孫博，林嘉杰，王樹松，孫紹光

·綜述·

siRNA和microRNA用于抗病毒的研究進(jìn)展

孫博，林嘉杰，王樹松，孫紹光

050017 石家莊，河北醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院（孫博、林嘉杰、王樹松、孫紹光）；050051 石家莊，河北省計(jì)劃生育科學(xué)技術(shù)研究院（孫博、王樹松）

1999 年，Hamilton 和 Baulcombe[1]首次提出了小干擾 RNA（small interfering RNA，siRNA）的概念，發(fā)現(xiàn)植物中自然發(fā)生的 siRNA 能引起轉(zhuǎn)錄后的基因沉默現(xiàn)象。2001 年，Elbashir 等[2]發(fā)現(xiàn)合成的 siRNA 能夠引起不同哺乳動(dòng)物細(xì)胞系的基因沉默現(xiàn)象。這一發(fā)現(xiàn)表明，通過合成 siRNA 能夠引發(fā)可控的基因沉默現(xiàn)象，甚至有可能作為基因特異性治療劑。近年來，通過 siRNA 來沉默病毒復(fù)制關(guān)鍵基因的表達(dá)，已成為抗病毒感染研究的熱點(diǎn)。1993 年，Lee 等[3]在秀麗隱桿線蟲中首次發(fā)現(xiàn)了微 RNA（microRNA，miRNA）。該線蟲中 lin-4 基因的兩種小轉(zhuǎn)錄物（分別為 22 和 61 nt）能與 lin-14 mRNA 的 3'-UTR 發(fā)生堿基互補(bǔ)配對(duì)，從而抑制 lin-14 mRNA 的翻譯。2000 年，Pasquinelli 等[4]發(fā)現(xiàn)了第二種 miRNA——let-7，同時(shí)發(fā)現(xiàn) let-7 在不同物種中高度保守。這促使大量研究人員投入到 miRNA 的研究中。隨著研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn) miRNA 水平的紊亂與多種疾病的發(fā)生有關(guān)[5-6]。需要特別指出的是，miRNA 在病毒感染過程中發(fā)揮重要作用。有研究表明，miRNA 既能抑制病毒在宿主細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制，也能促進(jìn)病毒在宿主細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制[7-8]。這說明 miRNA 模擬物和 miRNA 拮抗劑有望成為抗病毒藥物的研發(fā)熱點(diǎn)。因此，探究參與病毒感染過程中的 siRNA 和 miRNA，對(duì)病毒感染的治療具有重大意義。

1 siRNA 和 miRNA 的生成

siRNA 是一種長度為 21 ~ 23 bp 的小片段雙鏈 RNA（double stranded RNA，dsRNA），主要引起 RNAi 現(xiàn)象。siRNA 誘導(dǎo) RNAi 的基本過程如下[9-11]：首先，外源性 dsRNA 通過 Dicer 酶和 TAR-RNA 結(jié)合蛋白（TAR-RNA binding protein，TRBP）的剪切，形成 21 ~ 23 bp 的 siRNA。然后，siRNA 與 AGO 復(fù)合體結(jié)合形成 RNA 誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體（RNA-induced silencing complex，RISC）。最后，siRNA 被解鏈成單鏈 RNA，通過與靶 mRNA 匹配來進(jìn)一步發(fā)揮作用。

miRNA 是由內(nèi)源性基因轉(zhuǎn)錄生成的長度約為 22 nt 的單鏈 RNA 分子，對(duì)靶 mRNA 的轉(zhuǎn)錄后水平降解和翻譯水平抑制能夠引起 RNAi 現(xiàn)象。miRNA 的經(jīng)典生成途徑如下[10, 12-16]：首先，在 RNA 聚合酶 II（RNA pol II）的作用下，編碼 miRNA 的內(nèi)源性基因在細(xì)胞核中轉(zhuǎn)錄生成初級(jí) miRNA（primary miRNA，pri-miRNA）。然后，pri-miRNA 經(jīng)微處理器的作用下剪切 3' 端和 5' 端的核苷酸序列生成前體 miRNA（precursor miRNA，pre-miRNA），其中微處理器是由 Drosha 酶、DGCR8 蛋白以及其他幾種輔助因子構(gòu)成。pre-miRNA 經(jīng) Exportin 5 復(fù)合物轉(zhuǎn)運(yùn)出核后，在細(xì)胞質(zhì)中經(jīng)過 Dicer 酶和 TRBP 進(jìn)一步剪切生成不完全互補(bǔ)配對(duì)的 miRNA 雙鏈。最后，miRNA 雙鏈與 AGO 復(fù)合體結(jié)合形成 RISC，miRNA 雙鏈繼而解鏈成單鏈 miRNA，保留在 RISC 中的即為成熟的單鏈 miRNA。除上述 miRNA 的經(jīng)典生成途徑外，miRNA 還有兩種非經(jīng)典生成途徑：一是不依賴微處理器的 miRNA 生成途徑[17]，二是不依賴 Dicer 酶的 miRNA 生成途徑[18]。

2 抗病毒研究進(jìn)展

2.1 siRNA 抗病毒研究

2.1.1 人乳頭瘤病毒 與大多數(shù)病毒不同，人乳頭瘤病毒（human papillomavirus，HPV）在感染細(xì)胞后不會(huì)在同一細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生子代病毒。相反，HPV 會(huì)在宿主細(xì)胞分裂出的子代細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行病毒復(fù)制[19]。HPV 基因組表達(dá)的 E6/E7 癌蛋白會(huì)影響宿主細(xì)胞的細(xì)胞周期，在抑制宿主細(xì)胞分化狀態(tài)的同時(shí)會(huì)使細(xì)胞無限增殖[20]。已有研究表明，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組中轉(zhuǎn)染 HPV E7 siRNA 的 HeLa 細(xì)胞存活率明顯升高，細(xì)胞中HPV 的復(fù)制顯著受到抑制[21]。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，通過多離子復(fù)合物膠囊靶向遞送 HPV E6/E7 siRNA 進(jìn)入腫瘤小鼠體內(nèi)，結(jié)果顯示小鼠體內(nèi) HPV 復(fù)制減少，腫瘤生長受到抑制[22]。因此，靶向 HPV E6/E7 mRNA 的siRNA 可通過發(fā)揮抗 HPV 的作用，來治療由 HPV 感染引起的宮頸癌等疾病。

2.1.2 呼腸孤病毒 呼腸孤病毒（reoviruses，REO）基因組包含大約 10 個(gè) dsRNA 片段。Kobayashi 等[23]用質(zhì)粒載體構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá) siRNA 的 293T 細(xì)胞系，穩(wěn)定表達(dá)的 siRNA 特異性靶向 REO T3D 株的非結(jié)構(gòu)蛋白 sigmaNS 和 muNS 以及核心蛋白 mu2 的 mRNA。在該 293T 細(xì)胞系中，REO T3D 株復(fù)制被顯著抑制，并且該抑制作用具有特異性，只對(duì) REO T3D 株具有抑制作用。另外，在昆蟲體內(nèi)也發(fā)現(xiàn) siRNA抑制 REO 復(fù)制的現(xiàn)象[24]。因此，siRNA 是潛在的抗 REO 藥物。

2.1.3 冠狀病毒 多項(xiàng)研究表明，特異性 siRNA 具有抗嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)綜合征冠狀病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus，SARS-CoV）感染的作用。Wu 等[25]設(shè)計(jì)了 7 個(gè)靶向 SARS-CoV 病毒序列的 siRNA，結(jié)果表明靶向刺突蛋白 S 和 3'-UTR 的 siRNA 能夠抑制 SARS-CoV 在 Verno-E6 細(xì)胞中的復(fù)制。Shi 等[26]通過靶向 SARS-CoV 的包膜蛋白（envelope protein，E 蛋白）、核衣殼蛋白（nucleocapsid protein，N 蛋白）和膜蛋白（membrane protein，M 蛋白）mRNA 設(shè)計(jì)了 26 個(gè) siRNA，結(jié)果表明 3 個(gè)siRNA 對(duì)病毒的抑制率能夠超過 70%，11 個(gè) siRNA 的抑制率在 40% ~ 70% 之間，并且發(fā)現(xiàn)聯(lián)合使用靶向病毒 mRNA 不同區(qū)域的 siRNA 會(huì)提高病毒抑制率。在動(dòng)物模型研究方面，Tang 等[27]在恒河猴模型上證明了 siRNA 抗 SARS-CoV 病毒的有效性，并且 siRNA 劑量在 10 ~40 mg/kg 時(shí)，沒有表現(xiàn)出毒性作用。因此，根據(jù) SARS-CoV 基因組設(shè)計(jì)出的 siRNA，在細(xì)胞和動(dòng)物模型水平顯示出有效的抗 SARS-CoV 活性。需要特別指出的是，針對(duì)今年在全球肆虐的嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)綜合征 2 型冠狀病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2），Alnylam 制藥公司已經(jīng)在開發(fā)靶向 SARS-CoV-2 中的關(guān)鍵蛋白mRNA 的 siRNA，用來治療 SARS-CoV-2 感染導(dǎo)致的新型冠狀病毒肺炎（corona virus disease 2019，COVID-19）。siRNA 療法能給 COVID-19 提供新的治療思路。

2.1.4 呼吸道合胞病毒 呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus，RSV）基因組中最保守的區(qū)域之一是生成核蛋白（nucleoprotein，N）、磷蛋白（phosphoprotein，P）和大蛋白（large protein，L）mRNA 的基因[28]。有研究表明，靶向 N 蛋白 mRNA 的 siRNA（即 ALN-RSV01）具有很高的抗病毒活性，體外實(shí)驗(yàn)用人肺上皮細(xì)胞檢測 ALN-RSV01 的體外抑制活性，其抑制率高達(dá) 97%[29]。用 BALB/c 小鼠作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，進(jìn)一步檢測 ALN-RSV01 在小鼠體內(nèi)的抑制活性發(fā)現(xiàn)，ALN-RSN01 仍可有效降低小鼠體內(nèi)的病毒滴度[29]。因此，靶向 N、P 和 L mRNA 的 siRNA 是潛在的抗 RSV 藥物。

2.1.5 人類免疫缺陷病毒 研究人員發(fā)現(xiàn)，人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）的反式轉(zhuǎn)錄激活因子（transactivator of transcription，Tat）或負(fù)調(diào)控因子（negative factor，Nef）mRNA 是設(shè)計(jì) siRNA 的潛在靶點(diǎn)。研究人員將以 Tat 和 Nef 為靶點(diǎn)設(shè)計(jì)的特異性 siRNA 轉(zhuǎn)染 HIV 感染的人胚腎細(xì)胞（HEK293），發(fā)現(xiàn) siRNA 顯著抑制 HIV 復(fù)制，降低細(xì)胞內(nèi)的病毒含量[30]。為了達(dá)到更好的抗病毒效果，研究人員開發(fā)出了更好靶向遞送 siRNA 的適配體-siRNA 偶聯(lián)物，得到更有效的抗 HIV 治療效果[31]。

綜上所述，siRNA 對(duì)多種核酸類型的病毒都具有顯著的抗病毒活性（表 1）。siRNA 具有高度特異性，是潛在的新型抗病毒藥物。因此，siRNA 藥物的開發(fā)成為 RNAi 療法的關(guān)鍵，是迄今為止對(duì)現(xiàn)有抗病毒療法最有力的顛覆。

表 1 siRNA 抗病毒靶點(diǎn)

2.2 miRNA 抗病毒研究

2.2.1 人乳頭瘤病毒 miRNA 與宿主細(xì)胞抗 HPV 感染密切相關(guān)。Wu 和 Chen[32]研究發(fā)現(xiàn)，miR-375 能夠升高 p53 和 p21 的表達(dá)水平，降低 Cyclin D1 和 IGF-1R 的表達(dá)水平，從而抑制 HPV-18 陽性的宮頸癌細(xì)胞增殖；還能夠增強(qiáng) caspase-3 和 caspase-9 的活性，升高 Bax 的表達(dá)水平，降低Bcl-2 和survivin 的表達(dá)水平，從而促進(jìn) HPV-18 陽性的宮頸癌細(xì)胞凋亡。Fujii 等[8]研究發(fā)現(xiàn)，miR-331-3p 對(duì)神經(jīng)纖毛蛋白 2（neuropilin 2，NPR2）的靶向作用使得 E6/E7 mRNA 的表達(dá)水平降低，從而抑制 HPV 復(fù)制和宮頸癌細(xì)胞增殖。Gao 等[33]研究發(fā)現(xiàn)，在 HPV 感染的人表皮角化細(xì)胞中，miR-34a-5p 通過靶向 JAG1/Notch1通路，從而抑制細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。Zamani 等[34]研究發(fā)現(xiàn)，miR-29a 和 miR-21 分別在 HPV 感染所致的宮頸癌細(xì)胞中顯著下調(diào)和上調(diào)，是潛在的宮頸癌抑癌因子和致癌因子。因此，研究 miRNA 在 HPV 感染中的調(diào)控作用，將有助于研發(fā)抗 HPV 感染的 miRNA 藥物。

2.2.2 輪狀病毒 miRNA 在輪狀病毒（rotavirus，RV）感染與宿主細(xì)胞抗RV 感染過程中發(fā)揮重要作用。Zhou 等[7]研究發(fā)現(xiàn)，在病毒感染的早期，RV 的 NSP4 基因會(huì)編碼一種 miRNA——RV-vsRNA1755。該 miRNA 對(duì)宿主細(xì)胞 IGF1R 的靶向作用導(dǎo)致后者表達(dá)水平降低，并通過 PI3K/Akt/mTOR 通路觸發(fā)細(xì)胞自噬，而 RV 進(jìn)一步利用細(xì)胞自噬，促進(jìn)自身復(fù)制。Mukhopadhyay 等[35]研究發(fā)現(xiàn)，RV 感染導(dǎo)致 let-7 表達(dá)下調(diào)和 miR-99b 表達(dá)上調(diào)，let-7g 的下調(diào)通過調(diào)控 TSC1/2 和 Rheb-GTP 間接抑制 mTOR 的表達(dá)水平，而 miR-99b 的上調(diào)直接抑制 mTOR 的表達(dá)水平，兩種 miRNA 協(xié)同作用促進(jìn)細(xì)胞自噬，從而促進(jìn) RV 復(fù)制。Chanda 等[36]研究發(fā)現(xiàn)，RV 編碼的非結(jié)構(gòu)蛋白5（nonstructural protein 5，NSP5）能夠上調(diào) miR-142-5p 的表達(dá)水平，后者通過調(diào)控轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）信號(hào)通路，從而促進(jìn) RV復(fù)制。Tian 等[37]研究發(fā)現(xiàn)，miR-525-3p 在 RV 感染時(shí)顯著下調(diào)，其能通過靶向 RV 非結(jié)構(gòu)蛋白 1（nonstructural protein 1，NSP1）的 3'-UTR，從而抑制 RV 復(fù)制。因此，根據(jù) miRNA 在 RV 復(fù)制過程中的促進(jìn)或抑制作用，研發(fā)相應(yīng)的 miRNA 拮抗劑和模擬物，將成為潛抗 RV 感染的新突破口。

2.2.3 登革熱病毒 miRNA 在抗登革熱病毒（Dengue virus，DENV）感染方面具有重要作用。宿主細(xì)胞 miRNA 可直接靶向登革熱病毒RNA 發(fā)揮抗病毒作用[38-39]。Wen等[38]發(fā)現(xiàn)了第一個(gè)靶向 DENV 的宿主細(xì)胞miRNA—— miR-548g-3p，其可直接靶向 DENV 5'-UTR 的病毒復(fù)制的關(guān)鍵元件——SLA 啟動(dòng)子序列，從而抑制病毒復(fù)制。隨后，Castrillon-Betancur 和Urcuqui-Inchima[39]研究發(fā)現(xiàn)，DENV 可誘導(dǎo)宿主細(xì)胞中 miR-484 和 miR-744 表達(dá)水平的下調(diào)；而 miR-484 和 miR-744 能夠靶向 DENV 3'-UTR，過表達(dá)這兩種 miRNA 能夠抑制 DENV 復(fù)制。另外，miRNA 還可以通過增強(qiáng)宿主細(xì)胞對(duì) DENV 感染的應(yīng)答（如免疫應(yīng)答或防御機(jī)制），從而抑制 DENV 復(fù)制[40-41]。Escalera-Cueto 等[40]研究發(fā)現(xiàn)，let-7c 在感染 DENV 的人肝癌細(xì)胞（Huh-7 細(xì)胞）中顯著上調(diào)，并通過抑制靶基因 BACH1 的表達(dá)水平，間接上調(diào)抗炎抗氧化蛋白 HO-1 的表達(dá)水平，從而抑制受感染細(xì)胞中的 DENV 復(fù)制，參與宿主細(xì)胞的抗病毒先天免疫應(yīng)答。Zhu 等[41]研究發(fā)現(xiàn)，miR-30e* 在感染DENV的HeLa 細(xì)胞中顯著上調(diào)，并通過 IκBα/IFN-β 抑制 DENV 復(fù)制，參與宿主細(xì)胞的抗病毒先天免疫應(yīng)答。因此，研究 DENV 感染期間的 miRNA 表達(dá)水平變化，將為 DENV 的治療提供新視角。

2.2.4 甲型流感病毒 miRNA在宿主細(xì)胞抗甲型流感病毒（influenza A virus，IAV）感染和傳統(tǒng)中草藥防治 IAV 中發(fā)揮重要作用。Song 等[42]首先發(fā)現(xiàn)了 miRNA 能夠抑制IAV復(fù)制。犬腎細(xì)胞（MDCK 細(xì)胞）中的 3 個(gè) miRNA（miR-323、miR-491 和 miR-654）通過靶向 H1N1 IAV 來源的堿性聚合酶 1（polymerase basic protein 1，PB1）的 3'-UTR，導(dǎo)致 PB1 的表達(dá)水平降低，從而抑制 H1N1 IAV 復(fù)制。Zhang 等[43]研究發(fā)現(xiàn)，在 H5N1 IAV 感染的A549 細(xì)胞中，宿主細(xì)胞 miR-203 的表達(dá)水平上調(diào)，并通過靶向抑制轉(zhuǎn)錄下調(diào)因子 1（down-regulator of transcription 1，DR1）的表達(dá)水平，從而抑制 H5N1 IAV 復(fù)制，發(fā)揮抗病毒感染作用。Cui 等[44]研究發(fā)現(xiàn)，miR-188-3p 具有廣譜抗 IAV 活性。A549 細(xì)胞中的 miR-188-3p 直接靶向抑制IAV 編碼的堿性聚合酶 2（polymerase basic protein 2，PB2）的蛋白表達(dá)水平，從而有效抑制 IAV（H1N1、H5N6 和 H7N9）復(fù)制。有趣的是，Zhou 等[45]研究發(fā)現(xiàn)，傳統(tǒng)中草藥金銀花中的一種非典型 miRNA——MIR2911，能夠靶向抑制 H1N1 IAV 編碼的 PB2 和非結(jié)構(gòu)蛋白 1（nonstructural protein 1，NS1）的表達(dá)水平，從而抑制 H1N1 IAV 復(fù)制；還能夠在體內(nèi)外抑制 H5N1 IAV 和 H7N9 IAV 復(fù)制。即，MIR2911 和含 MIR2911 的金銀花煎煮液具有廣譜的抗 IAV 活性，可用于抑制致命的 IAV 感染。因此，宿主細(xì)胞和中草藥中的 miRNA 是抗 IAV 感染的潛在因子。

2.2.5 人類免疫缺陷病毒 miRNA 是潛在的抗人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）感染的新興分子。Bochnakian 等[46]研究發(fā)現(xiàn)，抗病毒因子干擾素（interferon，IFN）能夠上調(diào) miR-128 的表達(dá)水平，后者通過靶向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 3（transportin 3，TNPO3）mRNA 的 CDS 和 3'-UTR，顯著下調(diào) TNPO3 的 mRNA 和蛋白表達(dá)水平，從而抑制宿主細(xì)胞中的 HIV-1 復(fù)制。Ortega 等[47]研究發(fā)現(xiàn)，在 HIV-1 感染的外周血單核細(xì)胞中，白細(xì)胞介素-21（interleukin 21，IL-21）誘導(dǎo)的 miR-29 上調(diào)能夠抑制病毒復(fù)制，限制早期 HIV-1 感染程度。因此，發(fā)現(xiàn)抗 HIV 感染的 miRNA 分子，將為 HIV 治療帶來新的希望。

2.2.6 EB 病毒 miRNA 在 EB 病毒(Epstein-Barr virus，EBV)感染中發(fā)揮作用。Hooykaas 等[48]研究發(fā)現(xiàn)，EB 病毒編碼的 miR-BART16 通過靶向 type I IFN 信號(hào)通路中的 CREB 結(jié)合蛋白（CREB-binding protein，CBP）的 3'-UTR 并下調(diào)后者的表達(dá)水平，抑制抗病毒因子 IFN 的生成，從而促進(jìn) EBV 感染和復(fù)制。因此，miR-BART16 拮抗劑是潛在的抗 EBV 藥物。

2.2.7 白斑綜合征病毒 miRNA 在白斑綜合征病毒（white spot syndrome virus，WSSV）感染中發(fā)揮作用。Huang 等[49]研究發(fā)現(xiàn)，在感染白斑綜合征病毒的南美白對(duì)蝦的胃中檢測到宿主 miR-10a 的表達(dá)水平顯著上調(diào)，后者能夠靶向 WSSV 病毒基因（vp26、vp28 和 wssv102）的 5'-UTR，上調(diào)這三種病毒基因的表達(dá)水平，從而促進(jìn)病毒相關(guān)蛋白的翻譯和 WSSV 復(fù)制。因此，miR-10a 拮抗劑是潛在的抗 WSSV 感染藥物。

2.2.8 丙型肝炎病毒 miRNA 在丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）感染中發(fā)揮作用。Nieder-R?hrmann 等[50]研究發(fā)現(xiàn)，肝臟特異性 miR-122 能夠靶向丙型肝炎病毒RNA 的 5'-UTR 中的兩個(gè)保守位點(diǎn)（S1 和 S2），從而增強(qiáng) HCV RNA 的翻譯和穩(wěn)定性，促進(jìn)病毒復(fù)制。因此，miR-122 拮抗劑是潛在的抗 HCV 感染藥物。Miravirsen是 Santaris 制藥公司研發(fā)的抗 HCV 的 miR-122 拮抗劑，用于治療丙型肝炎，目前該藥正在進(jìn)行 II 期臨床試驗(yàn)。臨床前試驗(yàn)結(jié)果表明，miravirsen 能夠顯著降低病毒滴度（> 300 倍），并且在停藥后也沒有觀察到病毒滴度反彈的跡象[51]。

綜上所述，miRNA 同樣對(duì)多種核酸類型的病毒都具有顯著的抗病毒活性（表 2）。miRNA 既能抑制病毒復(fù)制，也能促進(jìn)病毒復(fù)制。因此，基于 miRNA 的 RNAi 療法分為兩種：miRNA 模擬物和 miRNA 拮抗劑，前者模擬抗病毒 miRNA 發(fā)揮病毒抑制作用，而后者拮抗促病毒 miRNA 發(fā)揮病毒抑制作用。根據(jù)miRNA 在體內(nèi)病毒感染過程中的作用，研制相應(yīng)的 miRNA 模擬物或拮抗劑，將為抗病毒治療藥物研發(fā)帶來新的希望。

3 siRNA 和 miRNA 藥物的挑戰(zhàn)與策略

3.1 藥物遞送問題

目前，基于 siRNA 和 miRNA 的 RNAi 療法顯現(xiàn)出了潛力巨大的疾病治愈能力。該療法用于抗病毒治療的主要障礙是，如何將藥物精確地遞送到感染部位和炎癥組織而不影響周圍其他組織的正常功能，以及保證藥物到達(dá)靶組織后具有很好的生物利用度。siRNA、miRNA 模擬物和 miRNA 拮抗劑都是寡核苷酸片段，具有相似的物理性質(zhì)，如帶有大量負(fù)電荷，很難直接通過被動(dòng)擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)；具有較大的分子量；穩(wěn)定性差，裸露的 RNA 分子易被血清的核糖核酸酶降解；半壽期短，容易被腎臟清除[52]。這些不利的物理性質(zhì)限制了 RNAi 療法的應(yīng)用，需要不斷發(fā)現(xiàn)合適的策略來解決這些問題。

表 2 miRNA 對(duì)病毒的作用及靶點(diǎn)

化學(xué)修飾可以增強(qiáng) RNA 分子的穩(wěn)定性，常用的化學(xué)修飾方法有核糖 2'-OH 修飾、鎖核酸修飾和硫代硫酸酯骨架修飾等[53-55]。經(jīng)過化學(xué)修飾后，siRNA 和 miRNA 藥物具有更好的穩(wěn)定性和更高的沉默效率，提高了生物利用度。雖然化學(xué)修飾可以增強(qiáng) siRNA 和 miRNA 藥物對(duì)核糖核酸酶的抵抗力，但不能解決這些帶有大量負(fù)電荷的 RNA 分子的跨膜運(yùn)輸問題。因此，研究人員試圖找出合適的載體，促進(jìn) RNAi 藥物的跨膜運(yùn)輸。

脂質(zhì)納米顆粒（lipid nanoparticles，LNPs）是目前臨床批準(zhǔn)的最先進(jìn)的非病毒類載體，具有相容性高、可生物降解和攜帶大量 siRNA 或 miRNA 藥物等優(yōu)點(diǎn)[56]。這些基于可電離脂質(zhì)的 LNPs 最初發(fā)現(xiàn)于肝臟中，目前在 RNAi 療法中前景廣闊。已獲得 FDA 和 EMA 批準(zhǔn)的 patisiran 就是基于 LNPs 的 siRNA 藥物。因此，LNPs 也被認(rèn)為是最重要非病毒類載體之一，各種修飾的 LNPs 為靶向遞送 siRNA 和 miRNA 開辟了新途徑[57]。

N-乙酰半乳糖胺（N-acetylgalactosamine，GalNAc）是去唾液酸糖蛋白受體（asialoglycoprotein receptor，ASGPR）的一種高親和力配體；而 ASGPR 是一種主要表達(dá)在肝細(xì)胞表面的 C 型凝集素，能通過受體介導(dǎo)內(nèi)吞作用。因此，利用 GalNAc 和 ASGPR 特異性結(jié)合可以實(shí)現(xiàn)特異性靶向肝臟給藥[58]。將 siRNA 或miRNA 與 GalNAc 偶聯(lián)，形成共軛三聚體，能將 RNAi 藥物靶向遞送至肝細(xì)胞，從而引起肝細(xì)胞內(nèi)的基因沉默[59]。Alnylam 與諾華公司聯(lián)合開發(fā)的 Inclisiran 是一種靶向前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草溶菌素 9（proprotein convertase subtilisin-kexin type 9，PCSK9）mRNA 的長效 siRNA，通過與 GalNAc 偶聯(lián)，被肝細(xì)胞特異性攝取，從而治療高膽固醇血癥。在臨床試驗(yàn)中，Inclisiran 能有效降低 50% 以上的 LDL-C 水平，一年僅需注射兩次，并且安全性很高[60]。Regulus Treeutics 公司開發(fā)的 RG-101 是 miR-122 拮抗劑-GalNAc 偶聯(lián)物，II 期臨床試驗(yàn)表明，RG-101 能使慢性丙肝患者體內(nèi)的病毒水平顯著下降[61]。GalNAc 共軛技術(shù)代表一類新的發(fā)展中的 RNA 遞送方式，Dicerna 公司開發(fā)出了四聚體 GalNAc 聚合物——GalXC，四聚體 GalXC 與 ASGPR 的親和力更高?；?GalXC，Dicerna 公司已經(jīng)研制了數(shù)種正在臨床試驗(yàn)的藥物和十幾種正在早期研發(fā)的藥物。

Arrowhead 制藥公司開發(fā)的靶向 RNAi 分子（TRIM）平臺(tái)，能夠篩選有效的 siRNA、高親和力的靶向配體和連接子，從而產(chǎn)生特異性的 siRNA 遞送平臺(tái)?；谠撈脚_(tái)，Arrowhead 開發(fā)出了 ARO-ANG3 用于治療高甘油三酯血癥[62]。SlienSeed 研發(fā)了一種可生物降解的微型基質(zhì)——LODER（LOcal Drug EluteR），可以緩慢持久地向局部釋放其所封裝的藥物。siG12D-LODER 是基于 LODER 技術(shù)開發(fā)出的聚合物系統(tǒng)復(fù)合物，通過內(nèi)窺鏡超聲活檢程序放入胰腺腫瘤內(nèi)，克服了 siRNA 遞送障礙。siG12D-LODER 能夠向靶點(diǎn)緩釋靶向 KRAS 的 siRNA，抑制 KRAS mRNA 和蛋白質(zhì)表達(dá)水平，從而有效抑制癌細(xì)胞生長[63]。

3.2 脫靶效應(yīng)和免疫毒性

脫靶效應(yīng)（off-target）是指 siRNA 通過 RNAi 機(jī)制作用于非靶 mRNA，從而導(dǎo)致非靶 mRNA 的基因沉默現(xiàn)象。siRNA 與靶 mRNA 通過完全互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合，具有高度特異性，但是合成的 siRNA 在哺乳動(dòng)物體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生脫靶效應(yīng)。siRNA 能夠產(chǎn)生兩種類型的脫靶效應(yīng)，一類是 siRNA 發(fā)揮 miRNA 功能，通過“種子序列”互補(bǔ)配對(duì)使許多非靶 mRNA 表達(dá)水平降低，此類型脫靶效應(yīng)會(huì)引起細(xì)胞毒性[64]。另一類是 siRNA 正義鏈和反義鏈競爭與 AGO 復(fù)合體結(jié)合形成 RISC，正義鏈結(jié)合形成的RISC 會(huì)引起非靶 mRNA 沉默[65]。化學(xué)修飾能夠降低 siRNA 的脫靶效應(yīng)，2'-脫氧-2'-氟和 2'-甲氧基戊呋喃糖化學(xué)修飾，不僅可以提高 siRNA 穩(wěn)定性，還可以降低脫靶效應(yīng)[66]。另外，siRNA、miRNA 模擬物和 miRNA 拮抗劑進(jìn)入體內(nèi)后，可能會(huì)通過Toll 樣受體信號(hào)通路非特異性激活免疫系統(tǒng)來誘發(fā)免疫反應(yīng)[67-68]?；瘜W(xué)修飾也可以有效消除非特異性免疫反應(yīng)[69]。

3.3 疾病異質(zhì)性

病毒容易發(fā)生突變，所以一種 siRNA 或 miRNA 對(duì)某種 mRNA 的單一靶向，不能夠有效抑制病毒復(fù)制。因此，多種 siRNA 或 miRNA 聯(lián)合靶向病毒的多種 mRNA 能夠形成協(xié)同的沉默效應(yīng)，從而更有效發(fā)揮抗病毒作用[70]。此外，將 siRNA 或 miRNA 藥物與目前 FDA 批準(zhǔn)的抗病毒藥物聯(lián)合使用，可能有利于病毒感染的治療，并可能成為新的抗病毒治療方式。

3.4 長期應(yīng)用安全性

自從 1998 年 RNAi 機(jī)制發(fā)現(xiàn)以來，研究 RNAi 才不過二十二年，因此對(duì) RNAi 療法的研究存在著不足。第一個(gè) RNAi 藥物上市才不到兩年，沒有長期和大量的患者數(shù)據(jù)來證明 RNAi 療法是絕對(duì)安全的，需要進(jìn)一步的研究和觀察[71]。另外，載體的安全性也需要進(jìn)一步研究。使用 LNPs 載體在給藥后會(huì)誘發(fā)炎癥反應(yīng)和免疫細(xì)胞活化[72]。

4 總結(jié)及展望

siRNA 和 miRNA 通過靶向病毒感染過程中的關(guān)鍵基因，調(diào)控各種類型的病毒增殖。因此，基于 siRNA和 miRNA 的抗病毒藥物具有巨大的治療潛力。但目前，基于 siRNA 和 miRNA 的抗病毒藥物僅處于臨床試驗(yàn)階段。要解決的問題是，如何把設(shè)計(jì)好的 siRNA、miRNA 模擬物和 miRNA 拮抗劑安全有效地運(yùn)送到靶組織，不斷發(fā)展的化學(xué)修飾技術(shù)和給藥載體很好地解決了這個(gè)問題，但都存在一定的局限性。未來該技術(shù)發(fā)展的關(guān)鍵是研發(fā)出一種安全、無毒、高效的給藥系統(tǒng)。另外，從飲食中獲取植物 miRNA 的抗病毒途徑不需要額外的化學(xué)修飾和給藥載體，將成為 miRNA 抗病毒藥物研發(fā)的新途徑。

[1] Hamilton AJ, Baulcombe DC. A species of small antisense RNA in posttranscriptional gene silencing in plants. Science, 1999, 286(5441): 950-952.

[2] Elbashir SM, Harborth J, Lendeckel W, et al. Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature, 2001, 411(6836):494-498.

[3] Lee RC, Feinbaum RL, Ambros V. The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14. Cell, 1993, 75(5):843-854.

[4] Pasquinelli AE, Reinhart BJ, Slack F, et al. Conservation of the sequence and temporal expression of let-7 heterochronic regulatory RNA. Nature, 2000, 408(6808):86-89.

[5] Squassina A, Niola P, Lopez JP, et al. MicroRNA expression profiling of lymphoblasts from bipolar disorder patients who died by suicide, pathway analysis and integration with postmortem brain findings. Eur Neuropsychopharmacol, 2020, 34:39-49.

[6] Mens MMJ, Maas SCE, Klap J, et al. Multi-omics analysis reveals microRNAs associated with cardiometabolic traits. Front Genet, 2020, 11:110.

[7] Zhou Y, Geng P, Liu Y, et al. Rotavirus-encoded virus-like small RNA triggers autophagy by targeting IGF1R via the PI3K/Akt/mTOR pathway. Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis, 2018, 1864(1):60-68.

[8] Fujii T, Shimada K, Asano A, et al. MicroRNA-331-3p suppresses cervical cancer cell proliferation and E6/E7 expression by targeting NRP2. Int J Mol Sci, 2016, 17(8):1351.

[9] Kandasamy SK, Zhu L, Fukunaga R. The C-terminal dsRNA-binding domain of drosophila dicer-2 is crucial for efficient and high-fidelity production of siRNA and loading of siRNA to argonaute2. RNA, 2017, 23(7):1139-1153.

[10] Masliah G, Maris C, K?nig SL, et al. Structural basis of siRNA recognition by TRBP double-stranded RNA binding domains. EMBO J, 2018, 37(6):e97089.

[11] Liu J, Carmell MA, Rivas FV, et al. Argonaute2 is the catalytic engine of mammalian RNAi. Science, 2004, 305(5689):1437-1441.

[12] Lee Y, Kim M, Han J, et al. MicroRNA genes are transcribed by RNA polymerase II. EMBO J, 2004, 23(20):4051-4060.

[13] Nguyen TA, Jo MH, Choi YG, et al. Functional anatomy of the human microprocessor. Cell, 2015, 161(6):1374-1387.

[14] Yi R, Qin Y, Macara IG, et al. Exportin-5 mediates the nuclear export of pre-microRNAs and short hairpin RNAs. Genes Dev, 2003, 17(24):3011-3016.

[15] Ketting RF, Fischer SE, Bernstein E, et al. Dicer functions in RNA interference and in synthesis of small RNA involved in developmental timing in C. elegans. Genes Dev, 2001, 15(20):2654-2659.

[16] Diederichs S, Haber DA. Dual role for argonautes in MicroRNA processing and posttranscriptional regulation of microRNA expression. Cell, 2007, 131(6):1097-1108.

[17] Meerson A. Leptin-responsive miR-4443 is a small regulatory RNA independent of the canonic microRNA biogenesis pathway. Biomolecules, 2020, 10(2):293.

[18] Kretov DA, Walawalkar IA, Mora-Martin A, et al. Ago2-dependent processing allows miR-451 to evade the global microRNA turnover elicited during erythropoiesis. Mol Cell, 2020, 78(2):317-328, e6.

[19] Graham SV. The human papillomavirus replication cycle, and its links to cancer progression: a comprehensive review. Clin Sci (Lond), 2017, 131(17):2201-2221.

[20] Taghizadeh E, Jahangiri S, Rostami D, et al. Roles of E6 and E7 human papillomavirus proteins in molecular pathogenesis of cervical cancer. Curr Protein Pept Sci, 2019, 20(9):926-934.

[21] Xu C, Liu W, Hu Y, et al. Bioinspired tumor-homing nanoplatform for co-delivery of paclitaxel and siRNA-E7 to HPV-related cervical malignancies for synergistic therapy. Theranostics, 2020, 10(7):3325- 3339.

[22] Nishida H, Matsumoto Y, Kawana K, et al. Systemic delivery of siRNA by actively targeted polyion complex micelles for silencing the E6 and E7 human papillomavirus oncogenes. J Control Release, 2016, 213:29-37.

[23] Kobayashi T, Chappell JD, Danthi P, et al. Gene-specific inhibition of reovirus replication by RNA interference. J Virol, 2006, 80(18):9053- 9063.

[24] Li J, Andika IB, Shen J, et al. Characterization of rice black-streaked dwarf virus- and rice stripe virus-derived siRNAs in singly and doubly infected insect vector Laodelphax striatellus. PLoS One, 2013, 8(6):e66007.

[25] Wu CJ, Huang HW, Liu CY, et al. Inhibition of SARS-CoV replication by siRNA. Antiviral Res, 2005, 65(1):45-48.

[26] Shi Y, Yang DH, Xiong J, et al. Inhibition of genes expression of SARS coronavirus by synthetic small interfering RNAs. Cell Research, 2005, 15(3):193-200.

[27] Tang Q, Li B, Woodle M, et al. Application of siRNA against SARS in the rhesus macaque model. Methods Mol Biol, 2008, 442:139-158.

[28] Grosfeld H, Hill MG, Collins PL. RNA replication by respiratory syncytial virus (RSV) is directed by the N, P, and L proteins; transcription also occurs under these conditions but requires RSV superinfection for efficient synthesis of full-length mRNA. J Virol, 1995, 69(9):5677-5686.

[29] Alvarez R, Elbashir S, Borland T, et al. RNA interference-mediated silencing of the respiratory syncytial virus nucleocapsid defines a potent antiviral strategy. Antimicrob Agents Chemother, 2009, 53(9):3952-3962.

[30] Rahimi P, Aghasadeghi MR, Arefian E, et al. Molecular approach for HIV-1 replication inhibition: assessment of different siRNAs targeting tat and Nef genes to effectively suppress their expression. Clin Lab, 2019, 65(8).

[31] Zhou J, Lazar D, Li H, et al. Receptor-targeted aptamer-siRNA conjugate-directed transcriptional regulation of HIV-1. Theranostics, 2018, 8(6):1575-1590.

[32] Wu S, Chen H. Anti-condyloma acuminata mechanism of microRNAs-375 modulates HPV in cervical cancer cells via the UBE3A and IGF-1R pathway. Oncol Lett, 2018, 16(3):3241-3247.

[33] Gao Y, Yang M, Wei L, et al. miR-34a-5p inhibits cell proliferation, migration and invasion through targeting JAG1/Notch1 pathway in HPV-infected human epidermal keratinocytes. Pathol Oncol Res, 2020, 26(3):1851-1859.

[34] Zamani S, Sohrabi A, Hosseini SM, et al. Deregulation of miR-21 and miR-29a in cervical cancer related to HPV infection. Microrna, 2019, 8(2):110-115.

[35] Mukhopadhyay U, Chanda S, Patra U, et al. Synchronized orchestration of miR-99b and let-7g positively regulates rotavirus infection by modulating autophagy. Sci Rep, 2019, 9(1):1318.

[36] Chanda S, Nandi S, Chawla-Sarkar M. Rotavirus-induced miR-142-5p elicits proviral milieu by targeting non-canonical transforming growth factor beta signalling and apoptosis in cells. Cell Microbiol, 2016, 18(5):733-747.

[37] Tian Z, Zhang J, He H, et al. miR-525-3p mediates antiviral defense to rotavirus infection by targeting nonstructural protein 1. Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis, 2017, 1863(12):3212-3225.

[38] Wen W, He Z, Jing Q, et al. Cellular microRNA-miR-548g-3p modulates the replication of dengue virus. J Infect, 2015, 70(6):631- 640.

[39] Castrillón-Betancur JC, Urcuqui-Inchima S. Overexpression of miR-484 and miR-744 in vero cells alters Dengue virus replication. Mem Inst Oswaldo Cruz, 2017, 112(4):281-291.

[40] Escalera-Cueto M, Medina-Martínez I, del Angel RM, et al. Let-7c overexpression inhibits dengue virus replication in human hepatoma Huh-7 cells. Virus Res, 2015, 196:105-112.

[41] Zhu X, He Z, Hu Y, et al. MicroRNA-30e* suppresses dengue virus replication by promoting NF-kappaB-dependent IFN production. PLoS Negl Trop Dis, 2014, 8(8):e3088.

[42] Song L, Liu H, Gao S, et al. Cellular microRNAs inhibit replication of the H1N1 influenza A virus in infected cells. J Virol, 2010, 84(17): 8849-8860.

[43] Zhang S, Li J, Li J, et al. Up-regulation of microRNA-203 in influenza A virus infection inhibits viral replication by targeting DR1. Sci Rep, 2018, 8(1):6797.

[44] Cui H, Zhang C, Zhao Z, et al. Identification of cellular microRNA miR-188-3p with broad-spectrum anti-influenza A virus activity. Virol J, 2020, 17(1):12.

[45] Zhou Z, Li X, Liu J, et al. Honeysuckle-encoded atypical microRNA2911 directly targets influenza A viruses. Cell Res, 2015, 25(1):39-49.

[46] Bochnakian A, Zhen A, Zisoulis DG, et al. Interferon-inducible microRNA miR-128 modulates HIV-1 replication by targeting TNPO3 mRNA. J Virol, 2019, 93(20):e00364-19.

[47] Ortega PAS, Saulle I, Mercurio V, et al. Interleukin 21 (IL-21)/ microRNA-29 (miR-29) axis is associated with natural resistance to HIV-1 infection. AIDS, 2018, 32(17):2453-2461.

[48] Hooykaas MJG, van Gent M, Soppe JA, et al. EBV microRNA BART16 duppresses type I IFN signaling. J Immunol, 2017, 198(10): 4062-4073.

[49] Huang JY, Kang ST, Chen IT, et al. Shrimp mir-10a is co-opted by white spot syndrome virus to increase viral gene expression and viral replication. Front Immunol, 2017, 8:1084.

[50] Nieder-R?hrmann A, Dünnes N, Gerresheim GK, et al. Cooperative enhancement of translation by two adjacent microRNA-122/ Argonaute 2 complexes binding to the 5'untranslated region of hepatitis C virus RNA. J Gen Virol, 2017, 98(2):212-224.

[51] Ottosen S, Parsley TB, Yang L, et al. In vitro antiviral activity and preclinical and clinical resistance profile of miravirsen, a novel anti-hepatitis C virus therapeutic targeting the human factor miR-122. Antimicrob Agents Chemother, 2015, 59(1):599-608.

[52] Kim YK. RNA therapy: current status and future potential. Chonnam Med J, 2020, 56(2):87-93.

[53] Song X, Wang X, Ma L, et al. Site-specific modification using the 2'-methoxyethyl group improves the specificity and activity of siRNAs. Mol Ther Nucleic Acids, 2017, 9:242-250.

[54] Nedaeinia R, Sharifi M, Avan A, et al. Locked nucleic acid anti-miR-21 inhibits cell growth and invasive behaviors of a colorectal adenocarcinoma cell line: LNA-anti-miR as a novel approach. Cancer Gene Ther, 2016, 23(8):246-253.

[55] Mailk S, Bahal R. Investigation of PLGA nanoparticles in conjunction with nuclear localization sequence for enhanced delivery of antimiR phosphorothioates in cancer cells in vitro. J Nanobiotechnology, 2019, 17(1):57.

[56] Ramishetti S, Hazan-Halevy I, Palakuri R, et al. A combinatorial library of lipid nanoparticles for RNA delivery to leukocytes. Adv Mater, 2020, 32(12):e1906128.

[57] Sato Y, Hashiba K, Sasaki K, et al. Understanding structure-activity relationships of pH-sensitive cationic lipids facilitates the rational identification of promising lipid nanoparticles for delivering siRNAs in vivo. J Control Release, 2019, 295:140-152.

[58] Monestier M, Charbonnier P, Gateau C, et al. ASGPR-mediated uptake of multivalent glycoconjugates for drug delivery in hepatocytes. Chembiochem, 2016, 17(7):590-594.

[59] Willoughby JLS, Chan A, Sehgal A, et al. Evaluation of GalNAc-siRNA conjugate activity in pre-clinical animal models with reduced asialoglycoprotein receptor expression. Mol Ther, 2018, 26(1):105-114.

[60] Fitzgerald K, White S, Borodovsky A, et al. A highly durable RNAi therapeutic inhibitor of PCSK9. N Engl J Med, 2017, 376(1):41-51.

[61] Deng Y, Campbell F, Han F, et al. Randomized clinical trials towards a single-visit cure for chronic hepatitis C: Oral GSK2878175 and Injectable RG-101 in chronic hepatitis C patients and long-acting injectable GSK2878175 in healthy participants. J Viral Hepat, 2020, 27(7):699-708.

[62] Nurmohamed NS, Dallinga-Thie GM, Stroes ESG. Targeting apoC-III and ANGPTL3 in the treatment of hypertriglyceridemia. Expert Rev Cardiovasc Ther, 2020, 18(6):355-361.

[63] Zorde Khvalevsky E, Gabai R, Rachmut IH, et al. Mutant KRAS is a druggable target for pancreatic cancer. Proc Natl Acad Sci U S A, 2013, 110(51):20723-20728.

[64] Di Rocco G, Verdina A, Gatti V, et al. Apoptosis induced by a HIPK2 full-length-specific siRNA is due to off-target effects rather than prevalence of HIPK2-Δe8 isoform. Oncotarget, 2016, 7(2):1675-1686.

[65] Varley AJ, Hammill ML, Salim L, et al. Effects of chemical modifications on siRNA strand selection in mammalian cells. Nucleic Acid Ther, 2020, 30(4):229-236.

[66] Kumar P, Degaonkar R, Guenther DC, et al. Chimeric siRNAs with chemically modified pentofuranose and hexopyranose nucleotides:altritol-nucleotide (ANA) containing GalNAc-siRNA conjugates: in vitro and in vivo RNAi activity and resistance to 5'-exonuclease. Nucleic Acids Res, 2020, 48(8):4028-4040.

[67] Pirher N, Pohar J, Man?ek-Keber M, et al. Activation of cell membrane-localized toll-like receptor 3 by siRNA. Immunol Lett, 2017, 189:55-63.

[68] Feng Y, Zou L, Yan D, et al. Extracellular microRNAs induce potent innate immune responses via TLR7/MyD88-dependent mechanisms.J Immunol, 2017, 199(6):2106-2117.

[69] Valenzuela RA, Suter SR, Ball-Jones AA, et al. Base modification strategies to modulate immune stimulation by an siRNA. Chembiochem, 2015, 16(2):262-267.

[70] Brodskaia AV, Timin AS, Gorshkov AN, et al. Inhibition of influenza A virus by mixed siRNAs, targeting the PA, NP, and NS genes, delivered by hybrid microcarriers. Antiviral Res, 2018, 158:147-160.

[71] Adams D, Gonzalez-Duarte A, O'Riordan WD, et al. Patisiran, an RNAi therapeutic, for hereditary transthyretin amyloidosis. N Engl J Med, 2018, 379(1):11-21.

[72] Kubota K, Onishi K, Sawaki K, et al. Effect of the nanoformulation of siRNA-lipid assemblies on their cellular uptake and immune stimulation. Int J Nanomedicine, 2017, 12:5121-5133.

王樹松，Email：wshsong@sina.com；孫紹光，Email：sunshaoguang00@163.com

2020-07-20

10.3969/j.issn.1673-713X.2021.01.009