袁慶，賈壯壯，張彤，劉文杰，柴麗娟，胡利民

（天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院，組分中藥國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津市中藥藥理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，方劑學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 301617）

微管相關(guān)蛋白2（MAP-2）是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中一種重要的細(xì)胞骨架蛋白，尤以神經(jīng)元胞體、樹突等部位較為常見，主要參與神經(jīng)元的生長(zhǎng)及損傷后修復(fù)，對(duì)神經(jīng)元突觸的穩(wěn)定性及可塑性等方面發(fā)揮重要作用[1-2]。有研究表明，腦缺血損傷會(huì)導(dǎo)致MAP-2等細(xì)胞骨架蛋白的降解，從而使得細(xì)胞骨架完整性遭到破壞，導(dǎo)致神經(jīng)元軸突傳導(dǎo)功能障礙，最終引起神經(jīng)細(xì)胞的死亡[3]。心腦舒通膠囊是由中藥蒺藜干燥的地上全草提取物而制成的膠囊劑，以蒺藜總皂苷為其主要活性成分，具有活血化瘀、補(bǔ)肝益腎等功效[4-5]。目前有關(guān)心腦舒通膠囊對(duì)腦缺血損傷的研究主要在炎癥、氧化應(yīng)激、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)以及其他如星型膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞保護(hù)等方面[6-9]，而對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞骨架蛋白及突觸的研究較少。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)大鼠皮層原代神經(jīng)元給予缺氧/復(fù)氧（OGD/R）處理，模擬腦缺血再灌注損傷過程，觀察心腦舒通膠囊對(duì)OGD/R大鼠皮層神經(jīng)元活力及微管相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，探討心腦舒通膠囊對(duì)損傷神經(jīng)元的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑 出生24 h的SD大鼠[北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK（京）2016-0006]；心腦舒通膠囊（吉林敖東股份有限公司）；DMEM/F12培養(yǎng)基（Gibco，美國(guó)）；CellCounting Kit-8（DOJINDO，日本）；Anti-MAP-2（CST，美國(guó)）；二氧化碳（CO2）培養(yǎng)箱（THERMO，F(xiàn)ORMA3111型，美國(guó)）；缺氧小室（STEMCELL，27310，加拿大）；倒置相差顯微鏡（Nikon，TE200，日本）；多功能讀板機(jī)（TECAN，INFINITE F50，瑞士）；低溫高速離心機(jī)（BECKMAN，64R型，美國(guó)）。

1.2 神經(jīng)元細(xì)胞的原代培養(yǎng) 體外大鼠神經(jīng)元的建立參照鄧?yán)虻萚10]與孫琪等[11]的培養(yǎng)方法，略有改動(dòng)。實(shí)驗(yàn)選取新生24 h內(nèi)的Wistar大鼠乳鼠，經(jīng)75%酒精消毒處理后立即斷頭處死，取腦置于冷的磷酸鹽緩沖液（PBS）中并小心去除腦膜及大血管，于冰上小心分離出兩側(cè)大腦皮質(zhì)于預(yù)冷的DMEM/F12培養(yǎng)基中，立即轉(zhuǎn)入超凈臺(tái)內(nèi)并進(jìn)行殺菌處理；用小剪刀剪碎皮層組織，剪碎后加入約5 mL的0.25%胰蛋白酶于37℃恒溫?fù)u床內(nèi)消化5 min，加入含血清培養(yǎng)液終止消化，輕吹細(xì)胞使其分散，經(jīng)75 μm的篩網(wǎng)過濾，取濾液于4℃，1000 r/m，離心半徑9.3cm，離心10 min后收集沉淀，用含10%胎牛血清（FBS）的DMEM/F12的全培基重懸細(xì)胞，輕吹細(xì)胞使其完全分散成單個(gè)細(xì)胞，接種于事先經(jīng)多聚賴氨酸包被處理的培養(yǎng)板中，置37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。4 h后加入新鮮配制的B27全培養(yǎng)基（2%B27+1%青霉素+1%鏈霉素+0.5%谷氨酰胺+DMEM/F12），置37℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，隔天半量換B27全培養(yǎng)基。每日于倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)和生長(zhǎng)狀況。

1.3 MAP-2免疫熒光法鑒定 24孔培養(yǎng)板經(jīng)多聚賴氨酸包被處理后接種神經(jīng)元細(xì)胞，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%時(shí)進(jìn)行免疫熒光鑒定處理。吸除培養(yǎng)板內(nèi)液體并用PBS將細(xì)胞輕洗2遍，4%多聚甲醛室溫固定15 min，用PBS輕洗3次，每次3 min。每孔加入300 μL封閉液，室溫封閉60 min。隨后加入 anti-MAP-2（1∶200）抗體于 4℃孵育過夜。次日用PBS洗滌3次，每次5 min。避光加入IgG-FITC（1∶1 000）熒光二抗，37 ℃孵育 30 min。用 PBS洗滌3次，每次 5 min，加入 Hochest 33342染液，并用抗熒光淬滅封片劑，倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.4 體外OGD/R損傷模型的建立 建立體外建立OGD/R損傷模型[12]：用PBS洗滌細(xì)胞2次，迅速加入無糖DMEM培養(yǎng)基，放入缺氧小室，向小室內(nèi)持續(xù)充入含95% N2+5% CO2的混合氣體6 min，放入37℃孵箱中分別培養(yǎng)2、3、4 h后，打開缺氧小室，取出培養(yǎng)板，棄去無糖緩沖液，加入含糖培養(yǎng)基，放入37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。對(duì)照組用含糖緩沖液洗細(xì)胞2次后，迅速加入含糖緩沖液，放入37℃，5% CO2培養(yǎng)箱孵育24 h。

1.5 心腦舒通膠囊對(duì)正常和OGD/R損傷神經(jīng)元細(xì)胞活力的影響 首先檢測(cè)不同濃度心腦舒通膠囊對(duì)體外正常神經(jīng)元細(xì)胞活力的影響，以期明確實(shí)驗(yàn)所加藥物對(duì)細(xì)胞無毒作用的濃度范圍。具體步驟如下：對(duì)照組置換為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，加藥組在對(duì)照組的基礎(chǔ)上加入不同濃度心腦舒通膠囊（0.01、0.1、1、10、25、50 μg/mL）的培養(yǎng)基，正常孵育 24 h 后棄細(xì)胞上清，向每孔加入100μL的CCK-8工作液（終濃度10%），37℃孵育60 min，酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)檢測(cè)各孔的吸光度值，吸光度值的大小與細(xì)胞活力成正相關(guān)。

對(duì)OGD/R損傷神經(jīng)元細(xì)胞活力的檢測(cè)，細(xì)胞缺氧處理方法如1.4所述，于復(fù)氧的同時(shí)加入不同濃度心腦舒通膠囊（0.01、0.1、1.612 5、3.125、6.25 μg/mL）的培養(yǎng)基，復(fù)氧24 h后向每孔加入含10% CCK-8的DMEM培養(yǎng)液100 μL，37℃孵育60 min，酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔450 nm波長(zhǎng)處吸光度值，篩選藥物對(duì)氧OGD/R損傷神經(jīng)元的有效劑量。

1.6 心腦舒通膠囊對(duì)OGD/R損傷神經(jīng)元突觸長(zhǎng)度表達(dá)的影響 將原代神經(jīng)元接種于事先經(jīng)多聚賴氨酸包被處理的24孔培養(yǎng)板內(nèi)，隔天換液，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%時(shí)進(jìn)行處理。首先將細(xì)胞分為對(duì)照組、模型組、心腦舒通膠囊給藥組，細(xì)胞OGD/R及加藥處理如1.4所述，并于復(fù)氧24h后進(jìn)行MAP-2免疫熒光染色處理，如1.3所示。倒置熒光顯微鏡下進(jìn)行拍照處理，每組隨機(jī)拍攝10個(gè)視野，用Image J軟件對(duì)圖片進(jìn)行熒光強(qiáng)度及突觸長(zhǎng)度的測(cè)定，結(jié)果取平均值。

1.7 心腦舒通膠囊對(duì)OGD/R損傷神經(jīng)元MAP-2蛋白表達(dá)的影響 將原代神經(jīng)元接種到多聚賴氨酸包被的6孔板，細(xì)胞OGD/R及加藥處理如1.4所述。24 h后用預(yù)冷的PBS洗3次。每孔加入100 μL蛋白裂解液（含1%PMSF），于冰上震蕩裂解30 min，刮下細(xì)胞于4℃12 000 r/min，離心半徑9.3 cm，離心15min。吸取上清用BCA法測(cè)定蛋白濃度。10%SDSPAGE膠質(zhì)進(jìn)行電泳及轉(zhuǎn)膜，5%的奶粉封閉2 h，封閉后將相應(yīng) PVDF 膜置于 Anti-MAP-2（1∶1 000）、Anti-β-actin（1∶1 000）抗體中，4 ℃過夜。次日用TBST 洗滌5min×3 次。加入IgG-HRP 二抗（1∶10000）孵育1 h，用TBST洗滌5 min×3次。自動(dòng)曝光儀進(jìn)行曝光，通過凝膠圖像處理系統(tǒng)分析目的蛋白條帶灰度值并計(jì)算相應(yīng)蛋白表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)由SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，計(jì)量資料統(tǒng)計(jì)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間兩兩比較采用 LSD 法。P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 原代神經(jīng)元鑒定 原代神經(jīng)元細(xì)胞接種4 h后顯微鏡下觀察到大部分細(xì)胞開始貼壁，少部分細(xì)胞長(zhǎng)出短突起；24 h后觀察大多數(shù)細(xì)胞已出現(xiàn)長(zhǎng)突起；2～3 d后觀察，細(xì)胞突起增多、增粗，胞體變得更加透亮；4 d后突起密集，細(xì)胞間開始形成突觸聯(lián)系；7～9 d，突觸的分支大量增多，且細(xì)胞間建立起更為緊密的聯(lián)系（見圖1左）。利用MAP-2免疫熒光化學(xué)法進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)正常且純度達(dá)到95%以上（見圖1右），可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 神經(jīng)元OGD/R損傷模型的建立 實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步對(duì)神經(jīng)元進(jìn)行OGD/R損傷條件的摸索，與對(duì)照組比較，缺氧2、3、4 h/復(fù)氧24 h后，細(xì)胞活力均有所下降，缺氧2 h損傷程度較低細(xì)胞活力約為對(duì)照組的76%，后期實(shí)驗(yàn)中可能造成模型不成功；缺氧4 h損傷過于嚴(yán)重活力約為對(duì)照組的41%，可能影響藥效的發(fā)揮；缺氧3 h后細(xì)胞活力約為對(duì)照組的56%，故選取OGD3 h/R24 h建立OGD/R損傷模型。見圖2。

圖2 神經(jīng)元細(xì)胞OGD/R模型的建立Fig.2 Establishment of OGD/R model of neuron

2.3 心腦舒通膠囊對(duì)正常及OGD/R損傷神經(jīng)元細(xì)胞活力的影響 CCK-8結(jié)果顯示與對(duì)照組比較，心腦舒通膠囊在10、25、50 μg/mL濃度對(duì)正常培養(yǎng)神經(jīng)元細(xì)胞活力顯著降低（P＜0.05），表明心腦舒通膠囊在該濃度范圍內(nèi)對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞有一定的細(xì)胞毒作用，因此選取低于10 μg/mL濃度的心腦舒通膠囊（0.01、0.1、1.612 5、3.125、6.25 μg/mL） 進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)；而在OGD/R損傷條件下，與模型組比較，心腦舒通膠囊在 3.125、6.25 μg/mL 濃度能顯著增加OGD/R 損傷神經(jīng)元的細(xì)胞活力（P＜0.05），且在3.125 μg/mL濃度作用最為顯著，故選擇該濃度進(jìn)行后續(xù)免疫熒光實(shí)驗(yàn)。見圖3。

圖3 心腦舒通膠囊對(duì)正常及OGD/R損傷神經(jīng)元細(xì)胞活力的影響Fig.3 Effects of Xinnao Shutong Capsule on normal and OGD/R neuronal cell viability

2.4 心腦舒通膠囊對(duì)OGD/R損傷神經(jīng)元突觸長(zhǎng)度表達(dá)的影響 MAP-2蛋白熒光強(qiáng)度檢測(cè)可反映神經(jīng)元MAP-2的蛋白表達(dá)情況，熒光強(qiáng)度越高表明其蛋白表達(dá)量越高，反之亦然。MAP-2免疫熒光結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，模型組熒光強(qiáng)度顯著降低，表明OGD/R損傷后神經(jīng)元MAP-2蛋白表達(dá)顯著降低，對(duì)其突觸長(zhǎng)度進(jìn)行測(cè)定結(jié)果顯示，模型組神經(jīng)元突觸長(zhǎng)度也顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，心腦舒通膠囊在 3.125 μg/mL濃度能顯著增加OGD/R損傷神經(jīng)元的MAP-2熒光強(qiáng)度以及神經(jīng)元突觸長(zhǎng)度（P＜0.01）。見圖 4。

圖4 心腦舒通膠囊對(duì)OGD/R損傷神經(jīng)元突觸長(zhǎng)度表達(dá)的影響Fig.4 Effects of Xinnao Shutong capsule on the expression of synaptic length in neurons injured by OGD/R

2.5 心腦舒通膠囊對(duì)OGD/R損傷神經(jīng)元MAP-2蛋白表達(dá)的影響 與對(duì)照組比較，模型組能顯著降低神經(jīng)元的MAP-2蛋白表達(dá)量（P<0.05）；與模型組比較，心腦舒通膠囊能顯著增加MAP-2蛋白表達(dá)水平（P<0.05）。見圖5。

圖5 心腦舒通膠囊對(duì)OGD/R損傷神經(jīng)元MAP-2蛋白表達(dá)的影響Fig.5 Effect of Xinnao Shutong Capsule on the expression of MAP-2 protein in neurons injured by OGD/R

3 討論

腦缺血再灌注損傷是指腦組織在遭受一定時(shí)間缺血而恢復(fù)血供后，不但其功能未能恢復(fù)，其組織損傷程度反而加重的病理現(xiàn)象，其主要通過一系列反應(yīng)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡最終導(dǎo)致神經(jīng)元死亡[13]。有研究表明，再灌注過程中機(jī)體會(huì)產(chǎn)生一定程度的內(nèi)源性神經(jīng)修復(fù)反應(yīng)，但該作用往往有限，不足以修復(fù)再灌注損傷后嚴(yán)重的神經(jīng)功能障礙，因此需要給予一定的外源性藥物從而增強(qiáng)神經(jīng)修復(fù)過程[14]。

MAP-2是一種重要的細(xì)胞骨架蛋白，集中表達(dá)于腦組織內(nèi)，在神經(jīng)元的胞體及樹突均有分布，其主要功能與神經(jīng)再生、細(xì)胞凋亡及突觸可塑性等方面有關(guān)[15]。MAP-2是神經(jīng)元中的標(biāo)志性微管相關(guān)蛋白，其含量的變化可反映神經(jīng)元的存活狀態(tài)和功能變化[16]。腦缺血再灌注損傷初期即發(fā)見MAP-2的表達(dá)量出現(xiàn)明顯下調(diào)，其表達(dá)降低可使細(xì)胞微管結(jié)構(gòu)發(fā)生不穩(wěn)定變化，甚至引起神經(jīng)元不可逆損傷。Gotohda等[17]通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)使大鼠吸入一定劑量甲苯以造成神經(jīng)元的損害，結(jié)果發(fā)現(xiàn)受損神經(jīng)元內(nèi)的MAP-2含量較正常神經(jīng)元明顯減少。Cao等[18]通過使沙鼠腦干發(fā)生短暫性缺血后通過免疫組化方法檢測(cè)不同時(shí)間缺血腦組織內(nèi)MAP-2的表達(dá)情況，結(jié)果顯示隨著缺血時(shí)間的延長(zhǎng)及神經(jīng)元的死亡，其MAP-2的表達(dá)量逐漸降低，表明MAP-2是反應(yīng)神經(jīng)元損傷的敏感指標(biāo)。MAP-2對(duì)神經(jīng)元的發(fā)育和可塑性也具有重要調(diào)節(jié)作用。Chiba等[19]通過對(duì)脊髓損傷的大鼠進(jìn)行骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)過干細(xì)胞移植處理的大鼠后肢功能恢復(fù)能力明顯加快，且發(fā)現(xiàn)在皮質(zhì)區(qū)脊髓灰質(zhì)內(nèi)MAP-2的陽性表達(dá)明顯增加，該結(jié)果提示MAP-2可能參與了神經(jīng)元間突觸連接的建立及神經(jīng)環(huán)路的重建。

研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，OGD/R損傷神經(jīng)元無論在細(xì)胞活力還是MAP-2熒光強(qiáng)度表達(dá)強(qiáng)度及蛋白表達(dá)量均顯著下降，且通過測(cè)量突觸長(zhǎng)度發(fā)現(xiàn)其突觸長(zhǎng)度明顯短于對(duì)照組，表明其神經(jīng)元中MAP-2表達(dá)量量降低，突觸受損斷裂嚴(yán)重，推測(cè)缺血再灌注損傷導(dǎo)致的MAP-2表達(dá)下降可能使神經(jīng)細(xì)胞功能受損，影響神經(jīng)元的再生及可塑性，甚至死亡。而在模型組的基礎(chǔ)上給予心腦舒通膠囊干預(yù)后神經(jīng)元細(xì)胞活力、MAP-2熒光強(qiáng)度、突觸長(zhǎng)度及其蛋白表達(dá)量均顯著升高，提示心腦舒通膠囊可促進(jìn)受損神經(jīng)元MAP-2的表達(dá)，從而維持細(xì)胞穩(wěn)定性及突觸可塑性，進(jìn)而說明其在神經(jīng)元可塑性方面發(fā)揮重要作用。

綜上所述，心腦舒通膠囊在OGD/R損傷神經(jīng)元存活方面發(fā)揮重要保護(hù)作用，且其作用機(jī)制與促進(jìn)細(xì)胞骨架蛋白MAP-2表達(dá)及突觸穩(wěn)定性有關(guān)。