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(齊魯工業(yè)大學(xué)(山東省科學(xué)院) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，濟(jì)南 250353)

天然防腐劑和化學(xué)防腐劑是兩類食品防腐劑[1]?；瘜W(xué)防腐劑能有效地控制食品致病菌的生長(zhǎng)繁殖，目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)中，但是化學(xué)防腐劑存在的潛在毒性不能忽視，而天然防腐劑具有安全無(wú)毒、熱穩(wěn)定性高等優(yōu)點(diǎn)[2]。因此，研究和開發(fā)天然防腐劑成為近年來(lái)的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。

大豆球蛋白堿性多肽(GBP)是從豆粕中提取分離得到的具有抑菌性的陽(yáng)離子多肽[3]。GBP對(duì)于牛奶中的腸炎沙門氏菌、單細(xì)胞李斯特菌等致病菌有顯著的抑菌效果，可延長(zhǎng)牛奶的保質(zhì)期[4]。Li等研究了GBP對(duì)在4 ℃條件下冷藏豬肉的保鮮效果，結(jié)果表明0.16%和0.20%的GBP顯著地抑制了細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖，延長(zhǎng)冷藏豬肉的保質(zhì)期長(zhǎng)達(dá)6 d[5]。乳酸鏈球菌素(Nisin)是從微生物中提取的一種天然抗菌肽，由34個(gè)氨基酸組成。對(duì)于李斯特菌等革蘭氏陽(yáng)性菌有良好的抑菌效果[6]，被人體消化道酶降解成氨基酸，對(duì)人體安全無(wú)毒。大多研究表明，它能有效抑制引起食品腐敗的大范圍的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌(尤其是親緣性較近的細(xì)菌)[7]，如乳桿菌、肉毒梭狀芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、溶血鏈球菌、李斯特氏菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌等，尤其對(duì)產(chǎn)生芽孢的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌有特效，而對(duì)革蘭氏陰性菌作用不大，對(duì)酵母菌和霉菌沒有作用[8]。

此外，乳酸鏈球菌素對(duì)梭狀芽孢桿菌的抑制作用顯著，可應(yīng)用于肉制品工業(yè)中。Mangalassary等研究了巴氏殺菌低脂火雞臘腸過程中使用乳酸鏈球菌素對(duì)單細(xì)胞增生李斯特菌失活時(shí)間的影響，結(jié)果顯示乳酸鏈球菌素有效縮短了目標(biāo)菌失活所需的時(shí)間[9]。目前認(rèn)為抗菌肽的抑菌機(jī)理有兩種：一是抗菌肽通過靜電相互作用與細(xì)胞膜結(jié)合導(dǎo)致其結(jié)構(gòu)破壞[10]；二是抗菌肽不僅破壞細(xì)胞膜，而且能破壞細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)的核酸和蛋白質(zhì)大分子物質(zhì)從而影響細(xì)胞生理活動(dòng)[11]。

李斯特菌能感染肉類、蛋類、海產(chǎn)品、乳制品等絕大多數(shù)食品。由于大量的抑菌劑在食品生產(chǎn)過程中廣泛使用，造成李斯特菌的抗性增強(qiáng)，使得在食品生產(chǎn)過程中如何抑制李斯特菌的生長(zhǎng)成為一個(gè)難題。食品企業(yè)科學(xué)、合理、適量地添加化學(xué)防腐劑并不會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生危害，然而超標(biāo)、超量、超范圍添加則很容易造成食品安全隱患。而GBP與Nisin兩種天然防腐劑安全性能高，功能價(jià)值高，抑菌性好。通過比較GBP與Nisin抗李斯特菌特性，可以更好地選擇更加優(yōu)良的抗菌劑應(yīng)用到食品防腐工業(yè)中。

1 材料與試劑

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

大豆球蛋白堿性亞基(GBP)、乳酸鏈球菌素(Nisin)：購(gòu)自實(shí)驗(yàn)室；李斯特菌(Listeriamonocytogenes)：從齊魯工業(yè)大學(xué)菌種保藏中心獲得；其余試劑均為分析純。

1.2 菌種及培養(yǎng)基

李斯特菌ATCC19115：齊魯工業(yè)大學(xué)菌種保藏中心；腦心浸液肉湯培養(yǎng)基(培養(yǎng)李斯特菌)。

1.3 培養(yǎng)基及溶液的配制

將單增李斯特菌接種于腦心浸液肉湯瓊脂斜面，37 ℃培養(yǎng)24 h，挑取單菌落，接種于已滅菌的腦心浸液肉湯液體培養(yǎng)基中，在37 ℃，150 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)10 h左右，菌懸液濃度達(dá)到107CFU/mL，生長(zhǎng)達(dá)到穩(wěn)定期，實(shí)驗(yàn)備用。

滅菌生理鹽水：配制一定濃度的生理鹽水滅菌備用。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 最小抑菌濃度(MIC)的測(cè)定

GBP和Nisin對(duì)李斯特菌的抗菌活性可通過稀釋法進(jìn)行測(cè)定[12]。李斯特菌培養(yǎng)至菌液濃度約為107CFU/mL，將不同濃度的GBP和Nisin分別加入到菌懸液中，GBP和Nisin終濃度分別為25，50，100，200，300，350，400，450 μg/mL，以菌懸液作為陽(yáng)性對(duì)照，液體培養(yǎng)作為陰性對(duì)照，在37 ℃振蕩培養(yǎng)24 h，通過測(cè)定各組樣品在OD600 nm處的吸光度來(lái)比較GBP和Nisin的抑菌特性，每組平行做3次。

2.2 李斯特菌細(xì)胞內(nèi)RNA及蛋白類泄露的測(cè)定

李斯特菌培養(yǎng)至對(duì)數(shù)末期，將100 mL菌液平均分裝在4個(gè)離心管里，在6000 r/min條件下離心20 min，無(wú)菌生理鹽水洗滌2次并放入3 mL的生理鹽水，將不同濃度的GBP和Nisin分散液加入到菌懸液中，GBP終濃度為0，200，400 μg/mL，Nisin終濃度為0，400，800 μg/mL，在恒溫?fù)u床培養(yǎng)箱中37 ℃，150 r/min條件下培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)0.5，1，1.5，2，3，4 h后取出3 mL菌液，在6000 r/min條件下離心5 min，保留上清液冷凍保藏。用紫外可見分光光度計(jì)分別在260，280 nm處檢測(cè)其上清液的吸光度[13]，并繪制相應(yīng)曲線。

2.3 李斯特菌細(xì)胞內(nèi)還原糖泄露的測(cè)定

將李斯特菌培養(yǎng)至菌液濃度約為107CFU/mL，以10 mL菌液量進(jìn)行分組，在6000 r/min離心20 min收集李斯特菌菌體，用滅菌生理鹽水洗滌細(xì)胞2次。并加入到9 mL滅菌生理鹽水后，將不同濃度的GBP和Nisin分散液加入到菌懸液中，GBP終濃度分別為0，200，400 μg/mL，Nisin終濃度分別為0，400，800 μg/mL，分別在培養(yǎng)0.5，1，1.5，2，3，4 h后取出3 mL菌液，在6000 r/min條件下離心5 min，保留上清液冷凍保藏。用還原糖測(cè)定儀分別測(cè)定樣液中還原糖的含量。

3 結(jié)果與討論

3.1 最小抑菌濃度(MIC)的測(cè)定

GBP和Nisin對(duì)單增李斯特菌的最小抑菌濃度見表1。

表1 GBP和Nisin對(duì)單增李斯特菌的最小抑菌濃度測(cè)定Table 1 The MIC of GBP and Nisin against Listeria monocytogenes

由表1可知，GBP濃度為100 μg/mL時(shí)，無(wú)菌生長(zhǎng)；在Nisin濃度達(dá)到400 μg/mL時(shí)，無(wú)菌生長(zhǎng)，說(shuō)明GBP和Nisin對(duì)李斯特菌的最小抑菌濃度(MIC)分別為100，400 μg/mL。GBP和Nisin對(duì)李斯特菌都具有良好的抑菌效果，但GBP對(duì)李斯特菌的抑制效果明顯強(qiáng)于Nisin對(duì)李斯特菌的抑制效果。

3.2 李斯特菌細(xì)胞內(nèi)RNA及蛋白類泄露的測(cè)定

經(jīng)兩種抗菌肽處理對(duì)李斯特菌RNA泄露的影響見圖1和圖2；經(jīng)兩種抗菌肽處理對(duì)蛋白質(zhì)泄露的影響見圖3和圖4。

圖1 GBP對(duì)李斯特菌RNA泄露的影響Fig.1 The effect of GBP on RNA leakage of Listeria monocytogenes

圖2 Nisin對(duì)李斯特菌RNA泄露的影響Fig.2 The effect of Nisin on RNA leakage of Listeria monocytogenes

圖3 GBP對(duì)李斯特菌蛋白泄露的影響Fig.3 The effect of GBP on protein leakage of Listeria monocytogenes

圖4 Nisin對(duì)李斯特菌蛋白泄露的影響Fig.4 The effect of Nisin on protein leakage of Listeria monocytogenes

李斯特菌細(xì)胞內(nèi)的核糖體是由RNA和蛋白質(zhì)共價(jià)合成，RNA和蛋白質(zhì)對(duì)細(xì)胞的生命活動(dòng)有著不可缺少的重要作用。蛋白質(zhì)是細(xì)胞重要的結(jié)構(gòu)組成成分，而核糖體具有合成蛋白質(zhì)的功能，所以RNA和蛋白質(zhì)這兩種物質(zhì)對(duì)李斯特菌細(xì)胞的生命活動(dòng)起著重要的作用。測(cè)定RNA和蛋白質(zhì)成分的最大吸光值分別在OD260 nm處和OD280 nm處，因此，可以通過紫外分光光度計(jì)在這兩個(gè)波長(zhǎng)下測(cè)定細(xì)胞外是否出現(xiàn)RNA和蛋白質(zhì)成分[14]。

由圖4可知經(jīng)不同濃度GBP和Nisin處理的李斯特菌的RNA及蛋白質(zhì)成分溶出情況。同一時(shí)間，OD值分別隨著兩種抗菌肽濃度的升高而增大，表明抗菌肽濃度越高，RNA與蛋白質(zhì)泄露也在增多；同一濃度下，隨著時(shí)間的累積，吸光值也不斷增大，說(shuō)明RNA與蛋白質(zhì)不斷從細(xì)胞膜內(nèi)流出。

由圖1～圖4可知，同一時(shí)間，在抗菌肽濃度為400 μg/mL時(shí)，經(jīng)Nisin處理的樣液的OD值要高于GBP處理的OD值，樣液的RNA及蛋白質(zhì)成分流出量更多。由此得出GBP與Nisin兩種抗菌肽使李斯特菌的RNA及蛋白質(zhì)泄露的膜作用方式不同。初步推斷，GBP作用于細(xì)菌的細(xì)胞膜上，干擾細(xì)胞正常生理活動(dòng)，從而抑制菌體生長(zhǎng)；而Nisin通過破壞李斯特菌的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，使其通透性增大，從而導(dǎo)致RNA及蛋白質(zhì)成分從膜內(nèi)流出，造成菌體的死亡，抑制李斯特菌的生長(zhǎng)。

3.3 李斯特菌細(xì)胞內(nèi)還原糖泄露的測(cè)定

GBP和Nisin對(duì)李斯特菌還原糖含量的影響分別見圖5和圖6。

圖5 GBP對(duì)李斯特菌還原糖含量的影響Fig.5 The effect of GBP on reducing sugar content of Listeria monocytogenes

圖6 Nisin對(duì)李斯特菌還原糖含量的影響Fig.6 The effect of Nisin on reducing sugar content of Listeria monocytogenes

當(dāng)在OD260 nm和OD280 nm下測(cè)定細(xì)菌的吸光度時(shí)，由于細(xì)菌表面物質(zhì)的自然泄露，無(wú)論是否加入抗菌肽，都會(huì)導(dǎo)致吸光值變大。可以通過測(cè)定李斯特菌細(xì)胞內(nèi)還原糖的泄露量來(lái)反映GBP與Nisin對(duì)李斯特菌細(xì)胞膜的破壞作用。

由圖5和圖6可知，與對(duì)照組細(xì)菌細(xì)胞菌懸液中還原糖相比，經(jīng)兩種抗菌劑處理的樣本中還原糖含量明顯上升。在3 h之內(nèi)，隨著GBP與Nisin抗菌肽的濃度增大，還原糖含量也分別迅速上升。在抗菌劑濃度為400 μg/mL時(shí)，經(jīng)Nisin處理的菌懸液測(cè)定的還原糖含量(見圖6)要高于經(jīng)GBP處理的還原糖含量(見圖5)。

4 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，GBP與Nisin兩種抗菌劑都能夠有效抑制李斯特菌的生長(zhǎng)，GBP和Nisin抑制李斯特菌生長(zhǎng)的最小抑菌濃度分別是100，400 μg/mL，GBP的抑菌效果要強(qiáng)于Nisin。兩種天然抗菌肽都能造成其細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的損傷，并損傷胞內(nèi)蛋白及RNA遺傳物質(zhì)等成分。此實(shí)驗(yàn)只是對(duì)李斯特菌的抑菌機(jī)制機(jī)理做了初步的研究比較，更深層次的抑制機(jī)理的研究有待探索，例如對(duì)蛋白質(zhì)和堿性磷酸酶合成的影響，對(duì)細(xì)胞膜造成的破壞等。