魯 琳 楊尚諭 劉維東 魯黎明*

（1. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)風(fēng)景園林學(xué)院，成都 611130；2. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，成都 611130）

植物在生長過程中，往往會遭遇到干旱、鹽堿、高溫以及冷害等不利環(huán)境的脅迫，從而生長發(fā)育受阻，對農(nóng)作物而言，則會導(dǎo)致產(chǎn)量的損失及品質(zhì)的下降［1～2］。其中，低溫冷害是影響農(nóng)業(yè)生產(chǎn)正常進行的最為關(guān)鍵的逆境之一。低溫會造成細胞嚴重脫水，當(dāng)胞間溶液結(jié)冰時，還會導(dǎo)致細胞的機械損傷，植物則表現(xiàn)出生長遲緩、萎蔫、弱苗，最終影響作物產(chǎn)量與品質(zhì)形成［3］。

在長期的進化過程中，植物形成了一套復(fù)雜的抵御冷害的機制。在冷害來臨時，植物會發(fā)生一系列生理生化變化，如細胞膜組成改變、物質(zhì)轉(zhuǎn)運活性增強、活性氧（ROS）清除加快及細胞質(zhì)保護物質(zhì)合成增加等，以適應(yīng)寒冷的環(huán)境，提高生存能力［4～6］。在此過程中，包含著大量的冷調(diào)節(jié)基因（Cold regulated gene，COR）表達水平的改變。在分子層面上，從植物感受到冷脅迫，到COR基因表達水平發(fā)生變化，蘊藏了復(fù)雜的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，構(gòu)成了植物耐冷機制的重要組成部分。

COR 是一大類基因，在植物的耐冷機制中扮演著十分重要的角色，參與了植物的代謝、蛋白質(zhì)合成、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、激素合成等諸多的生物學(xué)過程［4，7］，其中，就包含眾多的轉(zhuǎn)錄因子。研究表明，DREB/CBF 轉(zhuǎn)錄因子家族基因，是植物中普遍存在的參與耐冷調(diào)節(jié)的最為關(guān)鍵的因子［8～11］。擬南芥DREB1b 過表達植株表現(xiàn)出耐冷性增強［12～13］，而DREB1a、DREB1b 及DREB1c 三突變體植株，則顯示出對冷極度敏感［14］，表明這3 個基因?qū)M南芥的耐冷性至關(guān)重要。除此之外，其他轉(zhuǎn)錄因子也在植物的耐冷調(diào)節(jié)機制中占有重要的地位，例如，NAC 類轉(zhuǎn)錄因子TaNAC2［15］、AtLOV1［16］、SiNAC1［17］；WRKY 類 轉(zhuǎn) 錄 因 子AtWRKY34［18］、Os?WRKY45［19］、OsWRKY71［20］及CsWRKY46［21］；MYB 類轉(zhuǎn) 錄 因 子OsMYB4［22］；bZIP 類 轉(zhuǎn) 錄 因 子Os?bZIP52［23］；ZFPs 類 轉(zhuǎn) 錄 因 子 SCOF1［24］及GmZF1［25］等。

轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控是植物生命活動調(diào)節(jié)的重要調(diào)控形式，轉(zhuǎn)錄組測序則是了解植物基因總體表達情況的強大工具［26～27］。目前，高通量轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)已經(jīng)在植物響應(yīng)生物及非生物脅迫的機制研究中得到了廣泛的應(yīng)用［26，28～32］，一大批涉及防御、物質(zhì)運輸、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及次生代謝的基因得到鑒定，對于揭示植物抗逆的分子機制起到了很大的推動作用。

花煙草（Nicotiana alata）是屬于茄科（Solana?ceae）煙草屬（Nicotiana）的一年生野生草本植物，由于其花色艷麗多樣、花期較長，在園林綠化中得到了較多的應(yīng)用。然而，當(dāng)環(huán)境溫度低于15℃時，花煙草就不能夠正常開花。為了探索花煙草抵御低溫的機理，本研究采用轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-Seq）技術(shù)，在轉(zhuǎn)錄組水平上分析了花煙草響應(yīng)低溫脅迫的基因表達特性，以期為花煙草耐冷的分子機制的研究，及耐低溫花煙草品種的選育提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以花煙草（Nicotiana alata）為試驗材料，由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草實驗室提供。

1.2 材料處理及轉(zhuǎn)錄組測序

幼苗材料培養(yǎng)：挑選籽粒飽滿且大小一致的種子，用次氯酸鈉溶液表面消毒后，用無菌水清洗數(shù)次，隨后播種于MS 培養(yǎng)基上，并置于恒溫培養(yǎng)室中生長（光照：16 h光/8 h暗；溫度：25℃）。

低溫處理及總RNA 提取：待煙苗生長4 周后，挑選72 株長勢一致的煙苗，分為6 組，在光照培養(yǎng)箱中進行低溫（4℃）處理，每組煙苗為1個重復(fù)，每重復(fù)12 株煙苗。在處理后0 及12 h 后，分別進行整株取樣，并置于液氮中保存，用于總RNA 的提取?？俁NA 的提取參照魯黎明等［33］的方法進行。提取的總RNA，經(jīng)紫外分光光度計和瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后，送北京諾禾致源科技公司進行轉(zhuǎn)錄組測序。

1.3 測序數(shù)據(jù)的分析及功能注釋

植物樣品的測序，由諾禾致源公司采用Illu?mina Hi Seq2500 系統(tǒng)進行。對測序所獲得的原始數(shù)據(jù)，按照諾禾致源公司的數(shù)據(jù)處理方法，進行原始數(shù)據(jù)的過濾，獲得高質(zhì)量的clean reads，并進行后續(xù)的分析工作。

本研究采用無參轉(zhuǎn)錄組測序，因此，使用Trin?ity 軟件進行測序數(shù)據(jù)的拼接。然后，根據(jù)拼接的結(jié)果，進行基因表達豐度的定量分析。

通過BLASTX 軟件，與NCBI 的non-redundant（NR）、UniProt/ Swiss-Prot、Gene Ontology（GO）、KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Gnomes）等數(shù)據(jù)庫進行比對，以獲得其功能注釋信息。

1.4 差異基因的認定

差異表達基因（DEGs，differentially expressed genes）的篩選在低溫處理與對照的樣本間進行。篩選的條件為P-value≤0.01，|log2Fold Changes|>1。其中，F(xiàn)old Changes 代表不同處理之間基因表達量的比值。該值大于1 時，則該基因認定為上調(diào)表達，反之，則為下調(diào)表達。

1.5 差異表達基因的GO及KEGG富集分析

差異表達基因的GO 及KEGG 富集分析，根據(jù)葉興狀等［34］的方法，分別在GO 及KEGG 數(shù)據(jù)庫中進行。

1.6 差異表達基因的驗證

為了對轉(zhuǎn)錄組測序的結(jié)果進行驗證，隨機挑選6 個基因，并利用Primer 5.0 軟件設(shè)計擴增引物（見表1），采用qPCR的方法，對其表達水平進行驗證。將各個處理的樣品總RNA 反轉(zhuǎn)錄合成cD?NA，以此為模板，進行qPCR 反應(yīng)，內(nèi)參為β-actin。qPCR 的反應(yīng)體系、反應(yīng)程序以及基因相對表達量的計算，均參照魯黎明等［33］的方法進行。

2 結(jié)果與分析

2.1 測序質(zhì)量分析

采用高通量測序平臺，對低溫處理組及對照組的樣品進行了RNA 測序。結(jié)果顯示，共獲得了47 599 094～57 845 042 的clean reads（見表2）。就每個樣品的GC 含量來看，其含量在39.37%～43.03%，偏差很小，而且基本呈隨機分布。此外，測序的質(zhì)量還可以用質(zhì)量控制參數(shù)Q30 的數(shù)值的大小來判斷。一般要求該值不低于80%。在本研究中，Q30 的數(shù)值均大于89%，說明本次測序的質(zhì)量非?？煽浚ㄒ姳?）。樣品重復(fù)間數(shù)據(jù)之間的相關(guān)性，也是衡量測序質(zhì)量的重要指標(biāo)之一。本研究樣品重復(fù)間數(shù)據(jù)的相關(guān)性分析結(jié)果表明，重復(fù)之間的決定系數(shù)R2，最低為0.962，最高則達到了0.982，說明重復(fù)之間數(shù)據(jù)的重現(xiàn)性較好，可以進行下一步的分析。

表1 qPCR反應(yīng)所用引物Table 1 Primers used for qPCR

表2 各樣品測序質(zhì)量Table 2 Evaluation of sequence quality

2.2 差異表達基因統(tǒng)計分析

將低溫處理12 與0 h 樣品的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行對比分析，以|log2fold changes|≥1，以及P-value≤0.01 為篩選條件，進行差異表達基因的尋找。結(jié)果表明，低溫處理12 h 后，差異表達基因的數(shù)量達到了8 388 個，其中，上調(diào)表達4 229 個，下調(diào)表達4 159個。

2.3 差異表達基因的GO功能注釋分析

對差異基因所進行的GO 分析結(jié)果顯示（見表3），上調(diào)的差異表達基因的功能，主要集中在生物過程（Biological process）以及分子功能（Molecular function）方面。在生物過程中，Phosphate-contain?ing compound metabolic process（761，18.0%）及Phos?phorus metabolic process（761，18.0%）富集上調(diào)表達基因最多，其次為Macromolecule modification（683，16.2%）、Cellular protein modification process（634，15.0%）和Protein modification process（634，15.0%）。在分子功能中，Transferase activity（1 558，36.8%）富集上調(diào)表達基因最多，其次為Transferaseactivity，transferring phosphorus-containing groups（948，22.4%）與Kinase activity（638，15.1%）。

與上調(diào)差異表達基因不同，下調(diào)差異表達基因的功能主要集中在細胞組分（Cellular compo?nent）及分子功能（Molecular function）方面。細胞組分中，Ubiquitin ligase complex 占比最多（125，3%）；分子功能中涉及到的兩個GO 條目，均為泛素蛋白轉(zhuǎn)移酶活性相關(guān)，其占比均為3.1%（見表4）。

2.4 差異表達基因的KEGG通路分析

對差異表達基因進行了KEGG 通路分析，結(jié)果如圖2所示。

上調(diào)差異表達基因富集到20條主要的代謝通路。富集因子最高的為“Carbon fixation in photo?synthetic organisms”途徑，其次為“Carbon metabo?lism”和“Glycolysis/ Gluconeogenesis”途徑。而富集差異基因最多的途徑為“Metabolic pathways”，富集到了807 個差異表達基因，其次為“Biosynthesis of secondary metabolites”途徑，有458 個差異表達基因被富集到該途徑。

下調(diào)差異表達基因顯著富集的通路數(shù)量同樣是20 條，其中，富集因子最高的通路為“alpha-Lin?olenic acid metabolism”。在富集基因的數(shù)量方面，這20 條通路所富集差異表達基因的數(shù)量，較上調(diào)基因少了很多。富集下調(diào)差異基因最多的通路為“Protein processing in endoplasmic reticulum”，僅僅富集了89個基因。其次，為“Spliceosome”途徑，富集的差異表達基因數(shù)為74個。

從富集差異表達基因的數(shù)量角度也可以看出，低溫處理后，花煙草代謝途徑中，上調(diào)基因的數(shù)量遠遠高于下調(diào)基因。從而在某種程度上說明，花煙草在遭受低溫脅迫后，其生理響應(yīng)過程主要以上調(diào)相關(guān)基因的表達為主。

2.5 花煙草低溫響應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子分析

轉(zhuǎn)錄因子通過與基因上游啟動子區(qū)域的作用元件結(jié)合，調(diào)控基因的表達，從而影響到植物的生理進程。為了探索低溫脅迫下花煙草轉(zhuǎn)錄因子表達的變化，對差異表達基因中的轉(zhuǎn)錄因子進行分析。結(jié)果表明，在花煙草受到低溫脅迫后，共有118 個轉(zhuǎn)錄因子的表達發(fā)生了顯著改變，其中，上調(diào)表達82 個，下調(diào)表達36 個。這些轉(zhuǎn)錄因子屬于28 個家族，其中，數(shù)量最多的為NAC（19），其次為ERF（16）、MYB（15）、WRKY（15）等（見圖3）。

表3 上調(diào)差異表達基因的GO功能注釋分析Table 3 Go functional annotation analysis of up regulated differentially expressed genes

表4 下調(diào)差異表達基因的GO功能注釋分析Table 4 Go functional annotation analysis of down regulated differentially expressed genes

2.6 qRT-PCR 驗證

為了驗證RNA 測序結(jié)果的可靠性，隨機選取了IAA17、NAC2、P450、WRKY6、CIPK6、ERF025 等6 個基因，進行了qPCR 擴增，計算了其表達量，然后，與其測序結(jié)果進行對比（見圖4）。從圖4 可以看出，在所選擇的6 個基因中，除了P450 外，其余4 個基因的表達趨勢，兩種方法均表現(xiàn)一致，從而說明了本研究RNA 測序結(jié)果較為可靠，同時也表明，對RNA 測序結(jié)果所做的相關(guān)分析較為客觀。

3 討論

低溫是植物在生長過程中所遭受到的主要的環(huán)境脅迫之一。在低溫脅迫下，植物體內(nèi)會發(fā)生一系列生理生化變化，以抵御低溫對植物生長的影響。其中，轉(zhuǎn)錄因子能夠通過調(diào)控下游基因的表達，調(diào)動相關(guān)代謝途徑產(chǎn)生級聯(lián)反應(yīng)，從而提高植物對低溫的適應(yīng)能力［35］。在本研究中，花煙草在低溫刺激下，有28 個家族的118 個轉(zhuǎn)錄因子的表達發(fā)生了顯著變化，表明低溫導(dǎo)致了花煙草眾多的生理進程發(fā)生改變。

3.1 NAC 家族轉(zhuǎn)錄因子

NAC 轉(zhuǎn)錄因子家族是植物最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，其名稱來源于NAM、ATAF1/2 及CUC2 的首字母縮寫。在結(jié)構(gòu)上，NAC 家族轉(zhuǎn)錄因子N 端結(jié)構(gòu)域較為保守，而其C 端的轉(zhuǎn)錄激活域，則由不同的相對保守區(qū)域構(gòu)成。這些結(jié)構(gòu)上的特點，使得NAC 轉(zhuǎn)錄因子的功能多樣，廣泛參與了植物的生長發(fā)育及非生物脅迫過程［36］。NAC 轉(zhuǎn)錄因子的啟動子區(qū)域，包含有低溫響應(yīng)元件，表明其參與了植物低溫的脅迫響應(yīng)［36］。研究表明，小麥TaNAC2［15］、番茄SINAC1［17］、番茄SINAM1［37］等基因的過表達，均提高了轉(zhuǎn)基因植物抵御低溫的能力。此外，香蕉的MaNAC1 能夠通過調(diào)控ICE1-CBF 信號途徑，從而增強香蕉的抗冷性［38］；而蘋果的Md?NAC029 則通過抑制MdCBF1 和MdCBF4 的表達，負調(diào)控蘋果的耐寒性［39］。本研究中，花煙草在低溫脅迫下，17 個NAC 轉(zhuǎn)錄因子的表達顯著改變，其中，包括12 個上調(diào)表達，7 個下調(diào)表達（見圖3）。由此說明，花煙草NAC 轉(zhuǎn)錄因子參與低溫響應(yīng)調(diào)控時，可能存在正向與負向兩種方式，其中，具有正向調(diào)節(jié)作用轉(zhuǎn)錄因子占多數(shù)。

3.2 ERF 家族轉(zhuǎn)錄因子

AP2/ERF 轉(zhuǎn)錄因子家族在植物中廣泛存在，分為AP2、RAV、ERF和DREB 4個亞類，其中，ERF和DREB 在AP2/ERF 轉(zhuǎn)錄因子家族中占有最重要的地位。研究證實，ERF 轉(zhuǎn)錄因子通過結(jié)合下游基因啟動子上的GCC 盒（GCCGCC），從而調(diào)控其表達［35］。在植物中，DREB/CBF途徑是關(guān)鍵的低溫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與調(diào)節(jié)響應(yīng)途徑，其中，ICE-CBF 途徑又是DREB/CBF 反應(yīng)途徑中的關(guān)鍵一環(huán)［40］。當(dāng)?shù)蜏孛{迫來臨時，ICE 與CBF 啟動子區(qū)域的MYC 元件（CACATG）相結(jié)合，上調(diào)CBF 基因的表達；而CBF則結(jié)合低溫響應(yīng)基因的順式作用元件，增強這些基因的轉(zhuǎn)錄，從而改善相應(yīng)的生理活動，以適應(yīng)低溫環(huán)境［40］。研究發(fā)現(xiàn)，番茄TERF2 和LeERF2［41］、草 地 禾PpCBF3［42］、麻 風(fēng) 樹JcCBF2［43］、小 麥TaDREB2 和TaDREB3［44］及水稻OsDREB6［45］的 過表達植株的耐寒性均得到增強。本研究的結(jié)果也顯示，花煙草ERF 轉(zhuǎn)錄因子對低溫環(huán)境有顯著響應(yīng)，其中，有13 個上調(diào)表達，3 個下調(diào)表達（見圖3）。在以往的研究中，ERF 類轉(zhuǎn)錄因子下調(diào)響應(yīng)低溫脅迫還鮮有報道。所以，本研究的結(jié)果既說明了植物響應(yīng)低溫脅迫的機制的復(fù)雜性，也為其研究提供了有益的線索。

3.3 MYB 家族轉(zhuǎn)錄因子

在植物的轉(zhuǎn)錄因子家族中，MYB 是較大的一類，包含的成員數(shù)量最多。MYB 名稱來源于其保守的DNA 結(jié)合域，其所結(jié)合的調(diào)控基因的順式作用元件為TAACTG。研究表明，MYB 轉(zhuǎn)錄因子參與了植物的低溫響應(yīng)調(diào)控過程，但是，不同的MYB成員所起的作用并不相同［35］。例如，過表達Os?MYB4 的擬南芥［46］、過表達MdSIMYB1 的煙草對低溫脅迫的耐受力均增強［47］。此外，梨PcMYB10 對低溫下花青素的合成有正向作用［48］。然而，擬南芥的AtMYBC1［49］以及MYB15［50］卻負向調(diào)控植物的低溫耐受性。本研究也得出了類似的結(jié)果，在低溫脅迫下，花煙草11 個MYB 基因的表達顯著增強，有4 個則顯著下調(diào)（見圖3）。這些結(jié)果暗示，MYB 轉(zhuǎn)錄因子廣泛參與了植物的低溫脅迫響應(yīng)，其成員間發(fā)揮作用的機制并不相同。

3.4 WRKY 家族轉(zhuǎn)錄因子

在高等植物中，WRKY 轉(zhuǎn)錄因子家族是最大的一類，其所結(jié)合的靶基因的作用元件為TGAC?CA/T（W-BOX）。據(jù)報道，WRKY 轉(zhuǎn)錄因子通常抑制下游靶基因的表達，例如，低溫處理后擬南芥AtWRKY34 上調(diào)表達，并負向調(diào)控擬南芥成熟花粉的低溫敏感性［18］。與此相反，黃瓜的CsWRKY46則是一個植物耐寒性提升的正向調(diào)節(jié)因子，其在擬南芥的過表達提高了轉(zhuǎn)基因植株的低溫耐受性［21］。與此相類似，花煙草在低溫環(huán)境下有11 個WRKY上調(diào)表達，4個下調(diào)表達（見圖3），說明在花煙草的低溫脅迫響應(yīng)中，WRKY 轉(zhuǎn)錄因子可能也起著十分重要的作用，其作用的機制有待于進一步的探索。

3.5 GATA 家族轉(zhuǎn)錄因子

植物GATA 轉(zhuǎn)錄因子也是一類較為重要的轉(zhuǎn)錄因子，在植物礦質(zhì)營養(yǎng)、形態(tài)建成、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)以及花器官發(fā)育等生理生化過程中占有重要地位，其名稱源自其特異結(jié)合的元件WGATAR（W 為T或A，R 為G 或A）［51］。GATA 轉(zhuǎn)錄因子參與植物冷脅迫的報道較少，僅有的研究表明，擬南芥的兩個GATA 轉(zhuǎn)錄因子GNC 和GNL，能夠與SOC1 相互作用，從而正向促進擬南芥低溫耐受能力［52］。此外，班巴拉花生（Vigna subterranea）的GATA9［53］以及構(gòu)樹（Broussonetia papyrifera）的GATA 類部分轉(zhuǎn)錄因子也參與了植物的低溫脅迫響應(yīng)［54］。本研究的結(jié)果也證實了前人的研究結(jié)論，花煙草有8 個GATA類轉(zhuǎn)錄因子參與了低溫脅迫的響應(yīng)（見圖3）。然后，有所不同的是，這8 個GATA 中，有7 個是下調(diào)表達，只有1個上調(diào)表達。這種現(xiàn)象在一定程度上說明，花煙草GATA 轉(zhuǎn)錄因子參與低溫脅迫響應(yīng)的方式，具有其獨特的特性。

3.6 bHLH 家族轉(zhuǎn)錄因子

bHLH 轉(zhuǎn)錄因子家族，在高等植物轉(zhuǎn)錄因子家族中位列第二位，其名稱來自于其bHLH 結(jié)構(gòu)域。該結(jié)構(gòu)域十分保守，由大概60個氨基酸所構(gòu)成，包含了堿性區(qū)域和螺旋—環(huán)—螺旋結(jié)構(gòu)域兩個功能完全不同的區(qū)域［55］。與植物的其他轉(zhuǎn)錄因子類似，植物的bHLH 轉(zhuǎn)錄因子參與了信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、物質(zhì)合成、腺毛和根毛發(fā)育及逆境脅迫等［56］。bHLH 轉(zhuǎn)錄因子的一個重要的功能，是通過植物中普遍存在的ICE1-CBF 冷響應(yīng)通路，參與植物對低溫脅迫的信號感應(yīng)及信號傳遞。擬南芥ICE1 與ICE2 均能夠激活CBF1 的表達，通過調(diào)控下游更多的冷響應(yīng)表達，提高其對低溫脅迫的適應(yīng)能力［55］。水稻的OsICE1 和OsICE2［10］、白菜的BrICE1［57］、野生葡萄 的VabHLH1 以 及VvbHLH1［58］均 與 擬 南 芥 的ICE1有著相似的作用與功能。花煙草可能也存在著類似的響應(yīng)途徑。在冷脅迫下，有6 個bHLH 的表達產(chǎn)生了明顯的響應(yīng)，其中，有4 個上調(diào)表達，2個下調(diào)表達。一般來說，bHLH 的過量表達能夠提高植物的低溫耐受能力。然而，bHLH 如何以負調(diào)控的方式參與低溫脅迫響應(yīng)，目前還不清楚。這種現(xiàn)象一方面說明冷脅迫響應(yīng)在植物中存在的普遍性，另一方面也表明了花煙草冷脅迫響應(yīng)的特殊性與復(fù)雜性。