任夢軒 張 洋 王 爽 王瑞琪 劉 聰 魏志剛

（1. 林木遺傳育種國家重點實驗室，東北林業(yè)大學，哈爾濱 150040；2. 國家林業(yè)與草原局鹽堿地研究中心，中國林業(yè)科學研究院，北京 100091）

轉錄因子在植物生長發(fā)育以及應對環(huán)境變化中發(fā)揮極為重要的作用［1］。研究表明，植物基因組有6%～10%基因編碼產(chǎn)物為轉錄因子，主要包括AP2/ERF、ARF、bZIP/HD-ZIP、C2H2、GRAS、MYB/MYC、WRKY、bHLH、NAC 和GATA 等家族［2］。如擬南芥（Arabidopsis thaliana）具有34 個轉錄因子基因家族，共有1 533 基因，其中約45%的轉錄因子屬于植物特有的［3］。

1988 年，Evans 等［4］首次報道（T/A）GATA（A/G）序列是在雞的珠蛋白基因啟動子上，1991 年發(fā)現(xiàn)了轉錄因子GATA-1。隨后，又鑒定出GATA-2、GATA-3、GATA-4、GATA-5 和GATA-6 等基因，由此形成了GATA 轉錄因子家族［5］。隨后，在植物中也鑒定出一批能結合WGATAR 序列（W 為T 或A；R為G或A）的轉錄因子，且大多含有1個CX2CX18CX2C結構域，有些成員則含有一個CX2CX20CX2C結構域或編碼一個2 鋅指結構域［6～7］。目前為止，已先后對擬 南芥［7］、蓖麻（Ricinus communis L.）［8］、蘋 果（Malus domestica）［9］、水稻（Oryza sativa L.）［10］、番茄（Solanum lycopersicum）［11］和辣椒（Capsicum annu?um L.）［12］等植物的GATA 家族成員進行了全基因水平的鑒定。如擬南芥GATA 基因家族包含30 個基因，可分成4 個亞族，并且在光響應調控和葉綠素合成［13～16］、細胞分裂素響應［17～18］、花發(fā)育［19］和種子萌發(fā)［20］等多個生物學過程扮演著重要角色。

毛果楊（Populus trichocarp）是第一個全基因測序并注釋的木本植物，并且具有相對較小的基因組（422.9 Mb）、廣泛的適應性、容易的轉基因操作和較高生長速率等特點，因此其已成為研究木本植物復雜性狀形成分子機制、基因功能解析、比較基因組學等分子生物學與分子遺傳學研究中的模式物種［21］。研究表明，毛果楊基因組含有58 個轉錄因子基因家族，共有4 287 個轉錄因子基因［22］。然而，目前為止，尚無有關毛果楊GATA 轉錄因子家族基因基本特性的分析報導。為此，本項研究從基因組水平對毛果楊GATA 基因家族的基因與編碼蛋白的基本特性，以及各基因的組織與鹽脅迫響應表達特性進行初步研究。上述工作將對毛果楊GATA 家族各基因在其生長發(fā)育與鹽脅迫響應中的生物學功能解析奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 植物材料

毛果楊材料來源于林木遺傳育種國家重點實驗室（東北林業(yè)大學）溫室（長日照16/8 h、25 土2℃）培養(yǎng)的3 個月大小的植株。選擇生長良好且長勢一致的植株平均分為兩組，一組為處理組（200 mmol·L-1NaCl 處理48 h），另一組為對照組（野生型）。上午10：00，對兩組材料的初生莖節(jié)（1～2 莖節(jié)）、過渡莖節(jié)（3～4 莖節(jié)）和次生莖節(jié)（5～8莖節(jié)）進行取樣，每個樣品3次生物學重復。

隨后，用錫箔紙封好迅速放入液氮速凍，-80℃保存，用于后續(xù)RNA 提取，以作為GATA 基因家族組織表達特異性實驗材料。

1.2 毛果楊GATA轉錄因子家族成員鑒定

從植物轉錄因子數(shù)據(jù)庫（http：//planttfdb.cbi.pku.edu.cn/）下載的擬南芥GATA 家族各基因編碼的氨基酸序列。利用HMMER 軟件（http：//www.ebi.ac.uk/Tools/hmmer/）和SMART軟件對基因組數(shù)據(jù)庫進行搜索，從而鑒定出39個候選基因。

1.3 毛果楊GATA 轉錄因子家族染色體定位分析

利用Phytozome 數(shù)據(jù)庫（https：//phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）獲得染色體位置，通過軟件MapInspect（http：//www.plant- breeding.wur.nl/UK）［23］來制作染色體定位圖。

1.4 毛果楊GATA轉錄因子家族的進化分析

運用BioEdit 軟件對擬南芥、毛果楊的GATA氨基酸序列進行多序列比對，然后通過進化樹軟件MEGA6.0，運用相鄰連接法（neighbor joining），執(zhí)行參數(shù)為Poission correction、pairwise deletion 和bootstrap 1 000 次重復［23］，構建毛果楊和擬南芥的系統(tǒng)進化樹。

1.5 毛果楊GATA 轉錄因子家族基因結構的分析

基因內(nèi)含子和外顯子模式圖用GSDS 網(wǎng)站繪制，內(nèi)含子外顯子信息下載于植物轉錄因子數(shù)據(jù)庫（http：//planttfdb.cbi.pku.edu.cn/）和SGN（https：//solgenomics.net/）［23］。

1.6 毛果楊GATA轉錄因子家族保守原件分析

通過在線軟件MEME（http：//meme-suite.org/）預測蛋白保守基序［23］。

1.7 毛果楊GATA轉錄因子家族保守結構域分析

利用序列分析軟件BioEdit 分析蛋白保守域序列［23］。

1.8 毛果楊GATA 基因qRT-PCR分析

根據(jù)毛果楊GATA 家族各基因序列設計特異定量引物（見表1），利用CTAB 法提取總RNA，反轉錄得到cDNA 為模板，進行實時定量RT-PCR 分析。體系如下：2×TransStart?TOP/Tip Green qPCR Supermix 10 μL、PtrIDP1-QF/QR 混合引物（10.0 μmol·L-1）0.4 μL、cDNA 1.5 μL，Passive Reference Dye（50x）0.4 μL，加ddH2O 至20 μL。PCR 反應程序如下：94℃30 s；94℃5 s，60℃15 s，72℃35 s，40次循環(huán)；95℃15 s，60℃1 min，95℃30 s。每個樣品進行3 次生物學重復，利用2-△△CT法進行數(shù)據(jù)處理。

表1 毛果楊GATA家族基因qRT-PCR的引物Table 1 Primers for quantitative real-time PCR of P.trichocarpa GATA family

續(xù)表1 Continued table 1

2 結果分析

2.1 PtrGATA 家族成員基本信息及其在染色體上的分布

利用擬南芥中已鑒定的30 個GATA 基因編碼氨基酸序列在毛果楊基因組數(shù)據(jù)庫中同源比對篩選到39 個PtrGATA 基因，根據(jù)擬南芥直系同源基因對應分別命名為PtrGATA1.1-PtrGATA19.1。PtrGATA 家族各成員基因及其編碼蛋白的基本信息分析表明，各成員CDs 長度變化范圍內(nèi)402～1 659 bp，編碼蛋白的氨基酸序列長度為133～552 aa、分子量為12 867.23～61 305.85 Da、等電點4.87～9.77（見表2）。上述結果表明，PtrGATA 家族基因及其編碼蛋白基本特性存在較大變化，預示家族各成員的生物學功能可能也產(chǎn)生了分化。

表2 毛果楊GATA家族各基因概況Table 2 Summary of GATA genes in P.trichocarpa

基于PtrGATA家族成員基因組的基本信息，我們對PtrGATA 家族成員在毛果楊染色體上的分布情況進行了分析，結果（見表2，圖1）表明，PtrGATA家族在19 條染色體呈不均勻分布，其中5 號染色體上分布了6 個PtrGATA 基因；2 號和7 號染色體均分布4 個PtrGATA 基因；1 號、3 號和10 號染色體上分布了3 個PtrGATA 基因；4 號、6 號、8 號、14 號、17 號和18 號染色體各分布2 個PtrGATA 基因；9 號和19 號染色體各自分布一個基因；11 號、12 號、15號和16 號染色體上無PtrGATA 分布。上述結果表明，毛果楊中PtrGATA基因的擴增模式為分散復制與片段復制。

2.2 毛果楊PtrGATA家族的系統(tǒng)進化

構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹將基因分類對于基因家族各成員功能預測與相互關系分析極為重要。由于擬南芥GATA 家族各基因研究較多，因此本項研究將結合擬南芥GATA 家族進化信息對毛果楊初步分析。為此，利用MEGA 6.0 軟件制作了69 個GATA 轉錄因子的蛋白序列（毛果楊39 個，擬南芥中30 個）進化樹，如圖2 所示，毛果楊39 個GATA基因分成4 個亞族，其中亞族Ⅰ包含為：PtrGA?TA1.1、 PtrGATA1.3、 PtrGATA2.3、 PtrGATA3.2、PtrGATA4.1、PtrGATA4.2、PtrGATA5.2、PtrGATA5.3、PtrGATA6.2、PtrGATA7.1、PtrGATA8.1、PtrGATA9.1、PtrGATA10.2、PtrGATA13.1、PtrGATA14.1、PtrGA?TA18.1、PtrGATA19.1 和PtrGATAT.1；亞 族Ⅱ為：PtrGATA2.4、PtrGATA3.3、PtrGATA5.1、PtrGATA5.4、PtrGATA6.1、PtrGATA7.2、PtrGATA8.2、PtrGATA10.1、PtrGATA14.2 和PtrGATA18.2；亞 族Ⅲ為：PtrGA?TA2.1、PtrGATA2.2、PtrGATA5.5、PtrGATA5.6、PtrGA?TA7.3、PtrGATA7.4、PtrGATA10.3、PtrGATA17.1 和PtrGATA17.2；亞族Ⅳ：PtrGATA1.2 和PtrGATA3.1。毛果楊GATA 家族成員被分成了4 個亞家族和擬南芥一致［8］，且各亞族同源性較高，暗示著毛果楊和擬南芥的直系同源基因具有相似功能。

2.3 毛果楊GATA 轉錄因子家族基因結構和保守基序的分析

為進一步分析毛果楊GATA 家族各基因結構及其編碼蛋白的特征，我們利用在線軟件MEME預測了毛果楊39 個GATA 轉錄因子的保守基序（見圖3A），參數(shù)設置為：保守基序最佳匹配長度為6～100，保守基序個數(shù)為10，其他參數(shù)設置為默認。利用在線網(wǎng)站GSDS繪制毛果楊GATA 轉錄因子家族基因結構示意圖（見圖3B）。毛果楊GATA家族不同亞族基序分布如下：亞族中毛果楊GATA轉錄因子具有相似的保守基序（見圖3A），比如在Ⅰ亞族中，除了含有特有的Motif 1 基序，還含有Motif 2、Motif 4、Motif 6 和Motif 9 基序。在Ⅳ亞族中，除了含有Motif 1 基序之外，還含有Motif 3、Mo?tif 5 基序。這說明不同亞族中蛋白基序的不同可能是其功能的分化的原因或動力。同時，在相同亞族中GATA 轉錄因子相似的保守基序表明其含有相似的功能；內(nèi)含子-外顯子結構圖是基于毛果楊GATA 的CDS 序列和DNA 序列之間的關系，毛果楊GATA 基因從1 個外顯子（PtrGATA17.2）到11個外顯子（PtrGATA7.4）的結構變化，毛果楊第Ⅰ亞族中每個基因的內(nèi)含子平均個數(shù)是最少的（2.3個），在Ⅳ亞族中最多（8 個）。在同一亞族家族成員中，內(nèi)含子個數(shù)差異不大，且在同一亞族中具有相似的結構，在結構上的變化暗示著其基因組可能在進化過程中出現(xiàn)了變化（見圖3B）。

2.4 毛果楊GATA 轉錄因子家族保守結構域分析

為了進一步分析39 個毛果楊GATA 轉錄因子蛋白序列的結構，我們使用DNAMAN 進行了氨基酸序列比對。序列比對結果表明（見圖4）：大多數(shù)毛果楊GATA 轉錄因子都包含C-X2-C-X17-20-CX2-C鋅指結構域，其中第Ⅰ、第Ⅱ和第Ⅲ亞族的鋅指結構域為C-X2-C-X18-C-X2-C，第Ⅲ亞族的鋅指結構域為C-X2-C-X20-C-X2-C，沒有發(fā)現(xiàn)C-X2-CX17-C-X2-C 鋅指結構域。其中第Ⅲ亞族的PtrGA?TA7.3 無C-X2，沒有完整的保守結構域；第Ⅵ亞族的PtrGATA1.2 和PtrGATA3.1 無C-X2-C-X20-C-X2-C，沒有保守結構域，可能是在進化上發(fā)生了變化。該序列特征與在擬南芥中的研究一致。另外，毛果楊GATA 鋅指結構域的大部分氨基酸位點是高度保守的。亞族與亞族之間的氨基酸位點也是較為保守，例如，Cys-3、Cys-6、Thr-13、Pro-14、Gly-19和Pro-20，以及第二個半胱氨酸對的側翼序列（LCNACG）。分析發(fā)現(xiàn)，該家族在整體上具有較強的保守性?？梢钥闯觯麠頟trGATA1.2 和PtrGATA3.1 這2 個成員與其他37 個成員在保守性上有一定差異，親緣關系較其他成員較遠，表明這些成員在進化演變中在保守域上發(fā)生了一定的改變。

2.5 毛果楊GATA 基因家族組織表達特異性分析

為了研究GATA 家族各基因在毛果楊不同組織的功能，我們利用MeV 軟件對phytozome 網(wǎng)站中39 個GATA 基因在各個組織中的表達量繪制色溫圖并進行分析，結果（見圖5）表明，39 個GATA 基因在各組織表達量存在差異，如除PtrGATA5.2 在各個組織中表達量都較低外，其余38 個基因在檢測的組織中均有較明顯的表達。大部分基因的表達具有組織特異性，如第Ⅰ亞族、第Ⅲ亞族和第Ⅵ亞族中個各家族成員均在莖部相對表達量較高，暗示了同一亞族親緣關系可能比較相近，在植物生長過程中發(fā)揮的功能相似；第Ⅱ亞族中各家族成員基因組織偏愛性表達明顯在葉部，相比較其他組織部位，葉部表達量較高。特別是PtrGA?TA8.2、PtrGATA14.2和PtrGATA18.2三個基因，大量文獻報道GATA 家族轉錄因子參與了光相關的調節(jié)過程，而葉片是植物進行光合作用以及光應激的主要器官，暗示著第Ⅱ亞族中的基因可能參與了光相關的調節(jié)，如光響應調控和葉綠素合成。

2.6 鹽處理對毛果楊GATA 家族基因在各莖節(jié)表達的影響

為了研究PtrGATA 家族各基因是否在鹽脅迫中具有一定的生物學功能，我們利用qRT-PCR 檢測了各基因在鹽脅迫下不同發(fā)育莖段中的表達變化情況，結果（見圖6A）表明，PtrGATA5.1、PtrGA?TA5.2、PtrGATA7.2、PtrGATA10.2、PtrGATA17.1 和PtrGATA17.2 基因脅迫處理后表達量無明顯變化；PtrGATA1.1、PtrGATA1.2、PtrGATA2.3、PtrGATA2.4、PtrGATA3.1、PtrGATA3.3、PtrGATA6.1、PtrGATA7.3和PtrGATA14.1 基因脅迫處理后表達量變化較?。籔trGATA4.1、PtrGATA5.4、PtrGATA5.6、PtrGATA9.1、PtrGATA10.1、 PtrGATA10.3、 PtrGATA19.1 和PtrGATAT.1 基因脅迫處理后在初生莖節(jié)表達量明顯變化，其中PtrGATA10.1 表達量變化最為明顯，是對照的6.4 倍（見圖6B）；PtrGATA1.3、PtrGA?TA2.2、PtrGATA3.2、PtrGATA4.2、PtrGATA5.5、PtrGA?TA6.2、PtrGATA8.1、PtrGATA8.2、PtrGATA13.1、PtrGA?TA14.2、PtrGATA18.1和PtrGATA18.2基因脅迫處理后在過渡莖節(jié)表達量明顯變化，其中PtrGATA18.1鹽脅迫處理后在莖部整體表達量變化最為明顯，過度莖節(jié)最明顯，是對照的35.6 倍（見圖6C）；PtrGATA2.1、PtrGATA5.3、PtrGATA7.1和PtrGATA7.4基因脅迫處理后在次生莖節(jié)表達量明顯變化，其中PtrGATA5.3 表達量變化最為明顯，是對照的18.2 倍（見圖6D）。表明毛果楊GATA 基因可能通過復雜的機制參與植物鹽脅迫適應過程。

3 討論

隨著植物基因組研究的深入，利用生物信息學技術，通過廣泛的基因家族分析，奠定基因功能研究的基礎，成為現(xiàn)今基因功能研究的熱點。研究植物基因家族中基因的分布、基因結構與表達分析，對進一步研究其在植物生長發(fā)育及抗性響應中的功能具有重要意義。GATA 轉錄因子是一類廣泛存在于真核生物中的轉錄因子，具有特殊的鋅指結構，根據(jù)前人對擬南芥［7］、蓖麻［8］、蘋果［9］、水稻［10］、番茄［11］和辣椒［12］等植物的研究發(fā)現(xiàn)，除水稻分為7 個亞族外，其他均分成4 個亞族，在光響應調控和葉綠素合成［13～16］、細胞分裂素響應［17～18］、花發(fā)育［19］和種子萌發(fā)［20］等多個生物學過程中扮演著重要角色。GATA 家族的大部分氨基酸位點在大部分成員中是高度保守的，這與本研究中毛果楊GATA 轉錄因子的家族成員的保守性，基本相符。

本研究對毛果楊GATA 家族39 個轉錄因子進行了系統(tǒng)的生物信息學分析。染色體定位分析表明，毛果楊GATA 轉錄因子不均勻的分布在15 條染色體上。根據(jù)系統(tǒng)進化樹分析，毛果楊GATA 家族成員被分成了4 個亞家族，這一點與擬南芥［7］相同，可根據(jù)擬南芥各亞族GATA 基因功能來推測毛果楊相應GATA 基因的功能?；蚪Y構和保守基序分析結果表明，在同一亞族的GATA 基因含有同類型的蛋白保守基序和相同數(shù)量的內(nèi)含子，表明同一亞組的基因可能具有相似的功能和結構，而不同亞家族間存在的差異可能是進化中發(fā)生變化導致的。保守結構域分析發(fā)現(xiàn)，毛果楊GATA 家族在整體上具有較強的保守性，除了第Ⅳ亞家族外，其他亞族都含有共同的保守區(qū)域。組織表達特異性分析表明，第Ⅰ亞族、第Ⅲ亞族和第Ⅵ亞族中各個家族成員均在莖部相對表達量較高，第Ⅱ亞族中各家族成員基因組織偏愛性表達明顯在葉部，說明同一亞族親緣關系可能比較相近，在植物生長過程中發(fā)揮的功能可能相似。此外，GATA 基因在植物中普遍表達，在細胞的發(fā)育分化、生長增殖和分解凋亡等許多重要的生長發(fā)育過程中扮演著重要的角色。已有研究表明，一些與逆境相關的鋅指蛋白基因，具有對植物的抗逆性調控的功能［24～26］。通過鹽脅迫處理發(fā)現(xiàn)，GATA 基因家族成員在不同發(fā)育階段的莖部表達存在明顯差異；同時鹽脅迫處理后，大部分基因表達量變化顯著，其中PtrGATA10.1、PtrGATA18.1和PtrGATA5.3分別在鹽脅迫后的初生莖節(jié)、過度莖節(jié)和次生莖節(jié)表達量顯著性升高。這說明毛果楊GATA 家族基因可能參與楊樹莖的發(fā)育與鹽脅迫響應。

綜上所述，本研究對鑒定出的39 個PtrGATA家族基因進行了染色體定位、理化性質、結構特征、進化關系以及表達模式分析，為今后進一步研究該家族基因奠定了一定基礎。