青枯雷爾氏菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)hrcN基因的功能分析

周大祥，龍泉洲，殷幼平，熊 書

（1.重慶大學生命科學學院/重慶市基因功能與調(diào)控重點實驗室，重慶 400300；2.重慶三峽學院生物與食品工程學院，萬州404120；3.重慶三峽醫(yī)藥高等?？茖W?；A(chǔ)醫(yī)學部，萬州 404120）

青枯雷爾氏菌Ralstonia solanacearum是一種廣泛分布的土傳病原細菌，能夠侵染50多個科，200多種植物，在全球范圍內(nèi)能夠?qū)е轮卮蟮慕?jīng)濟損失[1]。由該菌引起的青枯病最早于1864年在煙草中報道，它的起源和早期傳播仍未確定。青枯雷爾氏菌能夠在潮濕的土壤或水體中存活數(shù)年[2]，當遭遇易感宿主，青枯雷爾氏菌就會進入植物根部，在根部皮層定殖，然后入侵木質(zhì)部導管，最終通過導管系統(tǒng)迅速擴展到植物地上部，在宿主體內(nèi)大量增殖引起導管堵塞與功能紊亂，出現(xiàn)萎焉癥狀。

hrcN基因作為植物病原菌T3SS結(jié)構(gòu)基因之一，表達產(chǎn)物為ATP酶（ATPase），通過催化ATP的水解為效應蛋白的分泌提供能量。HrcN蛋白利用水解ATP產(chǎn)生的能量重塑多種蛋白底物，因此在膜融合、蛋白質(zhì)修飾和降解等許多生理活動中發(fā)揮重要的作用[3]。Pozidis等[4]研究發(fā)現(xiàn)Pseudomonas syringas的HrcN是一種定位于外周膜上的ATP酶，能催化蛋白質(zhì)易位。與其他T3SS相關(guān)的ATP酶一樣，HrcN與F0/F1-ATPase亞基同源，包含介導ATP結(jié)合和水解的Walker框[5]。由于T3SS分子伴侶不能被分泌或轉(zhuǎn)運，必須在效應蛋白分泌前從分子伴侶-效應蛋白復合體中釋放出來，這種作用是由T3SS相關(guān)的ATP酶（InvC和HrcN）以ATP依賴的方式進行的。這些ATP酶也作為T3SS效應蛋白的去折疊酶發(fā)揮作用，使效應蛋白保持未折疊或部分未折疊的構(gòu)象[6]。最近Gan等[7]研究發(fā)現(xiàn)T3SS效應蛋白的分泌和轉(zhuǎn)位依賴于分子伴侶HpaB的C端區(qū)域，其C-端區(qū)域的缺失極大的減少了從HpaB與T3SS效應蛋白復合物中釋放出游離效應蛋白的數(shù)量，其中，HrcN以ATP依賴的方式催化該反應。蛋白互作研究顯示，HrcN與T3SS底物特異性開關(guān)蛋白HpaC以及分子伴侶HpaB相互作用，促進多種效應蛋白的分泌[8]。研究還發(fā)現(xiàn)HrcN可與HrcU和HrcV內(nèi)膜蛋白互作[9]。

前期在擴增出青枯雷爾氏菌hrcN基因序列基礎(chǔ)上，比對發(fā)現(xiàn)青枯雷爾氏菌hrcN基因與假單胞菌Pseudomonas syringas1448A、黃單胞菌Xanthomonas campestrisPXO99A和細菌性果斑病菌Acidovorax citrulliAac5相似性較高，其中與細菌性果斑病菌相似性最高。本研究以番茄青枯雷爾氏菌T3SS基因hrcN為研究對象，利用融合PCR技術(shù)和電轉(zhuǎn)化獲得青枯雷爾氏菌CBM613菌株的hrcN基因突變株和回補菌株，通過測定致病力、生長曲線、運動性檢測和生物被膜形成能力等表型研究基因功能。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試菌株與質(zhì)粒：野生型番茄青枯雷爾氏菌CBM613菌株由西南大學植物保護學院饋贈，為強致病力菌株；TOP10化學感受態(tài)細胞購自美國Thermo公司；pMD19-T載體購自日本TAKARA公司；pJQ200SK、pCVD442和pRK415質(zhì)粒載體本實驗室保存。

供試植物：番茄為感病品種中蔬5號，28 ℃～30 ℃光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)，光周期16L﹕8D，相對濕度90%，種苗培養(yǎng)至5～6片葉時備用。

試劑及儀器：NA（Nutrient Agar）培養(yǎng)基（牛肉浸膏3 g，酵母浸膏1 g，蛋白胨5 g，葡萄糖10 g，瓊脂20 g，蒸餾水加至1000 mL，pH為6.8～7.0）、NB（Nutrient Broth）培養(yǎng)基（NA培養(yǎng)基不加瓊脂）、LB（Lysogeny Broth）培養(yǎng)基（蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化鈉10 g，加入雙蒸水定容到1000 mL，pH為7.0）、TSB（Tryptic Soy Broth）培養(yǎng)基（胰蛋白胨15 g，大豆蛋白胨5 g，氯化鈉5 g，瓊脂20 g，加入雙蒸水定容到1000 mL，pH為7.2）、Boucher基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基（KH2PO413.6 g，(NH4)2SO42 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.5 mg，L-谷氨酸2.9 g，加入雙蒸水定容到1000 mL，用KOH調(diào)節(jié)pH至7.0）、半固體SMM（Supplemental minimal medium）培養(yǎng)基（葡萄糖0.1 g，蛋白胨0.1 g，EDTA-2Na 38 mg，瓊脂3.5 g，磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）10 mL，加入雙蒸水定容到1000 mL）、CPG（Casamino acids Peptone Glucose）培養(yǎng)基（酵母粉1 g，葡萄糖10 g，牛肉膏3 g，蛋白胨5 g，加入雙蒸水定容到1000 mL，pH為7.0）；細菌基因組DNA提取試劑盒、細菌質(zhì)粒提取試劑盒購自德國QIAGEN公司；PrimeSTAR Max Premix (2×)購自日本TAKARA公司；TaqDNA polymerase、T4 DNA ligase、SmaI、XbaI、EcoR I和10×Tango buffer購自立陶宛MBI公司；DMSO購自德國Biofroxx公司；其他試劑皆為國產(chǎn)分析純。5910R高速冷凍離心機，德國eppendorf公司；C1000 PCR儀、核酸電泳儀、Versadoc 1000凝膠成像系統(tǒng)、MicroPulser電穿孔轉(zhuǎn)化儀，美國BIO-RAD公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 突變株及回補菌株的獲得 參考青枯雷爾氏菌GMI1000hrcN基因設計引物hrcN-F（5′-GGCTGAT ATCGGATCCATGACCCATCTCGCGCTG-3′）和hrcN-R（5′-GGTGGTGGTGCTCGATCATGCCAGTGCG ATCTCGTC-3′）。提取CBM613菌株DNA，PCR擴增。將回收的DNA片段連接到T載體，轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌，挑取PCR驗證過的陽性克隆菌株測序。利用Krogh等[10]的方法預測分子量、PI、跨膜區(qū)域和親水性；利用深度神經(jīng)網(wǎng)絡SignalP 5.0[11]預測信號肽；利用https://www.genome.jp/tools-bin/clustalw在線比對hrcN的基因和蛋白質(zhì)序列； Motif預測蛋白功能采用Nicolas等[12]的方法；利用http://www.csbio.sjtu.edu.cn/cgi-bin/GnegmPLoc.cgi 在線預測蛋白亞細胞定位。

根據(jù)hrcN基因及上下游序列、慶大霉素（Gm）抗性基因序列設計引物（表1），首先擴增出hrcN基因上、下游同源重組臂序列，從pJQ200SK質(zhì)粒上擴增Gm抗性基因編碼序列；然后利用融合PCR技術(shù)構(gòu)建打靶序列片段（hrcN基因上游-Gm-hrcN基因下游），經(jīng)SmaI酶切完成打靶載體pCVD442-ΔhrcN::Gm的構(gòu)建；最后通過同源重組和電轉(zhuǎn)化大腸桿菌，與受菌體（CBM613菌株）結(jié)合，在含Gm的NB培養(yǎng)基上篩選突變株，并用表1中的鑒定引物鑒定突變株。

表1 hrcN基因敲除所需引物Table 1 Primers used in hrcN gene knockout

通過hrcN-1F/hrcN-1R擴增出hrcN片段，經(jīng)XbaI/EcoR I酶切后克隆入pRK415質(zhì)粒對應的酶切位點，經(jīng)連接和轉(zhuǎn)化TOP10化學感受態(tài)細胞后，鋪四環(huán)素（Tc）平板篩選陽性克隆，完成pRK415-hrcN基因回補質(zhì)粒構(gòu)建。回補質(zhì)粒pRK415-hrcN電轉(zhuǎn)化大腸桿菌，與受體菌（CBM613/ΔhrcN）結(jié)合，在含Tc的TSB培養(yǎng)基上篩選回補菌株，用pRK415-F/pRK415-R引物進行PCR鑒定回補菌株。

1.2.2 表型測定 番茄感病品種為中蔬5號，按照He等[13]根部接種法接種菌株CBM613、CBM613/ΔhrcN突變株和CBM613/ΔhrcN-p-hrcN回補菌株各接種15株，3次重復。按照Meng等[14]的方法計算青枯病的病情指數(shù)；分別挑取3種菌株于NB培養(yǎng)基中，28 ℃、220 r/min搖床培養(yǎng)獲得菌懸液，10000 r/min離心5 min收集菌體。按照Kanda等[15]方法測定600 nm的吸光度值，計算生長曲線；取濃度為3×108CFU/mL的野生型菌株、突變株和回補菌株菌液各5 μL，3種菌株的泳動性檢測按照Kelman等[16]方法測量菌落直徑。3種菌株的生物被膜的測定參考Meng等[17]的方法測定490 nm的吸光度值。

2 結(jié)果與分析

2.1 hrcN基因的擴增結(jié)果

PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠進行電泳，圖1結(jié)果顯示，條帶清晰而且特異，大小1300 bp左右。將該條帶回收，然后連接到T載體并且轉(zhuǎn)化大腸桿菌，得到的陽性克隆進行菌落PCR鑒定并測序，測序發(fā)現(xiàn)基因長度為1320 bp，共編碼439個氨基酸，結(jié)果表明已擴增出番茄青枯雷爾氏菌CBM613的hrcN基因，DNA序列已提交到GenBank（Gene ID：No.42594317）。預測HrcN蛋白分子量為47.54 kD，PI為4.97，無信號肽（預測有信號肽概率為1.734%），無跨膜區(qū)域，整體呈弱親水性（圖2）。Motif預測結(jié)果顯示該蛋白為ATP酶，蛋白亞細胞定位預測其定位于細胞內(nèi)膜和細胞質(zhì)。

圖1 菌株CBM613 hrcN基因的擴增Fig. 1 PCR amplification production of strain CBM613 hrcN gene

圖2 菌株CBM613 HrcN蛋白親水性預測Fig. 2 Hydrophilicity prediction of HrcN in strain CBM613

通過與菌株GMI1000的hrcN基因序列進行在線比對發(fā)現(xiàn)，該基因一致性為99.6%，在青枯雷爾氏菌中非常保守。青枯雷爾氏菌與參比菌株GMI1000hrcN基因相比共有5個SNP位點，具體突變信息為 216：A-G GTA-GTG val；609：T-C CGT-CGC arg；879：T-C CGT-CGC arg；907：G-A GCC-ACC ala-thr；999：T-C GGT-GGC gly。只有907位氨基酸發(fā)生改變（由GMI1000的丙氨酸突變?yōu)樘K氨酸），其他5個SNP都是無意突變。

2.2 hrcN基因打靶序列片段的構(gòu)建

突變體篩選的抗性基因采用Gm抗性基因（長度832 bp），hrcN基因上游同源重組臂和下游同源重組臂長度分別為799和742 bp，利用融合PCR技術(shù)構(gòu)建打靶序列片段（上游同源重組臂-Gm抗性基因編碼序列-下游同源重組臂），長度為2373 bp。圖3電泳圖顯示，泳道1中有4條帶，其中最亮的條帶為打靶序列片段，電泳結(jié)果表明成功構(gòu)建了打靶序列片段。

圖3 hrcN基因打靶序列片段的構(gòu)建Fig. 3 Construction of targeting sequence of hrcN gene

2.3 hrcN基因突變株的構(gòu)建

將供菌體和受菌體（CBM613菌株）混合結(jié)合后，抗性平板上培養(yǎng)單克隆，隨機挑選 10個單克隆，用hrcN基因內(nèi)部引物進行PCR鑒定。如發(fā)生二次重組，則這對引物無擴增產(chǎn)物，否則有227 bp的特異性擴增條帶。圖4結(jié)果顯示：第1～6號克隆為陰性擴增，表明hrcN基因可能已被敲除；7～10號克隆有227 bp的特異性條帶，說明沒有發(fā)生二次重組，hrcN基因未能成功敲除。

圖4 菌株CBM613 hrcN突變體內(nèi)部引物鑒定Fig. 4 PCR analysis of hrcN-in of CBM613/ΔhrcN deletion mutant

將上述1號克隆再次進行hrcN基因內(nèi)部引物鑒定，為陰性擴增后用hrcN基因外側(cè)引物進行進一步的鑒定。圖5顯示，條帶2為原始菌株的擴增產(chǎn)物長度為2739 bp；條帶1為Gm抗性基因替換菌株的擴增產(chǎn)物長度為2580 bp，同時測序結(jié)果顯示局部序列同設計。該克隆子為最終的hrcN基因被Gm抗性基因替換的陽性克隆，稱為：CBM613/ΔhrcN。

圖5 菌株CBM613 hrcN突變體外側(cè)引物鑒定Fig. 5 PCR analysis of hrcN-out of CBM613/ΔhrcN deletion mutant

2.4 回補菌株的篩選及鑒定

在Tc平板上的陽性克隆用pRK415-F/pRK415-R載體引物對進行PCR鑒定。當hrcN克隆入設計位點后，這對引物的擴增產(chǎn)物長度為1634 bp。圖6結(jié)果顯示，1～6號全部克隆都有預期長度的特異片段擴增，取第1號克隆的PCR產(chǎn)物進行測序，結(jié)果顯示與設計一致。經(jīng)轉(zhuǎn)化CBM613/ΔhrcN受體菌后，涂布篩選出陽性克隆，pRK415-F/pRK415-R引物進行PCR擴增，有預期長度的特異片段擴增，表明青枯雷爾氏菌突變株hrcN基因回補成功。

圖6 hrcN基因回補菌株鑒定Fig. 6 PCR analysis of the complemented strain of hrcN gene

2.5 hrcN基因?qū)η嗫堇谞柺暇虏×Φ挠绊?/h3>

hrcN基因敲除后，在NA培養(yǎng)基上28 ℃生長5 d，突變株和回補菌株菌落形態(tài)與野生型菌株相比無明顯變化（圖7）。進一步將野生型菌株、hrcN基因突變株和回補菌株采用根部接種法接種番茄測定致病力結(jié)果表明，野生型菌株接種番茄植株后，在第4 d開始發(fā)病，突變株在第5 d才開始出現(xiàn)萎蔫癥狀。圖8為野生型菌株、突變株和回補菌株在接種后第7 d的發(fā)病情況可知，野生型菌株的病情指數(shù)為1.87，突變株僅為0.27，下降了85.56%；相比野生型菌株，回補菌株病情指數(shù)為1.67，突變株的致病力能夠部分恢復。接種12 d后，野生型菌株的病情指數(shù)高達3.49，而突變株僅為1.89，回補菌株有所恢復為3.18。接種試驗結(jié)果顯示：突變株較野生型菌株的致病力下降，病程延長，但并未喪失致病力，表明hrcN基因是青枯雷爾氏菌致病性相關(guān)的重要基因。

圖7 菌株CBM613、hrcN基因突變株CBM613/ΔhrcN和回補菌株BM613/ΔhrcN-p-hrcN的菌落形態(tài)Fig. 7 Colony morphology of CBM613, CBM613/ΔhrcN deletion mutant and BM613/ΔhrcN-p-hrcN complemented strains

圖8 菌株CBM613、hrcN基因突變株CBM613/ΔhrcN和回補菌株BM613/ΔhrcN-p-hrcN的致病力測定Fig. 8 Evaluation of the pathogenicity of CBM613, CBM613/ΔhrcN deletion mutant and CBM613/ΔhrcN-p-hrcN complemented strains

2.6 hrcN基因?qū)η嗫堇谞柺暇L曲線的影響

分別將CBM613菌株、CBM613/ΔhrcN突變株和CBM613/ΔhrcN-p-hrcN回補菌株在Boucher基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基（貧營養(yǎng)培養(yǎng)基）和 CPG培養(yǎng)基（富營養(yǎng)培養(yǎng)基）中進行生長曲線測定，野生型菌株、突變株和回補菌株在富營養(yǎng)培養(yǎng)基上的生長速率差異不明顯（圖9）。

圖9 菌株CBM613、hrcN基因突變株CBM613/ΔhrcN和回補菌株BM613/ΔhrcN-p-hrcN在富營養(yǎng)培養(yǎng)基上的生長曲線Fig. 9 The growth condition of CBM613, CBM613/ΔhrcN deletion mutant and CBM613/ΔhrcN-p-hrcN complemented strains in the CPG medium

3種青枯雷爾氏菌在貧營養(yǎng)培養(yǎng)基上培養(yǎng)18 h后，突變株比野生型菌株生長更快（圖10），生長速率開始出現(xiàn)明顯差異（P＜0.05），回補菌株與野生型菌株生長速率無明顯差異。

圖10 菌株CBM613、hrcN基因突變株CBM613/ΔhrcN和回補菌株BM613/ΔhrcN-p-hrcN在貧營養(yǎng)培養(yǎng)基上的生長曲線Fig. 10 The growth condition of CBM613, CBM613/ΔhrcN deletion mutant and CBM613/ΔhrcN-p-hrcN complemented strains in the mimimal medium

2.7 hrcN基因?qū)η嗫堇谞柺暇\動性的影響

利用半固體SMM培養(yǎng)基，研究CBM613菌株、CBM613/ΔhrcN突變株和CBM613/ΔhrcN-p-hrcN回補菌株的運動性。通過測量菌落直徑，野生型菌株、突變株和回補菌株的運動能力沒有顯著差異，結(jié)果表明hrcN基因敲除沒有影響青枯雷爾氏菌的運動性（圖11）。

圖11 菌株CBM613、hrcN基因突變株CBM613/ΔhrcN和回補菌株BM613/ΔhrcN-p-hrcN的運動性Fig. 11 The mobility of of CBM613, CBM613/ΔhrcN deletion mutant and CBM613/ΔhrcN-p-hrcN complemented strains

2.8 hrcN基因?qū)η嗫堇谞柺暇锉荒ば纬赡芰Φ挠绊?/h3>

通過對比菌株CBM613、CBM613/ΔhrcN突變株和CBM613/ΔhrcN-p-hrcN回補菌株的生物被膜形成能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)3種青枯雷爾氏菌株的生物被膜形成能力隨培養(yǎng)時間增加而增強，突變株相比于野生型菌株，生物被膜形成能力顯著減弱，而回補菌株與野生型菌株相比差異不明顯（圖12）。

3 討論

作為植物病原菌分泌毒力因子的重要裝置，分泌系統(tǒng)一直以來都是病原細菌研究的熱點，其中 T3SS在各型分泌系統(tǒng)中研究較多[18]。革蘭氏陰性動植物病原菌利用T3SS將效應蛋白注入真核宿主細胞中，跨膜T3SS裝置和ATP酶有關(guān)，ATP酶可為分泌過程提供能量。hrcN基因表達產(chǎn)物為ATP酶，該酶在細菌內(nèi)膜上形成一個與分泌器相關(guān)的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，并在效應蛋白的分泌過程提供能量，對T3SS和細菌的致病性是必不可少的。hrcN基因敲除后對致病力等表型的影響還未見報道，但與HrcN蛋白具有相同功能的InvC蛋白基因敲除后，突變株較野生型菌株毒力與定殖率皆顯著降低[19]。InvC與大腸桿菌F0/F1-ATPase具有催化功能的β亞基氨基酸序列相似程度很高，invC基因突變后其蛋白水解ATP的能力喪失，突變體分析進一步鑒定出InvC參與核苷酸水解和膜結(jié)合的氨基酸序列[20]。本研究以青枯雷爾氏菌T3SS的hrcN基因為研究對象，該基因是AAA+ATPase家族成員之一，產(chǎn)物為ATP酶。利用同源重組技術(shù)得到了hrcN基因部分缺失突變株，發(fā)現(xiàn)突變株較野生型菌株的致病力下降，病程延長，與青枯雷爾氏菌T3SS效應蛋白基因Rip56敲除后致病力測定結(jié)果相似[21]。結(jié)果表明hrcN是青枯雷爾氏菌的致病基因之一，影響T3SS效應蛋白的分泌。

接種試驗表明，hrcN基因突變株導致青枯雷爾氏菌對番茄的致病力下降，為了充分研究基因功能，進一步對其生長速率、生物被膜和運動性等基礎(chǔ)生物學特性進行探究。Kanda等[15]測定了煙草青枯雷爾氏菌的生長曲線結(jié)果顯示，不管在貧營養(yǎng)培養(yǎng)基或者富營養(yǎng)培養(yǎng)基上，野生型菌株與hrpB基因突變株生長速率基本一致。本試驗發(fā)現(xiàn)野生型菌株、hrcN基因突變株和回補菌株在富營養(yǎng)培養(yǎng)基上的生長速率基本一致，在貧營養(yǎng)培養(yǎng)基上，hrcN基因突變株比野生型菌株生長更快，這與Kanda等[15]的研究結(jié)論不一致。在貧營養(yǎng)培養(yǎng)基上突變株比野生型菌株生長更快的文獻還未見報道，對番茄青枯雷爾氏菌hrcN基因突變后的代謝是否產(chǎn)生變化尚未可知，需進一步通過組學等技術(shù)探究其原因。

病原菌通過自身的運動獲得了更大的生存空間，鞭毛等器官可為其提供運動能力。通過運動性病原菌對有利或不利的環(huán)境快速做出響應，避開有害的環(huán)境，接近有利的宿主附近，擴大生存范圍。運動性能夠促使植物病原菌在侵染初期識別、吸附和入侵宿主植物并進行定殖和擴展，提高病原菌的致病能力，而運動性對病原菌入侵植物后的階段不起作用[22]。此次研究發(fā)現(xiàn)hrcN基因敲除后對番茄青枯雷爾氏菌的運動能力沒有影響，而敲除spoT和relA基因后對青枯雷爾氏菌的運動能力影響很大[23]。

生物被膜作為保護細菌的生物活性膜，能夠形成在非有機體和有機體的表面。其主要成分為蛋白質(zhì)、胞外多糖、脂質(zhì)和胞外DNA等，是一種復雜的三維結(jié)構(gòu)。當環(huán)境發(fā)生改變，細菌形成生物被膜可以保持水分，通過調(diào)節(jié)代謝降低營養(yǎng)物質(zhì)的消耗，從而有助于細菌存活。細菌形成的生物被膜將自身包圍，處于其中的細菌相互彼此接觸，影響許多微生物的生存與定殖，比如植物病原細菌通過昆蟲傳播、直接侵入或從受傷部位入侵植物組織，利用生物被膜增強在植物根、莖、葉和種子等部位的定殖與生存，通過阻塞植物木質(zhì)部導管和維管束組織，引起組織損傷，破壞被感染的組織，造成植物萎蔫。玉米細菌性萎蔫病病原菌Pantoeastewartii、馬鈴薯軟腐病病原菌Pectobacterium carotovorumbrasiliense和油菜黑腐病病原菌Xanthomonas campestris等的生物被膜能夠阻塞植物木質(zhì)部導管和維管束組織，引起組織損傷，破壞被感染的組織，造成植物萎蔫[24-26]。研究還發(fā)現(xiàn)，柑橘潰瘍病病原菌Xanthomonas citri的T3SShrpB缺失突變株不能在柑橘葉片表面聚集，喪失生物被膜的形成能力[27]，革蘭氏陰性菌Acidovorax citrulli的4個Ⅵ型分泌系統(tǒng)基因突變株在甜瓜種子上形成生物被膜和定殖的能力降低[28]，某些分泌系統(tǒng)與生物被膜形成和細胞聚集有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)hrcN基因突變株相比于野生型菌株，生物被膜形成能力顯著減弱，結(jié)合hrcN基因突變株致病力降低，說明hrcN基因敲除后，番茄青枯雷爾氏菌生物被膜形成能力降低，番茄木質(zhì)部導管阻塞程度減弱，萎蔫減輕，病情指數(shù)降低。本研究為后續(xù)探究青枯菌 T3SS的功能及其致病機制提供基礎(chǔ)，研究發(fā)現(xiàn)青枯雷爾氏菌hrcN基因敲除后菌株毒性減弱，未來可以作為青枯病的生防菌株，具有一定的應用價值。