-NP質粒構建成功，可用于后續(xù)的蛋白原核表達。

圖1 PCR驗證單克隆菌落Fig.1 Identification of monoclonal colony by PCR1,4,5,7：陽性菌落；2,3,6：陰性菌落.1,4,5,7: Positive colony; 2,3,6: Negative colony.

2.2 重組蛋白表達形式鑒定

經(jīng)重組質粒小樣誘導表達后發(fā)現(xiàn)，IPTG能夠誘導NP蛋白順利表達。由于蛋白是可溶性表達還是以包涵體形式存在，將影響后續(xù)蛋白的純化方法，所以將全菌、上清和沉淀分別進行SDS-PAGE。結果如圖2-a所示，發(fā)現(xiàn)在上清和沉淀中均有表達，條帶大小48 kDa與預期一致，因上清表達量強于沉淀并且上清中可溶性蛋白純化操作較為簡便，故選取上清作為后續(xù)NP蛋白純化的對象。如圖2-b所示，用不同濃度咪唑進行洗脫收集，各濃度洗脫液經(jīng)SDS-PAGE電泳發(fā)現(xiàn)，咪唑濃度在100～200 mmol/L時，目的條帶純度最高。

圖2 NP蛋白表達純化Fig.2 The expression and purification of NP proteina:重組蛋白表達形式鑒定; b:不同濃度咪唑洗脫液SDS-PAGE電泳鑒定.a: Identification of the expression forms; b: SDS-PAGE electrophoresis analysis.

2.3 Western Blot實驗

由于純化的NP重組蛋白上表達6 × His-tag，可以與抗-His單克隆抗體有特異性結合反應。Western Blot實驗結果如圖3所示，顯示在48 kDa處出現(xiàn)特異性單一條帶，與SDS-PAGE條帶大小相符合。

圖3 Western Blot鑒定重組蛋白Fig.3 Western Blot of expressed recombinant protein

2.4 間接ELISA反應條件的確定

2.4.1抗原抗體反應濃度的確定: 棋盤滴定結果表明，當NP蛋白按1∶128稀釋(原始濃度為300 μg/mL)，兔血清按1∶5×104稀釋時，P/N反應值最大，表明該稀釋度下，抗原抗體結合反應最佳。

2.4.2二抗反應濃度的確定: 按照上述優(yōu)化的最佳抗原抗體稀釋比例，將商品化羊抗兔IgG-HRP抗體作為二抗按照1∶1000，1∶5000和1∶10000 稀釋，檢測不同二抗稀釋度下P/N值。結果表明，當以1∶5000稀釋度稀釋二抗時，P/N反應值最大。

2.4.3最佳底物反應時間: 按照上述優(yōu)化的反應條件，設置檢測底物反應時間為5、10和15 min時的P/N值，發(fā)現(xiàn)當顯色時間為15 min時，P/N反應值最大。

2.5 血清學反應特異性

利用以上建立的間接ELISA方法，對抗SFTSV病毒NP蛋白陽性兔血清進行檢測。結果如圖4所示，發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒抗NP兔血清與Dabieshan病毒重組NP蛋白不存在交叉反應，特異性好。

圖4 間接ELISA方法特異性檢測Fig.4 Identification of the specificity of the indirect ELISA method

2.6 板內重復性檢測

測定每塊板8個復孔OD450，計算ELISA板板內變異系數(shù)，結果如圖5顯示，板內變異系數(shù)范圍在5.57%～8.22%，表明該ELISA板內重復性較好。

圖5 重復性實驗Fig.5 The repeat tests of the indirect ELISA method

3 討論

蜱蟲作為一種專性吸血的節(jié)肢動物，可攜帶并傳播有大量病原體，近年來，不斷出現(xiàn)由于蜱蟲叮咬而染病的報道(Yuetal., 2011; Mengetal., 2019)。高通量測序技術的應用極大地豐富了人們對蜱媒病毒的了解，2015年通過高通量測序技術首次發(fā)現(xiàn)新病毒—Dabieshan病毒的存在(Lietal., 2015)。與傳統(tǒng)的白蛉病毒屬不同，Dabieshan病毒存在M片段缺失的現(xiàn)象。本課題前期研究發(fā)現(xiàn)，浙江舟山群島地區(qū)蜱蟲自然感染Dabieshan病毒率較高，而江蘇鹽城地區(qū)則未檢出該病毒。作為一種新發(fā)現(xiàn)的病毒，對于Dabieshan病毒本身繁殖周期和對人類感染性和致病性的研究資料甚少。因此，了解人群中Dabieshan病毒的流行情況，對于判斷該病毒的致病性有重要參考價值。

間接ELISA作為一種利用固化已知抗原檢測未知血清樣本的方法，適用于大規(guī)模臨床血清樣本的篩查，特別是現(xiàn)場快速篩查和基層醫(yī)療初篩( Newcombeetal.,2007)。本研究中通過摸索最佳抗原抗體反應濃度、二抗反應濃度和底物反應時間等一系列實驗條件對Dabieshan病毒間接ELISA檢測方法進行優(yōu)化，初步確認了該方法具有較好的重復性和特異性。IgG類抗體在體內存在時間長、含量高、易于檢測，可檢測既往感染情況。本實驗探究性地將新建立的ELISA方法應用于蜱蟲高攜帶Dabieshan病毒的區(qū)域(舟山)和未攜帶區(qū)(鹽城)人群的血清學檢測，本次測定的人群OD450值均較低，大都集中正在0.2附近，且兩地區(qū)人群血清中抗NP抗體含量不存在顯著性差異，表明舟山地區(qū)可能不存在Dabieshan病毒引起的既往感染(由于缺乏人群的陰性和陽性對照，故實驗結果未列出相關數(shù)據(jù))。但由于本次測定所選取的人群標本來自健康人群，因此加入真正的陽性及陰性對照并進一步擴大人群的檢測范圍，將更具有科學意義和應用價值。攜帶Dabieshan病毒的蜱蟲一部分來自于牛、羊等家畜，至于這些動物血清中是否存在相應病毒NP抗體也是后續(xù)研究需要明確的內容。本次研究成功制備了Dabieshan病毒NP蛋白抗原，為Dabieshan病毒蛋白功能研究和疫苗研制奠定基礎；以NP蛋白為固相抗原成功構建的間接ELISA方法，可望應用于人群血清學篩查，為了解該病毒致病性和傳染性乃至科學防控措施提供了重要的人群流行資料。