DPPH、ABTS和FRAP微量法測(cè)定山奈酚的抗氧化能力*

王 榮，羅 倩，馮 怡

(西安醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，陜西 西安 710021)

山奈酚是一類從蔬菜水果及中藥材中提取得到的黃酮醇類物質(zhì)，其具有抗氧化、抗癌、防治糖尿病、保護(hù)損傷細(xì)胞等多種功能[1]。研究顯示，山奈酚具有較強(qiáng)的抗氧化活性，可作為抗氧化劑添加在藥物中。已有文獻(xiàn)報(bào)道山奈酚能夠通過清除活性氧、保護(hù)抗氧化酶的活性抑制活性氧誘發(fā)人紅細(xì)胞的溶血[2]。但目前未有實(shí)驗(yàn)評(píng)估山奈酚對(duì)自由基的清除活性及其總抗氧化能力。

目前對(duì)抗氧化物質(zhì)的體外活性評(píng)價(jià)方法主要有自由基(DPPH自由基、ABTS自由基、超氧陰離子自由基、羥基自由基等)清除實(shí)驗(yàn)，脂質(zhì)過氧化抑制實(shí)驗(yàn)和總抗氧化能力的測(cè)定等評(píng)價(jià)方法。本實(shí)驗(yàn)基于酶標(biāo)儀-微孔板，建立微量DPPH自由基清除、ABTS自由基清除和總抗氧化能力測(cè)定法，從以上三個(gè)方面驗(yàn)證山奈酚的體外抗氧化作用，為其作用抗氧化劑的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材 料

1.1 藥品與試劑

山奈酚標(biāo)準(zhǔn)品(含量95.5%，批號(hào)110861-201611)，中國(guó)食品藥品檢定研究院；抗壞血酸(Vc)(純度99%)，北京索萊寶科技有限公司；DPPH(1,1-二苯基-2-苦肼基自由基)(純度97%)，上海思域化工科技有限公司；ABTS([2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽])(純度98%)，薩恩化學(xué)技術(shù)有限公司；總抗氧化能力(T-AOC)測(cè)試盒，南京建成生物工程研究所；無水乙醇，天津市河?xùn)|區(qū)紅巖試劑廠。

1.2 儀 器

全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀，美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；分析天平，奧豪斯儀器有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 DPPH·清除能力的測(cè)定

2.1.1 DPPH·標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

避光稱取DPPH粉末82 mg，無水乙醇定容于50 mL量瓶中，得1.64 mg/mL的DPPH母液。以無水乙醇為溶劑將上述母液稀釋至0.0615、0.05125、0.041、0.03075、0.0205 mg/mL。517 nm處測(cè)定其吸光度，以濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，繪制DPPH標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果DPPH溶液在0.0205～0.0615 mg/mL范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系，其回歸方程為y=11.4156x+0.1717，相關(guān)系數(shù)R2=0.9945。

2.1.2 山奈酚對(duì)DPPH·清除能力

稱取適量山奈酚，加入無水乙醇配制成濃度為160 μmol/L的溶液，后用無水乙醇稀釋成濃度梯度為160、80、40、20、10、5、2.5 μmol/L的溶液。精密吸取梯度樣品溶液100 μL和0.1 mmol/L的DPPH溶液100 μL為實(shí)驗(yàn)組，對(duì)照組用100 μL無水乙醇代替DPPH溶液，以加入100 μL DPPH溶液和100 μL無水乙醇為標(biāo)準(zhǔn)組，避光反應(yīng)30 min，之后用酶標(biāo)儀在517 nm下測(cè)定吸光度。以Vc為對(duì)照。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。由式(1)計(jì)算清除率，計(jì)算IC50值:

DPPH清除率=[1-(A實(shí)驗(yàn)組-A對(duì)照組)/A標(biāo)準(zhǔn)組]×100%

(1)

Vc和山奈酚對(duì)DPPH自由基的清除率與濃度呈正相關(guān)。IC50的數(shù)值可衡量被測(cè)抗氧化劑的半抑制濃度。IC50值越小，表明抗氧化活性越強(qiáng)。山奈酚的濃度為20 μmol/L時(shí)，清除率達(dá)47.86%，濃度為80 μmol/L時(shí)，清除率則高達(dá)88.83%，其IC50為16.17 μmol/L。Vc的清除能力較強(qiáng)，在濃度約為56 μmol/L時(shí)清除率就可達(dá)93.63%，Vc的IC50為9.57 μmol/L。顯示山奈酚對(duì)DPPH自由基有一定的清除能力。

2.2 ABTS·清除能力的測(cè)定

避光稱取ABTS自由基粉末30 mg，加超純水8 mL溶解，得7.0 mmol/L的ABTS水溶液。秤取10 mg K2S2O8加15 mL超純水溶解，將以上二種溶液按體積比1：1等量混合，制備ABTS·+母液，置于4 ℃冰箱保存10～12 h，備用。使用時(shí)，用無水乙醇稀釋至吸光度在0.7±0.02 Abs范圍內(nèi)即可。配制30 μmol/L山奈酚溶液，無水乙醇稀釋成濃度梯度分別為30、15、7.5、3.75、1.875、0.9375 μmol/L的溶液。精密吸取梯度樣品溶液100 μL和ABTS水溶液100 μL為實(shí)驗(yàn)組，對(duì)照組用100 μL無水乙醇代替ABTS水溶液，以加入100 μL ABTS水溶液和100 μL無水乙醇為標(biāo)準(zhǔn)組，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。避光反應(yīng)30 min，之后用酶標(biāo)儀在734 nm下測(cè)定吸光度。以Vc為對(duì)照。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。由式(2)計(jì)算清除率，計(jì)算IC50值。

ABTS清除率=1-[(A實(shí)驗(yàn)組-A對(duì)照組)/A標(biāo)準(zhǔn)組]×100%

(2)

ABTS在氧化劑過硫酸鉀作用下被氧化成綠色的陽離子自由基ABTS·+，在抗氧化劑存在時(shí)，ABTS·+的產(chǎn)生會(huì)被抑制，從而使反應(yīng)體系顏色變淺，在734 nm處所測(cè)吸光度值變小，通過測(cè)定吸光度值的變化即可判斷樣品抗氧化能力的大小。Vc與山奈酚對(duì)ABTS自由基清除率與濃度均呈正相關(guān)，當(dāng)濃度為15 μmol/L時(shí)，清除率可達(dá)54.25%，濃度為30 μmol/L時(shí)，清除率可高達(dá)90.12%，山奈酚的IC50為6.97 μmol/L。而Vc的濃度約為56 μmol/L時(shí)，清除率為99.84%，Vc的IC50為6.78 μmol/L，山奈酚對(duì)ABTS自由基具有較好的清除能力。

2.3 總抗氧化能力(FRAP法)的測(cè)定

2.3.1 FeSO4-7H2O標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱取27.8 mg FeSO4-7H2O標(biāo)準(zhǔn)品，超純水溶解定容至1 mL，得濃度為100 mmol/L的母液，以水為溶劑將上述母液稀釋至0.15、0.3、0.6、0.9、1.2、1.5 mmol/L。593 nm處測(cè)吸光度，以吸光度值為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品濃度為縱坐標(biāo)制成FeSO4-7H2O標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，F(xiàn)eSO4-7H2O溶液在0.15～1.5 mmol/L范圍內(nèi)，其濃度與吸光度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，其方程為y=3.5563x+0.1898，其相關(guān)系數(shù)R2=0.991。

2.3.2 山奈酚的總抗氧化能力

避光稱取山奈酚標(biāo)準(zhǔn)品適量，配制濃度為5 mmol/L的山奈酚乙醇溶液，后用無水乙醇稀釋成濃度梯度分別為500、250、125、62.5、31.25、15.625 μmol/L的溶液。測(cè)定以上樣品的吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求得與標(biāo)準(zhǔn)品相同吸光度值下的樣品濃度。山奈酚的總抗氧化能力用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)FeSO4溶液的濃度來表示。

表1顯示了不同濃度的山奈酚的總抗氧化能力。結(jié)果表明隨山奈酚溶液濃度增大其總抗氧化能力增大。當(dāng)山奈酚濃度在15.625～62.5 μmol/L時(shí)，其總抗氧化能力差異較小。當(dāng)山奈酚濃度在125～500 μmol/L時(shí)，其總抗氧化能力顯著提高。

表1 山奈酚的總抗氧化能力

3 結(jié) 論

本研究分別建立了微量化DPPH自由基清除能力測(cè)定法、ABTS自由基清除能力測(cè)定法和鐵離子還原/抗氧化力測(cè)定法(FRAP)評(píng)價(jià)山奈酚的體外抗氧化活性[3]。該方法建立在酶標(biāo)儀和微孔板基礎(chǔ)之上，微孔板的使用可大幅降低試劑的消耗，酶標(biāo)儀可在短時(shí)間內(nèi)快速同時(shí)測(cè)定樣本，顯著縮短了實(shí)驗(yàn)周期[4-6]，該方法具有微量化、快速、準(zhǔn)確性好等特點(diǎn)。

DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)自由基是一種以氮為中心的穩(wěn)定有機(jī)自由基，它的穩(wěn)定性來源于三個(gè)苯環(huán)的空間障礙和共振穩(wěn)定作用，使夾在中間的氮原子上未成對(duì)電子不能發(fā)揮其應(yīng)有的電子成對(duì)效應(yīng)。其乙醇溶液顯紫色，在517 nm處有最大吸收峰，當(dāng)有抗氧化劑存在時(shí)，孤電子被配對(duì)，DPPH自由基溶液的顏色變淺，吸光度值變小，根據(jù)吸光度的變化可測(cè)得抗氧化劑的清除能力[7]。ABTS[2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽]自由基在適當(dāng)?shù)难趸瘎?過硫酸鉀、重鉻酸鉀等)作用下氧化成綠色的自由基陽離子ABTS·+，當(dāng)有抗氧化物質(zhì)存在時(shí)，ABTS·+的產(chǎn)生會(huì)被抑制，使反應(yīng)體系褪色，吸光度值變小，在734 nm處測(cè)定吸光度即可計(jì)算出藥物的清除能力[8]?？偪寡趸芰Φ臏y(cè)定，利用“FRAP”法，在酸性條件下，抗氧化劑與Fe3+-TPTZ反應(yīng)，使其還原成藍(lán)色的Fe2+-TPTZ，在593 nm處測(cè)定吸光度，可以計(jì)算出抗氧化物質(zhì)的總抗氧化能力[5,9]。以上評(píng)價(jià)方法均選用VC進(jìn)行對(duì)照，從而來評(píng)價(jià)山奈酚抗氧化活性的強(qiáng)弱。本研究結(jié)果顯示，山奈酚

對(duì)DPPH自由基和ABTS自由基具有良好的清除作用，其IC50分別為16.17 和6.97 μmol/L，山奈酚對(duì)DPPH自由基的清除作用弱于陽性藥VC(P<0.05)，但其對(duì)ABTS自由基的清除作用與VC相當(dāng)(P>0.05)；500 μmol/L山奈酚的總抗氧化能力為1.04 mmol/L。以上表明山奈酚具有一定的體外抗氧化能力。