趙楊靜 唐 楠 唐道城 張 靜

（青海大學(xué)高原花卉研究中心，青海省園林植物與觀賞園藝重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西寧 810016）

植物內(nèi)源激素是指在植物體內(nèi)合成的、通常從合成部位運(yùn)往作用部位對(duì)植物的生長發(fā)育起顯著調(diào)節(jié)作用的微量生理活性物質(zhì)［1～3］，主要包括生長素類、赤霉素類、細(xì)胞分裂素類、脫落酸和乙烯［4］。植物生長發(fā)育過程中，任何一種生理效應(yīng)都是各類激素相互作用的結(jié)果，其中激素在植物的成花及其他生長發(fā)育中都起著關(guān)鍵性作用［5］。

郁金香（Tulipa gesneriana L.）為百合科（Lilia?ceae）郁金香屬（Tulipa L.）多年生鱗莖類草本花卉，是世界上著名的觀賞植物之一，廣泛應(yīng)用于切花、盆栽和庭院種植［6］。郁金香是典型的夏休眠球根花卉，需要經(jīng)過一段時(shí)間的低溫處理才能打破休眠，促進(jìn)花莖發(fā)育和伸長［7～8］。王曉東等對(duì)郁金香生長發(fā)育和內(nèi)源激素含量進(jìn)行了研究，實(shí)驗(yàn)結(jié)果皆表明內(nèi)源激素對(duì)郁金香的花芽分化，生長發(fā)育起著重要的調(diào)節(jié)作用［9］。這種對(duì)環(huán)境的反應(yīng)及花莖發(fā)育與伸長基因的表達(dá)均受自身內(nèi)源激素的調(diào)控，所以鱗莖體內(nèi)內(nèi)源激素的分布規(guī)律和含量的準(zhǔn)確測(cè)定，對(duì)研究植物生理變化及栽培應(yīng)用都具有重要意義［10］。

目前，測(cè)定植物內(nèi)源激素的方法主要有高效液相色譜法（HPLC）［11］、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC-MS）［12］、氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（GC-MS）及免疫分析法（ELISA）等［13］。田如男、魏鈺等用ELISA法對(duì)郁金香球內(nèi)的內(nèi)源激素進(jìn)行了研究，試驗(yàn)得出該方法具有操作簡單、快速、敏感性高的特點(diǎn)，但重現(xiàn)性差、易交叉感染、不能同時(shí)分析多種激素，在精確定量測(cè)定方面存在不足［2，14～15］。GC-MS法廣泛應(yīng)用于有機(jī)物的現(xiàn)場(chǎng)分析檢測(cè)，定量分析精度高，定性能力高，但維護(hù)成本高，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，在實(shí)驗(yàn)室使用時(shí)要經(jīng)過專門培訓(xùn)的技術(shù)職員才能操縱質(zhì)譜儀［16］。HPLC-MS 法可以直接分析激素，具有分析速度快，定性分析結(jié)果可靠，但儀器的高成本阻礙了其更廣泛的應(yīng)用［14］。HPLC 法是除了乙烯以外，其他內(nèi)源激素均可測(cè)定的方法［17］。侯凱、李華、范光宇等均用HPLC 法測(cè)定川白芷、枇杷果實(shí)和谷子葉尖組織中的內(nèi)源激素的含量［18～20］，結(jié)果表明，該方法廣泛應(yīng)用于植物內(nèi)源激素的測(cè)定，具有簡單快捷，費(fèi)用低、重現(xiàn)性較好等優(yōu)點(diǎn)。

HPLC 法也應(yīng)用于百合科植物內(nèi)源激素的檢測(cè)［21］，但在測(cè)定郁金香鱗莖內(nèi)源激素含量和程序優(yōu)化這一方面研究報(bào)導(dǎo)較少。本研究以郁金香鱗莖為材料，通過對(duì)高效液相色譜條件和提純方法的選擇，篩選出能高效測(cè)定郁金香鱗莖內(nèi)GA3、IAA 和ABA 3 種內(nèi)源激素的方法。本方法靈敏度高、重現(xiàn)性好，能夠滿足郁金香鱗莖主要內(nèi)源激素的定量分析，為郁金香鱗莖激素變化規(guī)律的研究供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑與材料

高效液相色譜儀（Agilent 1260，配UV 檢測(cè)器）、C18 固相色譜柱（5 μm，4.6 mm×150 mm Agi?lent ZORBAX SB-C18）、氮吹儀（上海?？艱CY-12G）、冷凍離心機(jī)（SIGMA 3-30K）、冰箱（AUCMA BCD-239EG）、搖床培養(yǎng)箱（新苗全溫培養(yǎng)搖床QYC-200）、超純水制備系統(tǒng)（優(yōu)普超純水制造系統(tǒng)）、超低溫冰箱（Thermo scientific）、Eppendorf 移液器、萬分之一天平（上海良平FA1004）。

赤霉素（GA3，純度≥98.6%）、吲哚-3-乙酸（IAA，純度≥99.3%）、脫落酸（ABA，純度≥98.5%）標(biāo)準(zhǔn)品購自Sigma Aldrich，異丙醇（分析純）、鹽酸、二氯甲烷（分析純）、磷酸（分析純）、甲醇（色譜純）。

試驗(yàn)以青海大學(xué)高原花卉研究中心自繁的郁金香品種“Golden Apeldoorn”為材料，選取周徑8～10cm，基盤無損傷且無病蟲害的鱗莖。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18；流動(dòng)相：A（甲醇）∶B（磷酸緩沖液pH=3.5）=45∶55；流速1 mL·min-1；檢測(cè) 波長：0～3.2 min 265 nm，3.0～4.5 min 212 nm，4.5～6.5 min 218 nm，6.5～13.0 min 265 nm；自動(dòng)進(jìn)樣，進(jìn)樣量10 μL；柱溫20℃。

1.2.2標(biāo)樣制備

分別標(biāo)準(zhǔn)稱取1 000 μg GA3、IAA、ABA 標(biāo)準(zhǔn)品溶于80%甲醇中配制成1 000 μg·mL-1的溶液，最后稀釋成7 個(gè)濃度梯度，過0.45 μm 有機(jī)針孔濾膜，置于-80℃超低溫冰箱備用（見表1）。

1.2.3樣品前處理

取郁金香鱗莖，置于冰塊上迅速切碎混合，放入研缽，液氮中研磨成粉末。

異丙醇提取方法：稱后取0.5 g鱗莖粉末，加入5 mL 提取液A（超純水∶異丙醇∶鹽酸=1∶2∶0.002，V/V/V），4℃搖床100 r·min-1處理30 min，加入8 mL提取液B（二氯甲烷），4℃搖床100 r·min-1處理30 min；取出后4℃5 000 r·min-1離心15 min，此時(shí)溶液分層，粉末狀組織呈絮狀，位于兩層溶液之間；用巴氏滴管吸取下層溶液，氮?dú)獯蹈?，加?.0 mL 流動(dòng)相溶解；過0.45 μm 有機(jī)針孔濾膜，裝入樣品瓶中置于4℃冰箱待測(cè)。

表1 混合標(biāo)準(zhǔn)品的7個(gè)濃度梯度Table 1 Seven concentration gradients of mixed standards

80%甲醇提取方法：稱取鱗莖粉末1.0 g，加入10 mL 預(yù)冷80%甲醇，4℃冰箱過夜；4℃5 000 r·min-1離心15 min，取上清液，殘?jiān)? mL 80%甲醇清洗，離心合并上清液；氮?dú)庹舭l(fā)至原體積的1/3，調(diào)pH 至8.0，加入0.2 g PVPP，充分搖勻，冰箱放置30 min，離心，取上清液調(diào)pH至3.0，乙酸乙酯等體積混合萃取3次，合并3次萃取液，氮?dú)獯蹈桑? mL 流動(dòng)相溶解，過0.45 μm 有機(jī)針孔濾膜，裝入樣品瓶中置于4℃冰箱待測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 流動(dòng)相初選

設(shè)置7 個(gè)流動(dòng)相選擇，其他條件均一致（流速為1.0 mL·min-1，進(jìn)樣10 μL，檢測(cè)波長254 nm，柱溫20℃），進(jìn)行流動(dòng)相的選擇（見表2）。七個(gè)流動(dòng)相對(duì)混合標(biāo)準(zhǔn)品GA310 000 ng·mL-1，IAA 2 000 ng·mL-1，ABA 10 000 ng·mL-1進(jìn)行檢測(cè)，積分標(biāo)準(zhǔn)為斜率靈敏度0.05，峰寬0.02，最小峰面積0.05，分離度大于1.5為完全分開（見表3）。

測(cè)定過程中按各激素的保留時(shí)間為順序，分別 為GA3、IAA 和ABA。流 動(dòng) 相1 測(cè) 定 時(shí) 間 為30.041 min，測(cè)定時(shí)間過長；流動(dòng)相3、4、7的測(cè)定時(shí)間分別為4.534、4.326和4.733min，測(cè)定時(shí)間過短，若樣品中雜質(zhì)未去除干凈，可能會(huì)與GA3峰重疊，從而導(dǎo)致分離效果差；流動(dòng)相2、5、6檢測(cè)時(shí)間分別為10.349、17.377、8.824 min，檢測(cè)時(shí)間較適合，分離度和對(duì)稱因子較高，其中流動(dòng)相5峰寬較寬，專一性會(huì)降低，因此初步選取的流動(dòng)相為2、6（見圖1）。

表2 7個(gè)流動(dòng)相的配比Table 2 Ratio of seven mobile phases

2.2 波長選擇及流動(dòng)相改進(jìn)

由流動(dòng)相初選可知，254 nm波長下GA3和IAA峰面積小，不利于更低量的測(cè)定，所以需對(duì)測(cè)定波長進(jìn)行選擇。GA3的最大紫外吸收波長為210 nm［29］，ABA 最大吸收波長為265 nm［30］，通過對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品IAA 的不同波長測(cè)定（見表4），可得IAA 的最大吸收波長為218 nm。

由于甲醇的截止波長為210 nm，在210 和218 nm 噪聲較大色譜基線不穩(wěn)定，而在265 nm 處基線噪音更小，所以除測(cè)定激素時(shí)間外，其他時(shí)間選用265 nm，即切換波長時(shí)間設(shè)定為0～3 min 265 nm，3.0～3.5 min 212 nm，3.5～5.2 min 218 nm，5.2～12.0 min 265 nm。切換波長測(cè)定中，因?yàn)楸宜岬慕刂刮詹ㄩL為230 nm，流動(dòng)相2 在低波長210 nm 和218 nm 處基線不穩(wěn)定，所以用磷酸（截止波長210 nm）代替冰乙酸，調(diào)pH=3.5，分別用改良流動(dòng)相2 和流動(dòng)相6 切換波長對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測(cè)，二者均可得到良好的色譜信號(hào)，由于乙腈價(jià)格較甲醇高，本試驗(yàn)選擇改良流動(dòng)相2，以甲醇和磷酸緩沖液（pH=3.5）以45：55（V/V）作為流動(dòng)相。

表3 7個(gè)流動(dòng)相色譜參數(shù)Table 3 The chromatographic parameters of seven mobile phases

表4 HPLC法不同波長IAA色譜峰參數(shù)Table 4 Chromatographic parameters of IAA in differ‐ent wavelengths

2.3 柱溫和流速的選擇

柱溫設(shè)定為20℃、25℃、30℃、35℃，結(jié)果表明，柱溫對(duì)色譜分離影響不大，主要是影響保留時(shí)間和壓力，柱溫越高，保留時(shí)間越短，柱內(nèi)壓力越小，但考慮GA3分離時(shí)間不能提前，且高溫不利于激素保存，所以本試驗(yàn)選擇20℃為檢測(cè)柱溫。

流速設(shè)定0.8、1.0、1.2 mL·min-1，結(jié)果表明流速對(duì)各激素峰形影響不大，流速越大，分離時(shí)間越短，柱壓越大，綜合時(shí)間和柱壓考慮，流速選用1.0 mL·min-1。

2.4 內(nèi)源激素測(cè)定方法分析

2.4.1定性分析

利用以上優(yōu)化條件，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品混合樣GA310 000 ng·mL-1，IAA 2 000 ng·mL-1，ABA 10 000 ng·mL-1進(jìn)行測(cè)定，3 種植物激素保留時(shí)間依次為3.688 0±0.002 min、5.794±0.002 min、11.324±0.004 min（見圖2）。

2.4.2定量分析

將配制的7 個(gè)濃度梯度混合標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行HPLC 檢測(cè)。以峰面積為縱坐標(biāo)（y），含量為橫坐標(biāo)（x），得到各內(nèi)源激素的線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)（見表5）。

表5 3種內(nèi)源激素標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線Table 5 The standard curve of three endogenous hor‐mone standards

2.5 樣品處理方法的選擇

本試驗(yàn)用異丙醇［4］和80%甲醇［2，15，31］作為提取試劑。兩種方法均能提取檢測(cè)出3 種激素（見圖3），經(jīng)定量檢測(cè)80%甲醇提取方法測(cè)定激素含量分 別 為：GA3（103.549±3.690）ng·g-1FW，IAA（11.378±2.050）ng·g-1FW，ABA（136.451±4.880）ng·g-1FW；異丙醇提取劑提取方法測(cè)定激素含量分 別 為：GA3（1 140.232±23.686）ng·g-1FW，IAA（20.145±2.979）ng·g-1FW，ABA（117.733±19.395）ng·g-1FW。定量對(duì)比可得，80%甲醇作為提取劑進(jìn)行樣品提取GA3損失較多，綜上所述，選擇異丙醇提取方法作為郁金香鱗莖激素提取方法。

2.6 回收率測(cè)定

標(biāo)準(zhǔn)品母液精確取10 000 ng GA3，2 000 ng IAA，10 000 ng ABA 加入5 mL 異丙醇提取液試管中，按照樣品處理方法處理標(biāo)準(zhǔn)品，HPLC 進(jìn)行6次平行檢測(cè)，計(jì)算回收率。3種激素回收率分別為：GA389.190%，IAA 84.821%，ABA 95.679%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差依次為：6.432%，4.373%，2.831%（見表6）。

表6 3種內(nèi)源激素的回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 6 Recoveries and RSDs of three endogenous hor‐mones

3 討論

植物內(nèi)源激素的提取是定量檢測(cè)的第一步也是關(guān)鍵步驟，樣品的處理方法主要有液氮研磨［20］、冰浴研磨［32］、常溫研磨［33］3 種，本試驗(yàn)結(jié)合實(shí)驗(yàn)室條件，為了最大程度保持激素活性，最終采用液氮研磨樣品的方法。目前，植物激素的提取方法多采用溶劑提取法，常用溶劑有甲醇、丙酮、丙醇水溶液及其他中性酸性緩沖溶液［34～35］，因甲醇分子量小，植物激素提取中多采用甲醇作為提取劑［22～24］，但甲醇滲透性極強(qiáng)，選擇性低，易將植物細(xì)胞內(nèi)的多酚類物質(zhì)和植物內(nèi)源激素一并提取出來，故在測(cè)定植物內(nèi)源激素前需要通過一定的純化步驟，盡可能地將這些雜質(zhì)除去，這就導(dǎo)致后續(xù)工序復(fù)雜，工作量加大，提取率降低。郁金香鱗莖的多酚類物質(zhì)含量較高［36］，為簡化后續(xù)試驗(yàn)步驟，保證較高的提取效果，因此本研究選擇異丙醇溶液作為郁金香鱗莖內(nèi)源激素提取劑。

國內(nèi)有大量HPLC 法測(cè)定植物激素的方法報(bào)道，但因儀器、分離柱及溫度、氣壓等因素的差異，各實(shí)驗(yàn)室分離條件參數(shù)相差較大。本方法參考國內(nèi)常見植物內(nèi)源激素的樣品前處理方法和色譜測(cè)定參數(shù)，從樣品研磨方法、樣品激素提取劑的選擇，流動(dòng)相、流速、柱溫、吸收波長等方面進(jìn)行了優(yōu)化，最終篩選出一套適合實(shí)驗(yàn)室高效液相色譜儀同時(shí)測(cè)定郁金香鱗莖中3種植物內(nèi)源激素的方法。該方法以液氮研磨樣品，異丙醇為激素提取劑，Agilent1260 高效液相色譜儀為檢測(cè)儀器，色譜柱Agilent ZORBAX SB-C18；流動(dòng)相A（甲醇）∶B（磷酸緩沖液pH=3.5）=45∶55；流速1.0 mL·min-1；檢測(cè)波長0～3.2 min 265 nm，3.0～4.5 min 212 nm，4.5～6.5 min 218 nm，6.5～13.0 min 265 nm；自動(dòng)進(jìn)樣，進(jìn)樣量10.0 μL；柱溫20℃，且均在各激素最大吸收波長進(jìn)行定量測(cè)定，基線平穩(wěn)，準(zhǔn)確度高，可得到滿意的峰形，色譜圖規(guī)范整齊，試驗(yàn)前處理簡單，可操作性強(qiáng)，回收率和精密度較高，可滿足測(cè)定郁金香鱗莖GA3、IAA、ABA含量的要求。