自噬基因結(jié)腸癌預(yù)后模型建立及驗(yàn)證*

王竣立 陶成成 喬玲 游江舟 李昌龍

(四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室，四川 成都 610041)

根據(jù)2018年的全球癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，結(jié)腸癌的全球發(fā)病率排名第三，死亡率在所有癌癥中排名第二，且發(fā)病率和死亡率都有逐年上升的趨勢[1]。臨床上影響結(jié)腸癌預(yù)后的風(fēng)險(xiǎn)因素變化多樣，包括患者的年齡、生活習(xí)慣、腫瘤發(fā)生的部位、其生物學(xué)特性及腫瘤的分期。近年來我國結(jié)腸癌的發(fā)病率呈快速增長趨勢，雖然手術(shù)、放化療、靶向治療等在一定程度上延長了結(jié)腸癌患者的生存時(shí)間，但治療后腫瘤局部復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的發(fā)生率仍較高。因此,有效預(yù)測復(fù)發(fā)傾向和預(yù)后水平在結(jié)腸癌治療中具有重要意義。在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，自噬有著雙向調(diào)控的作用，根據(jù)細(xì)胞基因組成和細(xì)胞所處環(huán)境的變化,自噬既能抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展，同樣也參與了腫瘤的進(jìn)程與耐藥[2-3]。研究通過癌癥基因組圖庫(The Cancer Genome Atlas, TCGA)數(shù)據(jù)庫中提取轉(zhuǎn)錄組測序信息，篩選與結(jié)直腸癌預(yù)后相關(guān)的自噬基因，并構(gòu)建其風(fēng)險(xiǎn)計(jì)算模型，以期對臨床結(jié)直腸癌的預(yù)后分析和前期治療提供靶向治療思路。

1 資料與方法

1.1 結(jié)腸癌差異自噬基因篩選與功能分析 使用TCGA數(shù)據(jù)庫收集結(jié)腸癌轉(zhuǎn)錄組及生存信息，將轉(zhuǎn)錄組原始基因代碼轉(zhuǎn)換成基因名稱，整合患者年齡、性別、癌癥分期、轉(zhuǎn)移狀況和生存狀況等多項(xiàng)數(shù)據(jù)。使用R語言wilcox檢驗(yàn)篩選出結(jié)直腸癌差異自噬基因，篩選條件為P<0.05。在GO以及KEGG pathway 數(shù)據(jù)庫中，對差異表達(dá)自噬基因進(jìn)行信號(hào)通路以及功能的富集分析，GO富集分析是對差異表達(dá)的自噬基因進(jìn)行GO分類，基于離散分布顯著性、誤判率和富集度的分析，得出與樣本顯著相關(guān)的、低誤判率的、靶向性的基因功能分類，初步預(yù)測差異基因的功能。KEGG pathway 分析是通過KEGG數(shù)據(jù)庫以及Biocarta來進(jìn)行分類，對通路中的基因進(jìn)行顯著性分析，得到與樣本有顯著關(guān)聯(lián)的信號(hào)通路，預(yù)測其功能。

1.2 模型構(gòu)建 首先對差異表達(dá)的自噬基因進(jìn)行單因素Cox風(fēng)險(xiǎn)回歸分析，初步篩選出對結(jié)腸癌預(yù)后可能具有影響的自噬基因，篩選條件為P<0.05。然后對單因素Cox風(fēng)險(xiǎn)回歸分析篩選出的差異表達(dá)基因進(jìn)行多因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析，依據(jù)回歸系數(shù)(β)及風(fēng)險(xiǎn)比(hazard ratio，HR)來識(shí)別保護(hù)(HR<1)和危險(xiǎn)(HR>1)，同時(shí)篩選出了高風(fēng)險(xiǎn)自噬差異基因，以上述基因表達(dá)量為自變量，患者生存時(shí)間與生存狀態(tài)作為因變量，使用COX-PH函數(shù)構(gòu)建自噬基因預(yù)后模型。

1.3 模型驗(yàn)證及臨床相關(guān)性分析 以患者風(fēng)險(xiǎn)值與生存狀態(tài)繪制生存曲線；將患者風(fēng)險(xiǎn)值由低到高繪制風(fēng)險(xiǎn)曲線；結(jié)合患者生存狀態(tài)以及參與模型構(gòu)建的風(fēng)險(xiǎn)自噬基因表達(dá)量，綜合驗(yàn)證所構(gòu)建預(yù)后模型是否能作為結(jié)腸癌預(yù)后獨(dú)立危險(xiǎn)因子。將參與模型構(gòu)建的自噬基因與模型所得危險(xiǎn)因子與患者癌癥分期、年齡、性別、是否轉(zhuǎn)移進(jìn)行相關(guān)性分析。

1.4WIPI2、RAB7A基因的驗(yàn)證

1.4.1 細(xì)胞株和主要試劑 人結(jié)腸細(xì)胞NCM460與人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116、RKO(ATCC)；胎牛血清(Hyclone，美國)；DMEM培養(yǎng)基(Biological Industries，以色列)；1%青霉素-鏈霉素(Hyclone，美國)；PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa，日本)；TB Green PCR Mix(TaKaRa，日本)；Trizol(碧云天，中國)。

1.4.2 Real-time PCR檢測正常結(jié)腸細(xì)胞與結(jié)腸癌細(xì)胞中WIPI2、RAB7A基因表達(dá)水平，分別使用正常結(jié)腸細(xì)胞(NCM460)，兩株結(jié)腸癌細(xì)胞(HCT116、RKO)。傳代培養(yǎng)至密度80%時(shí)，提取正常結(jié)腸細(xì)胞和結(jié)腸癌細(xì)胞總RNA，使用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以此cDNA為模板，GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參，進(jìn)行Real-time PCR。Real-time PCR反應(yīng)體系為：25μL總反應(yīng)體系中TB Green PCR Mix 12.5μL，上、下游引物分別為1μL，cDNA模板1μL，dd H2O 9.5μL。反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃ 30s；變性95℃ 5s，退火延伸60℃ 30s，共35個(gè)循環(huán)。按2-ΔΔCt法進(jìn)行相對定量分析。

引物序列如下：RAB7AForward:5′-GTGATGG TGGATGACAGGCTAG-3′，RAB7AReverse：5′-AG TCTGCACCTCTGTAGAAGGC-3′；WIPI2 Forward: 5′-CGACAACTGCTACTTGGCGTAC-3′，WIPI2 Reverse: 5′-AGTGCCGCTAAAGGACTGTCGT-3′；GAPDHForward：GAGTCAACGGATTTGGTCGT，GAPDHReverse：GACAAGCTTCCCGTTCTCAG。設(shè)正常結(jié)腸細(xì)胞的相對表達(dá)量為1。

2 結(jié)果

2.1 篩選結(jié)腸癌差異表達(dá)自噬基因 利用TCGA數(shù)據(jù)庫中收集到的正常樣品42例，腫瘤樣品482例，進(jìn)行wilcox檢驗(yàn)，篩選出結(jié)腸癌相關(guān)差異表達(dá)自噬基因共34個(gè)，其中上調(diào)基因16個(gè)，下調(diào)基因18個(gè)(圖1A)。紅色為高表達(dá)基因，綠色為低表達(dá)基因；離散程度代表基因差異表達(dá)程度。如圖1B，紅色為高表達(dá)基因，綠色為低表達(dá)基因，亮度越高，表達(dá)差異程度越大，具體的的logFC，P value，F(xiàn)DR(見表1)。其中HSPB8，NKX2-3，NRG2，TP53INP2等上調(diào)最為顯著，這些上調(diào)基因除參與自噬外，與信號(hào)傳導(dǎo)，基因的異常表達(dá)，藥物抵抗有著密切相關(guān)[4-7]，相反CDKN2A，ATG9B等顯著下調(diào)的基因與腫瘤抑制，細(xì)胞周期調(diào)節(jié)等也有一定相關(guān)性[8-9]。

圖1 結(jié)腸癌差異表達(dá)自噬基因

表1 結(jié)腸癌相關(guān)差異表達(dá)自噬基因

2.2 GO與KEGG富集分析 對篩選出的差異表達(dá)自噬基因進(jìn)行GO以及KEGG功能預(yù)測。GO分析的結(jié)果顯示，差異表達(dá)自噬基因除主要富集在自噬功能以外，在細(xì)胞的氧化應(yīng)激過程，細(xì)胞凋亡過程，線粒體膜反應(yīng)以及細(xì)胞色素c的釋放等功能上均有10個(gè)以上差異基因的富集(P<0.05)，見圖2A。KEGG信號(hào)通路分析共得到30條有顯著差異的信號(hào)通路，主要集中在自噬、P53信號(hào)通路、凋亡、順鉑類藥物拮抗、EGFR酪氨酸酶抑制劑拮抗等(P< 0.05)，見圖2B。count值代表富集基因數(shù)，count值越大，氣泡面積越大，富集基因越多；由藍(lán)到紅，P值越來越小，下同。

圖2 GO與KEGG富集分析結(jié)果圖

2.3 篩選與結(jié)腸癌預(yù)后相關(guān)的自噬基因

2.3.1 單因素COX分析 通過單因素COX分析，將自噬基因表達(dá)量與患者生存時(shí)間與生存狀態(tài)進(jìn)行聯(lián)合分析，以P<0.05作為閾值，篩選出與結(jié)腸癌患者預(yù)后相關(guān)的10個(gè)自噬基因，見表2。

表2 單因素COX回歸分析

2.3.2 多因素COX分析及模型構(gòu)建 利用多因素COX比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析，篩選出5個(gè)高風(fēng)險(xiǎn)自噬基因分別為WIPI2，RAB7A，ULK3，PELP1，DAPK1，見表3。HR值小于1的是WIPI2，ULK3，PELP1。HR值大于1的是RAB7A，DAPK1。利用篩選出5個(gè)高風(fēng)險(xiǎn)自噬基因構(gòu)建結(jié)腸癌預(yù)后COX風(fēng)險(xiǎn)回歸模型，見圖3?；貧w系數(shù)(Coef)分別為WIPI20.613249，RAB7A1.067329，ULK30.475059，PELP10.338861，DAPK10.298811。其中RAB7A基因?qū)Ρ灸Ｐ惋L(fēng)險(xiǎn)值的貢獻(xiàn)最大，其次是WIPI-2。

圖3 結(jié)腸癌預(yù)后COX風(fēng)險(xiǎn)回歸模型

表3 多因素COX回歸分析

2.4 結(jié)腸癌預(yù)后COX風(fēng)險(xiǎn)回歸模型驗(yàn)證 基于所構(gòu)建的預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)回歸模型，按照中位數(shù)將所有患者劃分為高低風(fēng)險(xiǎn)兩組，并繪制出生存曲線，見圖4A。紅線代表高風(fēng)險(xiǎn)組，藍(lán)線代表低風(fēng)險(xiǎn)組。結(jié)果顯示，高風(fēng)險(xiǎn)值患者生存率與低于低風(fēng)險(xiǎn)值患者，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。將風(fēng)險(xiǎn)值從低到高排序，繪制風(fēng)險(xiǎn)曲線、患者生存狀態(tài)以及模型基因表達(dá)量的熱圖(圖4B、C、D)。結(jié)果顯示，隨著風(fēng)險(xiǎn)值的升高，患者死亡比例升高。結(jié)腸癌預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)回歸模型中，自噬基因RAB7A的表達(dá)與風(fēng)險(xiǎn)值呈正相關(guān)，自噬基因WIPI2，ULK3，PELP1，DAPK1的表達(dá)與風(fēng)險(xiǎn)值呈負(fù)相關(guān)。

圖4 結(jié)腸癌預(yù)后COX風(fēng)險(xiǎn)回歸模型驗(yàn)證結(jié)果

2.5 本模型與臨床常見預(yù)后評估因素的比較 結(jié)合結(jié)腸癌臨床常見的預(yù)后評估因素，如患者年齡、性別、腫瘤分期、是否轉(zhuǎn)移等各項(xiàng)生存指標(biāo)，對本研究所構(gòu)建模型得到的患者風(fēng)險(xiǎn)值進(jìn)行單因素以及多因素的獨(dú)立預(yù)后分析。結(jié)果顯示，與臨床常見預(yù)后評估因素相比，本研究所構(gòu)建模型單因素分析HR值為1.464(P<0.001)，多因素分析HR值為1.377(P<0.001)，證明其可以作為獨(dú)立的預(yù)后因子，見圖5。

圖5 本模型與臨床常見預(yù)后評估因素的比較

2.6 結(jié)腸癌預(yù)后COX風(fēng)險(xiǎn)回歸模型臨床相關(guān)性分析 將本模型中自噬基因的表達(dá)量與患者的年齡，性別腫瘤分期，是否轉(zhuǎn)移等情況進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果顯示，RAB7A的表達(dá)量與結(jié)腸癌分期呈正相關(guān)，與患者年齡呈負(fù)相關(guān)；WIPI2與癌癥分期呈正相關(guān)。模型所得危險(xiǎn)因子與癌癥分期有相關(guān)性，見圖6。

圖6 結(jié)腸癌預(yù)后COX風(fēng)險(xiǎn)回歸模型與臨床相關(guān)性

2.7 人正常結(jié)腸細(xì)胞與人結(jié)腸癌細(xì)胞中WIPI2、RAB7A基因表達(dá)水平的變化 Real-time PCR檢測結(jié)果(圖7)顯示，與人正常結(jié)腸細(xì)胞NCM460相比，人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116、RKO中WIPI2、RAB7A基因的表達(dá)水平均升高，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖7 人正常結(jié)腸細(xì)胞與人結(jié)腸癌細(xì)胞中WIPI2、RAB7A基因表達(dá)水平的變化

3 討論

近年來，結(jié)腸癌的診斷與治療水平隨著直腸鏡技術(shù)的發(fā)展以及各種抗癌靶向藥物的研發(fā)有了長足的進(jìn)步[10]。根據(jù)加拿大癌癥協(xié)會(huì)的報(bào)道，結(jié)腸癌發(fā)病率位于全球惡性腫瘤中第3，死亡率位于第4[11-12]，相對于診斷與治療水平的較快發(fā)展，結(jié)腸癌預(yù)后的研究仍較為缺乏。最新研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸癌與自噬有著密切的關(guān)系[13-16]，使用免疫組化技術(shù)對結(jié)腸原發(fā)腫瘤進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)了分子伴侶介導(dǎo)自噬(CMA)水平的升高[17-18]，在結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116中，TP53的沉默會(huì)導(dǎo)致網(wǎng)狀吞噬和有絲分裂吞噬，起到保護(hù)腫瘤細(xì)胞的作用。現(xiàn)有研究表明，結(jié)腸腫瘤的形成與自噬過程降解片段極性蛋白(DVL)后導(dǎo)致WNT信號(hào)通路的異常激活有關(guān)[19]。以上研究均提示自噬相關(guān)信號(hào)通路的關(guān)鍵基因可能成為結(jié)腸癌診斷、治療以及預(yù)后的重要研究方向。目前，結(jié)腸癌預(yù)后的判斷主要是通過對腫瘤侵襲深度[20]、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[21]、血管浸潤[22]、血清癌胚抗原[23]等做出診斷。癌癥分期與轉(zhuǎn)移情況被普遍認(rèn)為是比較好的預(yù)后指標(biāo)，但仍然有特異性不高，鑒別困難等缺點(diǎn)。

本研究就自噬相關(guān)基因與結(jié)腸癌預(yù)后的關(guān)系進(jìn)行生物信息學(xué)分析，首先對比482例結(jié)腸癌腫瘤樣本與42例正常樣本的自噬基因表達(dá)，發(fā)現(xiàn)了35個(gè)差異表達(dá)的基因；再利用COX比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析，篩選出5個(gè)高風(fēng)險(xiǎn)自噬基因：WIPI2，RAB7A，ULK3，PELP1，DAPK1。利用這五個(gè)高風(fēng)險(xiǎn)自噬基因構(gòu)建結(jié)腸癌預(yù)后COX風(fēng)險(xiǎn)回歸模型可知：RAB7A基因?qū)Ρ灸Ｐ惋L(fēng)險(xiǎn)值的貢獻(xiàn)最大，其次是WIPI-2。RAB7A是Ras超家族中的一員，起到調(diào)節(jié)膜的轉(zhuǎn)運(yùn)和溶酶體的轉(zhuǎn)運(yùn)，以及調(diào)節(jié)生長受體的內(nèi)吞作用中吞噬體和自噬空泡的產(chǎn)生，轉(zhuǎn)運(yùn)，成熟過程[24-25]。RAB7A參與許多的細(xì)胞過程[26-28]，被稱為癌癥的先導(dǎo)角色[29]。研究表明，抑制RAB7A有效消除了結(jié)直腸癌干細(xì)胞，并且破壞了癌灶，提示RAB7A可作為結(jié)直腸癌靶向治療的新靶點(diǎn)[30]。WIPI2功能主要是作為自噬體形成的早期蛋白，輔助ATG12-ATG5-ATG16L1復(fù)合物的形成，調(diào)控新生自噬體膜伸長的過程[31]。

基于所得生存曲線(圖4A)可知，高風(fēng)險(xiǎn)組病人生存期較低風(fēng)險(xiǎn)組病人顯著縮短(P<0.05)，由風(fēng)險(xiǎn)值與病人生存狀態(tài)所得散點(diǎn)圖(圖4B)可知，風(fēng)險(xiǎn)值較高的病人，死亡比例明顯高于低風(fēng)險(xiǎn)值病人，并且隨著風(fēng)險(xiǎn)值的升高，參與構(gòu)建計(jì)算模型的自噬基因表達(dá)呈現(xiàn)出明顯的趨勢，說明模型構(gòu)建與實(shí)際病人生存狀況、基因表達(dá)狀況相符合。同時(shí)為了檢驗(yàn)本模型相較于傳統(tǒng)癌癥分期轉(zhuǎn)移等預(yù)后指標(biāo)的臨床意義，將常見患者臨床預(yù)后評估因素，與模型所得風(fēng)險(xiǎn)值進(jìn)行了單因素以及多因素的獨(dú)立預(yù)后分析。在單因素分析過程中，模型與腫瘤分期與病人預(yù)后均顯著相關(guān)，且均一性更好，誤差更??；在多因素獨(dú)立預(yù)后分析中，所構(gòu)建模型的預(yù)后預(yù)測作用顯著優(yōu)于其他臨床指標(biāo)，說明本模型可作為結(jié)腸癌獨(dú)立預(yù)后因子；構(gòu)建模型所使用的自噬基因的表達(dá)，多與癌癥分期有著顯著地相關(guān)性，提示其在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展過程中可能起到了重要作用，是潛在的結(jié)腸癌診斷以及治療靶點(diǎn)。對在本模型風(fēng)險(xiǎn)值貢獻(xiàn)最大的RAB7A基因及WIPI2基因在人正常結(jié)腸細(xì)胞(NCM460)與人結(jié)腸癌細(xì)胞(HCT116、RKO)中進(jìn)行Real-time PCR檢測其表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)RAB7A、WIPI2基因在結(jié)腸癌細(xì)胞(HCT116、RKO)中高表達(dá)，提示RAB7A、WIPI2基因可能還參與了結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展。

4 結(jié)論

本研究利用COX風(fēng)險(xiǎn)回歸模型構(gòu)建了基于自噬基因表達(dá)水平的結(jié)腸癌預(yù)后模型，該模型相對于傳統(tǒng)預(yù)后預(yù)測指標(biāo)更準(zhǔn)確穩(wěn)定，通過該模型篩選出的差異表達(dá)自噬相關(guān)基因可作為結(jié)腸癌預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因子，輔助臨床對結(jié)腸癌患者預(yù)后進(jìn)行更準(zhǔn)確的預(yù)測。