miRNA-141通過調(diào)節(jié)TLR4信號通路抑制大鼠血栓形成*

馮琦 徐超 孫明慧

(新疆醫(yī)科大學第五附屬醫(yī)院腎病科，新疆 烏魯木齊 830011)

血栓形成是影響心血管健康的重要原因，血小板被活化后發(fā)生黏附和聚集是動脈血栓形成的關(guān)鍵因素[1]。目前，針對血栓已有大量集中于微小RNA(miRNA)作為診斷和治療靶點的研究，并提出了有效的治療方法[2]，如外周血單個核細胞miR-483-3p聯(lián)合血漿D-二聚體檢測可作為診斷下肢深靜脈血栓的參考指標[3]。另外，血清miRNA-208與血小板活化密切相關(guān)，而且miRNA-208參與了血小板活化的調(diào)控[4]。研究表明血漿中循環(huán)的miRNA對血栓的診斷價值，并證實了它們與高凝性標志物的相關(guān)性[5]。Toll-like受體(TLR)是由10種不同的受體組成的家族，可識別病原體中的保守序列，主要受體被認為是Toll-like受體2(TLR2)和Toll-like受體4(TLR4)，其可誘導多種細胞因子的分泌并因此介導炎性反應[6]。多項研究已經(jīng)探明TLR4信號對血管疾病和血栓治療的重要性[7]。研究表明TLR4可被多種miRNA調(diào)控[8]。miR-141被發(fā)現(xiàn)可作為一種調(diào)節(jié)腫瘤血栓的潛在標志物[9]，與炎癥調(diào)節(jié)密切相關(guān)的miR-141對血栓的調(diào)節(jié)和對TLR4信號的調(diào)控作用較少[10]。通過本研究，我們建立血栓大鼠模型并基于TLR4信號通路旨在探明miR-141的表達對血栓形成的作用。

1 材料與方法

1.1 動物 SPF級別SD大鼠，雄性，體重178～231 g，購自新疆醫(yī)科大學實驗動物中心。本研究中涉及到的動物實驗均通過我院倫理委員會審批通過。

1.2 試劑 羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)購于美國亞什蘭BlanoseTM公司；阿司匹林購于上海復旦大學醫(yī)藥藥劑科；6-酮-前列腺素F1(6-keto-PGF1)試劑盒，購于軍事醫(yī)學科學院同位素室；cGMP試劑盒購于上海中醫(yī)藥大學同位素室；NO試劑盒購于南京建成生物工程研究所。pcDNA3.1-TLR4重組質(zhì)粒、miR-141的擬似物mimic、mimic的陰性對照(mimic-NC)均購買于上海吉瑪生物科技有限公司。TLR4的一抗(ab13556)，兔抗NF-κB(ab101898)，兔抗Rsc1(ab155938)，兔抗IL-1β(ab106035)和兔抗GAPDH(ab9485)，IgG二抗(ab6721)均購買于美國Abcam公司。電化學發(fā)光(ECL)試劑購于南京碧云天生物科技公司。

1.3 實驗分組和動物給藥 90只SD雄性大鼠隨機分組，其中10只為正常對照組；模型組使用5 g/L的CMC-Na建立大鼠動靜脈旁路血栓模型(20只)；治療組在CMC-Na基礎(chǔ)上分別靜脈注射100 mg/kg阿司匹林(Asp)作為陽性對照(10只)、miR-141的擬似物mimic(20只)、mimic陰性對照mimic-NC(10只)、mimic聯(lián)合Toll樣受體4(TLR4)過表達重組質(zhì)粒pcDNA3.1-TLR4(mimic+pcDNA3.1-TLR4)(20只)。藥物均用5 g/L的CMC-Na溶液制成混懸液，給藥體積為10 mL/kg，靜脈給藥，每日1次連續(xù)4周。

1.4 頸動靜脈旁路血栓模型 依據(jù)文獻建立頸動靜脈旁路血栓模型[11]。末次給藥1 h后，大鼠進行頸動靜脈旁路血栓形成實驗。將大鼠麻醉(戊巴比妥鈉30～40 mg/Kg，腹腔注射)，分離右頸總動脈及左頸外靜脈，在聚乙烯管中段放入一根長6 cm的絲線，以肝素生理鹽水溶液(50 Um/L)，充滿聚乙烯管。當聚乙烯管的一端插入左頸外靜脈后, 由聚乙烯管準確的注入肝素(50 μM/L)抗凝, 隨后再將聚乙烯管的另一端插入右頸總動脈，打開動脈夾，血液從右頸總動脈流至聚乙烯管，返回左頸外靜脈，開放血流15 min后中斷血流，迅速取出絲線稱重, 總重量減去絲線重量即得血栓重量。同時計算出血栓抑制率。血栓抑制率(%)=(模型血栓濕重-治療組血栓濕重)/模型組血栓濕重×100%[12]。

1.5 血漿中NO，cGMP，PGI2水平的測定 取頸動靜脈旁路血栓形成實驗中的大鼠，下腔靜脈取血1 mL，EDTA抗凝。按試劑盒說明采用放免法測定cGMP和PGI2，分光光度法測定NO。

1.6 體外血小板聚集實驗 取給藥大鼠，末次給藥1 h后麻醉大鼠，腹主動脈取血0.5 mL, 肝素(20 μM/L)抗凝，分離富血小板血漿(PRP)，將PRP中血小板數(shù)調(diào)整為3×1011/L, 用改良Born比濁法測定血小板聚集性。取200 μL PRP，37℃溫育5 min后，二磷酸腺苷組(ADP組)加入200 μmol/L的ADP 3 μL，mimic組為在血小板加入200 μmol/L ADP后并同時加入mimic，mimic-NC組為在血小板加入等量ADP并同時加入mimic-NC，加入記錄5 min血小板的聚集曲線[13]。聚集抑制率按下列公式計算：血小板聚集抑制率(%)=(模型組最大聚集率-治療組最大聚集率/模型最大聚集率)×100%[14]。

1.7 蛋白免疫印跡 將補充有液氮的大鼠靜脈組織研磨為粉末，隨后加入裂解緩沖液。4℃離心(1200 rpm)后，收集上清液。隨后通過Bradford分析鑒定蛋白質(zhì)濃度。隨后將提取的蛋白質(zhì)與2×上樣量與蛋白質(zhì)相同的上樣緩沖液充分混合。將混合物在100℃加熱5min后，使用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)將蛋白質(zhì)樣品(20 μg/泳道)電泳分離。隨后使用全濕法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，在室溫下，將PVDF膜在1×Tris緩沖液中用Tween 20孵育并密封45 min。兔抗TLR4的一抗(1∶1000)，兔抗NF-κB(1∶200)，兔抗Rsc1(1∶1000)，兔抗IL-1β(1∶2000)和兔抗GAPDH(1∶2500)加入到PVDF膜中，隨后在4℃下孵育過夜。在使用TBST清洗3次(每次5 min)后，在PVDF膜上添加辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG二抗(1∶2000)在室溫下孵育2小時。TBST漂洗(每次洗滌5min)3次，隨后使用增強的電化學發(fā)光(ECL)試劑(Beyotime Biotechnology，南京，中國)進行顯色。將GAPDH設(shè)置為內(nèi)參蛋白，目標條帶與內(nèi)參的灰度值之比代表蛋白的相對表達。

2 結(jié)果

2.1 miR-141對血栓模型的影響 miR-141的mimic組的血栓濕重與模型組比較明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。mimic組與模型組比較上調(diào)血漿中NO，PGI2水平(P<0.01和P<0.001)，mimic組提高血漿中cGMP水平(P<0.01)，差異均有統(tǒng)計學意義。陽性對照組的血栓濕重與模型組比較明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。陽性對照組與模型組比較上調(diào)血漿中NO，PGI2水平(P<0.05和P<0.05)，陽性對照組提高血漿中cGMP水平(P<0.01)，差異均有統(tǒng)計學意義。mimic與陽性對照組相比，mimic組的血栓濕重明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。mimic組上調(diào)血漿中NO，PGI2水平(P<0.05和P<0.05)，mimic組提高血漿中cGMP水平。差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1、2。

表1 miR-141對大鼠動靜脈旁路血栓的抑制作用

表2 miR-141對大鼠血漿中NO，PGI2，cGMP水平的影響

2.2 miR-141對體外血小板聚集的影響 過表達miR-141對血小板聚集的影響如表3所示，mimic組抑制由ADP誘導的血小板聚集，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表3。

表3 miR-141對ADP誘導的血小板凝聚的作用

2.3 miR-141對血栓模型大鼠頸靜脈組織中TLR4信號的影響 與模型組比，miR-141的mimic組TLR4(P<0.01)，NF-κB(P<0.01)，Rac1(P<0.01)，IL-1β(P<0.01)的表達水平明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義；與模型組比，陽性對照組TLR4(P>0.05)，NF-κB(P>0.05)，Rac1(P>0.05)，IL-1β(P>0.05)的表達水平差異，差異無統(tǒng)計學意義，見圖1。

2.4 過表達TLR4逆轉(zhuǎn)miR-141對血栓的抑制 與mimic組比，mimic+pcDNA3.1-TLR4組的TLR4(P<0.05)，NF-κB(P<0.05)，Rac1(P<0.05)，IL-1β(P<0.05)的表達水平明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義，見圖1；與mimic組比，mimic+pcDNA3.1-TLR4組的血栓濕重明顯增加(P<0.05)，差異有統(tǒng)計學意義。與mimic組比，mimic+pcDNA3.1-TLR4組血漿中NO，PGI2水平下調(diào)(P<0.05和P<0.05)，與mimic組比，mimic+pcDNA3.1-TLR4組的血漿中cGMP水平下調(diào)，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表4。

表4 過表達TLR4逆轉(zhuǎn)miR-141對血栓的抑制

圖1 蛋白免疫印跡法檢測miR-141對TLR4，NF-κB，Rac1，IL-1β的蛋白表達水平的影響

3 討論

血管旁路血栓的形成及其并發(fā)癥通常會增加住院患者的不良處境[15]。血栓形成發(fā)病機制涉及多種復雜因素，并且多種遺傳因素已被證明與頸動靜脈旁路血栓的形成和發(fā)展有關(guān)[16]。在我們的研究中，miR-141可以通過抑制TLR4信號通路來抑制抑制頸動靜脈旁路血栓的形成。

通過使用生物學預測網(wǎng)站microRNA.org的預測分析發(fā)現(xiàn)miR-141可能與TLR4具有靶向調(diào)節(jié)關(guān)系。研究表明，TLR4已被證實直接被miR-21靶向抑制[17]，并且miR-335通過調(diào)節(jié)TLR4介導患的靜脈血栓形成[18]。在先前的研究中，miR-141在3′UTR中靶向骨形成蛋白2并調(diào)節(jié)其表達，從而對成骨分化的調(diào)控[19]。而針對miR-141和TLR4之間關(guān)系的研究較少。

本研究發(fā)現(xiàn)miR-141下調(diào)頸動靜脈旁路血栓的形成大鼠TLR4信號通路相關(guān)基因(NF-κB，Rac1和IL-1β)的表達。TLRs包含一類蛋白質(zhì)，可以識別病原體相關(guān)分子模式(PAMPs)并激活宿主先天免疫的反應[20]，因此，多項研究聚焦于TLRs對癌和炎癥的調(diào)節(jié)機制[21]。多項研究結(jié)果一致表明，動脈粥樣硬化患者中TLR4的表達較高，而miR-146可以抑制動脈粥樣硬化患者中TLR4信號的激活以及血管炎性損傷[22]。事實證明，TLR信號可以被miRNA調(diào)節(jié)，例如，在Jiang等人的先前研究中，miR-26a通過靶向大鼠巨噬細胞中的TLR3自身來負向調(diào)節(jié)TLR3信號，從而減輕了類風濕性關(guān)節(jié)炎[23]。本研究同樣發(fā)現(xiàn)通過過表達miR-141，血栓大鼠血管組織中的TLR4表達顯著下調(diào)。而且通過恢復TLR4的表達，NF-κB，Rac1和IL-1β的表達被恢復的同時，miR-141對血栓多項相關(guān)指標也被明顯逆轉(zhuǎn)。在Schattner等人的研究中，TLR4是心血管疾病血栓形成的關(guān)鍵調(diào)節(jié)蛋白[24]。因此，TLR4誘導的血管細胞炎癥與血細胞的粘附相關(guān)，這可能是miR-141通過調(diào)節(jié)TLR4信號抑制血栓形成的關(guān)鍵機制。

此外，我們證明，與模型組相比，miR-141 mimic減少了血栓的濕重，但升高血漿中NO，PGI2，cGMP水平。血小板聚集在新的血栓形成中起重要作用[25]。血栓中較高的血小板數(shù)量可阻斷血液通暢性并誘導血栓形成[26]。而且最新的研究同樣表明miR-141能夠抑制細胞的增殖和粘附[27-28]。另外，我們的實驗不僅證實miR-141顯著地抑制大鼠頸動靜脈旁路血栓的形成，提高NO，cGMP，PGI2水平，抑制血小板聚集，而且發(fā)現(xiàn)miR-141 mimic的作用優(yōu)于阿司匹林。目前已知NO，cGMP，PGI2都與血栓的形成有關(guān)。NO作為一種信使分子，具有抗血小板聚集，抗血小板和血細胞粘附作用。其作用機制是經(jīng)NO/cGMP代謝通路，使血小板內(nèi)cGMP升高，通過cGMP的第二信使作用，調(diào)節(jié)收縮蛋白質(zhì)磷酸化水平，并使細胞內(nèi)Ca2+水平降低，抑制血小板的聚集從而減少血栓的形成[29]。前列環(huán)素(PGI2)在心血管系統(tǒng)中具有保護作用，它能擴張血管，抑制血小板聚集，并可拮抗性減少血栓素的含量，而后者是已知最強的血小板聚集劑。PGI2與TXA2的比值對于心血管系統(tǒng)生理功能的穩(wěn)定與調(diào)節(jié)至關(guān)重要[30-31]。本實驗證實，過表達miR-141可以同時升高NO，cGMP，PGI2水平，通過影響NO/cGMP代謝通路及改變PGI2的水平而抑制血小板聚集，發(fā)揮抑制血栓形成作用。我們的研究結(jié)果為以后血栓治療的靶向藥物開發(fā)提供了實驗依據(jù)。

4 結(jié)論

miR-141的過表達可以減少血栓形成，我們對機制研究表明，miR-141可通過抑制TLR4信號通路改善頸動靜脈旁路血栓的形成。